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摘 要:陕北蝎资源丰富,但迄今关于该地区蝎子的毒液组分研究仍较为滞后。在Sephadex G50 柱层析分离体系基础上,利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电(SDS-PAGE)分析了蝎毒的蛋白组分。电泳分析显示,采用 10%浓度分离胶对分离粗毒较好,而采用15%浓度分离胶对Sephadex G50分离组分效果较好;蝎粗毒中的蛋白组分分子量较为接近,它们的分子量小于20.1KDa;G50 F1峰和G50 F2 峰蛋白分子量都小于6.5 KDa。本研究为陕北产蝎毒蛋白组分的分离纯化和生理生化研究奠定了良好的基础。
关键词:蝎毒 陕北 柱层析 电泳
中图分类号: Q81文献标识码:A 文章编号:1007-3973 (2010) 03-054-02
蝎是地球上最古老的动物之一,属节肢动物门(Arthorpoda), 蛛形纲(Archnida), 蝎目(Scorpionidae)。全世界约有蝎1000余种,我国分布有15种以上,其分布最广的是东亚钳蝎(Buthus martensi Karsch,BmK)。东亚钳蝎是传统的名贵中药材之一,早在宋代全蝎就用于治疗惊厥、小儿惊风、癫痫等疾病。在中医治疗上,镇痛、抗惊厥、免疫调节、抗肿瘤等方面的实践已取得了很好的效果。
我国蝎资源极为丰富,陕北产蝎经鉴定主要为东亚钳蝎。目前认为蝎毒是全蝎发挥药理作用的重要成分。由于蝎毒粗毒成分较为复杂,毒副作用明显,并且不同种属或者同种属不同来源及不同的取毒条件等因素所造成的多种差异,不能直接用于基础及临床研究,故国内外的研究大都是把蝎毒分离纯化后进行的。
本实验对陕北产蝎粗毒经SephadexG50分离纯化后的蛋白组分进行电泳分析,拟将为陕北产蝎毒及其蛋白组分的分离纯化和生理生化研究奠定良好的基础。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1主要材料与试剂
蝎粗毒(系电刺激法采集);Sephadex G50分离纯化后的蛋白组分;
标准分子量的蛋白质;凝胶贮液(30%Acr-0.8%Bis);分离胶缓冲液(3.0 mol/L pH8.9Tris-HCl 缓冲液); 浓缩胶缓冲液(0.5 mol/L pH6.7Tris-HCl 缓冲液);10% SDS;10%过硫酸铵;10% TEMED; pH8.3 Tris-Gly电极缓冲液;5X SDS-PAGE加样缓冲液;考马斯亮蓝染液;脱色液;7%醋酸;去离子水。
1.1.2实验仪器设备
微型凝胶电泳装置(Bio-Rad公司Mini-ProteanⅡ型电泳仪);YC-1型层析实验冷柜;高速低温离心机;干胶器;电热恒温水浴锅;Eppendorf管;微量注射器;摇床;大培养皿。
1.2实验方法
1.2.1组装凝胶模具
将洁净的长、短玻璃板垫好底部平齐置入制胶框中,并夹在灌胶架上。
1.2.2 配胶
1.2.3制备凝胶板
将混匀后的分离胶溶液,用吸管沿隔片加至长、短玻璃板间的窄缝内,加胶高度距短玻璃板顶端1.5cm。用1ml注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层3-4mm的水层,使凝胶表面变得平整。约30-60min,凝胶完全聚合,则可看到水与凝胶间有一个清晰的界面。
用滤纸吸尽覆盖在分离胶上的水,将混合均匀后的浓缩胶溶液,用吸管加至分离胶的上面,直至凝胶溶液达铅玻璃板的顶端,将梳子倾斜插入到凝胶内,直至梳子齿的底部与前玻璃板得顶端平齐,约30min凝胶聚合,小心拔出梳子,将凝胶放入电泳槽内,在内外电泳槽中加入电极缓冲液,使凝胶的上下段均能浸没在缓冲液中。
1.2.4样品的处理和加样
标准分子量蛋白质,取出适当的标准品加样品缓冲液稀释5倍,混匀,煮沸2-5min,取出冷却。将样品按10mg/ml加样品缓冲液在一个Eppendorf管中混合,盖上盖子,在100℃沸水浴中加热2-5min,离心(15,000 xg)15 min[6]。用微量注射器取蛋白Marker 5.0l、 粗毒 2.5l、 G50 F1峰 5.0l、 G50 F2峰 5.0l 缓慢加至样品孔的底部。
