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摘要 [目的]探讨矿化基因、贝壳和珍珠经济性状之间的相关关系。[方法]选择47个培育优质珍珠的马氏珠母贝，测量贝壳的壳宽、壳高、壳长、绞合线长、总壳重、左壳重、珠层厚度及珍珠的直径、重量、珠层厚度，并分析矿化基因msi60在外套膜内缘组织的相对表达量，珍珠经济性状和贝壳经济性状之间的相关关系。[结果]珍珠的珠层厚度、珍珠直径和珍珠重量3个经济性状均与受体贝贝壳的壳宽、壳长、总壳重和左壳重呈显著相关，推测育珠贝的生长状况在一定程度上影响珍珠的培育；msi60在外套膜内缘的相对表达量与珍珠重量之间存在相关性（P = 0.059），贝壳和珍珠的珍珠层厚度存在显著相关性（P = 0.019），推测在马氏珠母贝中，贝壳的矿化和珍珠的矿化可能具有共同的上游调控元件。[结论]msi60在形成贝壳珍珠质层的外套膜内缘组织中的基因表达量与珍珠的经济性状相关。该研究为马氏珠母贝生物矿化分子机制的研究提供基础资料。
关键词 贝壳；珍珠；经济性状；壳基质蛋白；马氏珠母贝
中图分类号 S968.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）23-084-03
马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）是培育海水珍珠的主要珍珠母贝，其贝壳具有珍珠质层，可用于制作贝雕、珍珠粉，亦可作为珍珠的代用品供药用和化妆品的制造[1]。目前，我国海水珍珠产业已成为广东、广西和海南部分地区重要的支柱性产业[2]，因此，对于马氏珠母贝的遗传育种和海水珍珠矿化过程的研究一直是热点问题。
马氏珠母贝的贝壳由珍珠层和棱柱层组成，珍珠质层是由外套膜内缘的上皮细胞分泌的[3-5]，贝壳和珍珠的珍珠层组成成分完全相同。贝类贝壳的绝大部分由CaCO3晶体构成，仅不到5%的组成成分是有机基质，包括蛋白质和多糖。蛋白质是由贝类的外套膜组织分泌的，负责调控贝壳的形成[6]，mis60是参与贝壳珍珠质层形成的蛋白之一，不溶于水，在形成贝壳珍珠质层的外套膜内缘组织中表达[3，5]。
马氏珠母贝的研究主要包括遗传育种[7-8]、插核育珠[9-11]、珍珠形成的分子机制研究[12-14]，但很少将育珠贝的生长性状、珍珠的经济性状和矿化基因表达量进行综合分析，探讨育珠贝对珍珠形成的影响。笔者分析了msi60基因在马氏珠母贝外套膜内缘组织的基因表达量，贝壳经济性状和珍珠经济性状之间的相关性，旨在为贝类生物矿化分子机制的研究提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 样品和数据收集
马氏珠母贝于2012年11月采自海南省陵水市马氏珠母贝养殖场，从506个育珠贝中选取培育优质珍珠的马氏珠母贝47个，