1.2.5电泳
将电极插头与适当的电极相接,置入冷柜中。将电压调至200V,电流为10mA,待样品进入分离胶后,将电压调至300V,电流调至30mA,当溴酚蓝染料的前沿迁移至距凝胶的底部 1cm 时,停止电泳。
从电泳槽中取出凝胶玻璃板,轻轻撬开玻璃板,凝胶便会贴在其中的一块上,除去浓缩胶,用去离子水清洗凝胶,去除胶上的电极缓冲液。
1.2.6染色和脱色
戴上手套将凝胶移入一个盛有少量考马斯亮蓝的大培养皿中,盖上盖子,在摇床上慢震荡染色(频率:40-60Hz,时间:2-3h),弃去染液,将凝胶在水中漂洗数次,加入脱色液,过夜脱色。
1.2.7干胶与保存胶
将凝胶置干净表面上,用一张滤纸覆盖凝胶,将滤纸连同凝胶一起揭下来,凝胶会粘在滤纸上,用玻璃纸盖在凝胶表面,不要气泡裹进去。将滤纸与凝胶置于干胶器,开启加热和抽真空开关,并盖上带有密封圈的盖子。
此外,也可用 7% 醋酸保存胶板。
2结果与分析
陕北产蝎毒经电泳分析,采用 10%浓度分离胶对分离粗毒较好,而采用15%浓度的分离胶对Sephadex G50分离组分效果较好,见图4(电泳时间:108 min)和图5(电泳时间:79 min);蝎粗毒中的蛋白组分分子量较为接近,且它们的分子量小于20.1KDa; G50 F1峰和G50 F2 峰组蛋白分子量小于6.5KDa 。
3讨论
山东、辽宁和河北产蝎毒电泳分析,采用 10%浓度的分离胶分辨率较15%浓度分离胶的高。而陕北产蝎毒经电泳分析,采用 10%浓度分离胶对分离粗毒较好,采用15%浓度的分离胶对Sephadex G50分离组分效果较好,由此可见,不同地区蝎毒蛋白的种类和数量上存在着一定的差异。10%浓度和15%浓度分离胶电泳条带都显示,粗毒的条带比较宽,说明陕北产蝎粗毒中的蛋白组分分子量较为接近,且分子量小于20.1KDa; G50 F1峰和G50 F2 峰组蛋白的主条带出现在标准条带6.5KDa之下,说明它们的分子量都小于6.5KDa。10%浓度的分离胶出现了不规则的迁移条带,多是因为电流不稳定。因此,要确保内外电泳槽中的电泳液与凝胶保持良好的接触。其他可能的原因包括:加样孔中加入的样品太多;样品中盐浓度太高;边缘效应。两个浓度的分离胶出现了出现拖尾现象,主要是样品浓度大或分离胶浓度过大引起的。可通过对样品浓度稀释、加样前离心、时间过长,重新配制电泳缓冲液等方法得以改善。
4结论
(1)陕北产蝎毒SDS-PAGE系统组建分析,采用 10%浓度分离胶对分离粗毒较好,而采用 15%浓度的分离胶对Sephadex G50分离组分效果较好。
(2)陕北产蝎粗毒中的蛋白组分分子量较为接近,且它们的分子量小于20.1KDa ;G50 F1峰和G50 F2峰组蛋白分子量都小于6.5KDa 。
参考文献:
[1]陈宗礼, 刘长海. 经济动物养殖学[M] . 北京: 中国农业出版社, 2002, 130.
[2]Brone B, Tytgat J, van Kerkhove E. Characterization of Na(+) currents in isolated dorsal unpaired median neurons of Locusta migratoria and effect of the alpha-like scorpion toxin BmK M1 [J]. J Insect Physiol, 2003, 49(2):171-182.
[3]Wickramaratna JC, Fry BG, Loiacono RE. Isolation and characterization at cholinergic nicotinic receptors of a neurotoxin from the venom of the Acanthophis sp[J]. Biochem Pharmacol, 2004, 68(2):383-394.
[4]陈景枝. 东亚钳蝎蝎毒纯化组分对Lewis肺癌瘤源小鼠体内肿瘤的影响[D] . 广州医学院蛇毒研究所, 2005, 10-15.
[5]汪家政, 范 明. 蛋白质技术手册[M] . 北京: 科学出版社, 2000, 212-230.
[6]张景海, 王起振, 周新华. 我国不同地区东亚钳蝎毒在三种类型电泳中的比较研究[J] . 天然产物研究与开发, 1995, 7(2) : 38-43.
关键词:蝎毒 陕北 柱层析 电泳
中图分类号: Q81文献标识码:A 文章编号:1007-3973 (2010) 03-054-02
蝎是地球上最古老的动物之一,属节肢动物门(Arthorpoda), 蛛形纲(Archnida), 蝎目(Scorpionidae)。全世界约有蝎1000余种,我国分布有15种以上,其分布最广的是东亚钳蝎(Buthus martensi Karsch,BmK)。东亚钳蝎是传统的名贵中药材之一,早在宋代全蝎就用于治疗惊厥、小儿惊风、癫痫等疾病。在中医治疗上,镇痛、抗惊厥、免疫调节、抗肿瘤等方面的实践已取得了很好的效果。
我国蝎资源极为丰富,陕北产蝎经鉴定主要为东亚钳蝎。目前认为蝎毒是全蝎发挥药理作用的重要成分。由于蝎毒粗毒成分较为复杂,毒副作用明显,并且不同种属或者同种属不同来源及不同的取毒条件等因素所造成的多种差异,不能直接用于基础及临床研究,故国内外的研究大都是把蝎毒分离纯化后进行的。
本实验对陕北产蝎粗毒经SephadexG50分离纯化后的蛋白组分进行电泳分析,拟将为陕北产蝎毒及其蛋白组分的分离纯化和生理生化研究奠定良好的基础。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1主要材料与试剂
蝎粗毒(系电刺激法采集);Sephadex G50分离纯化后的蛋白组分;
标准分子量的蛋白质;凝胶贮液(30%Acr-0.8%Bis);分离胶缓冲液(3.0 mol/L pH8.9Tris-HCl 缓冲液); 浓缩胶缓冲液(0.5 mol/L pH6.7Tris-HCl 缓冲液);10% SDS;10%过硫酸铵;10% TEMED; pH8.3 Tris-Gly电极缓冲液;5X SDS-PAGE加样缓冲液;考马斯亮蓝染液;脱色液;7%醋酸;去离子水。
1.1.2实验仪器设备
微型凝胶电泳装置(Bio-Rad公司Mini-ProteanⅡ型电泳仪);YC-1型层析实验冷柜;高速低温离心机;干胶器;电热恒温水浴锅;Eppendorf管;微量注射器;摇床;大培养皿。
1.2实验方法
1.2.1组装凝胶模具
将洁净的长、短玻璃板垫好底部平齐置入制胶框中,并夹在灌胶架上。
1.2.2 配胶
1.2.3制备凝胶板
将混匀后的分离胶溶液,用吸管沿隔片加至长、短玻璃板间的窄缝内,加胶高度距短玻璃板顶端1.5cm。用1ml注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层3-4mm的水层,使凝胶表面变得平整。约30-60min,凝胶完全聚合,则可看到水与凝胶间有一个清晰的界面。
用滤纸吸尽覆盖在分离胶上的水,将混合均匀后的浓缩胶溶液,用吸管加至分离胶的上面,直至凝胶溶液达铅玻璃板的顶端,将梳子倾斜插入到凝胶内,直至梳子齿的底部与前玻璃板得顶端平齐,约30min凝胶聚合,小心拔出梳子,将凝胶放入电泳槽内,在内外电泳槽中加入电极缓冲液,使凝胶的上下段均能浸没在缓冲液中。
1.2.4样品的处理和加样
标准分子量蛋白质,取出适当的标准品加样品缓冲液稀释5倍,混匀,煮沸2-5min,取出冷却。将样品按10mg/ml加样品缓冲液在一个Eppendorf管中混合,盖上盖子,在100℃沸水浴中加热2-5min,离心(15,000 xg)15 min[6]。用微量注射器取蛋白Marker 5.0l、 粗毒 2.5l、 G50 F1峰 5.0l、 G50 F2峰 5.0l 缓慢加至样品孔的底部。
1.2.5电泳
将电极插头与适当的电极相接,置入冷柜中。将电压调至200V,电流为10mA,待样品进入分离胶后,将电压调至300V,电流调至30mA,当溴酚蓝染料的前沿迁移至距凝胶的底部 1cm 时,停止电泳。
从电泳槽中取出凝胶玻璃板,轻轻撬开玻璃板,凝胶便会贴在其中的一块上,除去浓缩胶,用去离子水清洗凝胶,去除胶上的电极缓冲液。
1.2.6染色和脱色
戴上手套将凝胶移入一个盛有少量考马斯亮蓝的大培养皿中,盖上盖子,在摇床上慢震荡染色(频率:40-60Hz,时间:2-3h),弃去染液,将凝胶在水中漂洗数次,加入脱色液,过夜脱色。
1.2.7干胶与保存胶
将凝胶置干净表面上,用一张滤纸覆盖凝胶,将滤纸连同凝胶一起揭下来,凝胶会粘在滤纸上,用玻璃纸盖在凝胶表面,不要气泡裹进去。将滤纸与凝胶置于干胶器,开启加热和抽真空开关,并盖上带有密封圈的盖子。
此外,也可用 7% 醋酸保存胶板。
2结果与分析
陕北产蝎毒经电泳分析,采用 10%浓度分离胶对分离粗毒较好,而采用15%浓度的分离胶对Sephadex G50分离组分效果较好,见图4(电泳时间:108 min)和图5(电泳时间:79 min);蝎粗毒中的蛋白组分分子量较为接近,且它们的分子量小于20.1KDa; G50 F1峰和G50 F2 峰组蛋白分子量小于6.5KDa 。
3讨论
山东、辽宁和河北产蝎毒电泳分析,采用 10%浓度的分离胶分辨率较15%浓度分离胶的高。而陕北产蝎毒经电泳分析,采用 10%浓度分离胶对分离粗毒较好,采用15%浓度的分离胶对Sephadex G50分离组分效果较好,由此可见,不同地区蝎毒蛋白的种类和数量上存在着一定的差异。10%浓度和15%浓度分离胶电泳条带都显示,粗毒的条带比较宽,说明陕北产蝎粗毒中的蛋白组分分子量较为接近,且分子量小于20.1KDa; G50 F1峰和G50 F2 峰组蛋白的主条带出现在标准条带6.5KDa之下,说明它们的分子量都小于6.5KDa。10%浓度的分离胶出现了不规则的迁移条带,多是因为电流不稳定。因此,要确保内外电泳槽中的电泳液与凝胶保持良好的接触。其他可能的原因包括:加样孔中加入的样品太多;样品中盐浓度太高;边缘效应。两个浓度的分离胶出现了出现拖尾现象,主要是样品浓度大或分离胶浓度过大引起的。可通过对样品浓度稀释、加样前离心、时间过长,重新配制电泳缓冲液等方法得以改善。
4结论
(1)陕北产蝎毒SDS-PAGE系统组建分析,采用 10%浓度分离胶对分离粗毒较好,而采用 15%浓度的分离胶对Sephadex G50分离组分效果较好。
(2)陕北产蝎粗毒中的蛋白组分分子量较为接近,且它们的分子量小于20.1KDa ;G50 F1峰和G50 F2峰组蛋白分子量都小于6.5KDa 。
参考文献:
[1]陈宗礼, 刘长海. 经济动物养殖学[M] . 北京: 中国农业出版社, 2002, 130.
[2]Brone B, Tytgat J, van Kerkhove E. Characterization of Na(+) currents in isolated dorsal unpaired median neurons of Locusta migratoria and effect of the alpha-like scorpion toxin BmK M1 [J]. J Insect Physiol, 2003, 49(2):171-182.
[3]Wickramaratna JC, Fry BG, Loiacono RE. Isolation and characterization at cholinergic nicotinic receptors of a neurotoxin from the venom of the Acanthophis sp[J]. Biochem Pharmacol, 2004, 68(2):383-394.
[4]陈景枝. 东亚钳蝎蝎毒纯化组分对Lewis肺癌瘤源小鼠体内肿瘤的影响[D] . 广州医学院蛇毒研究所, 2005, 10-15.
[5]汪家政, 范 明. 蛋白质技术手册[M] . 北京: 科学出版社, 2000, 212-230.
[6]张景海, 王起振, 周新华. 我国不同地区东亚钳蝎毒在三种类型电泳中的比较研究[J] . 天然产物研究与开发, 1995, 7(2) : 38-43.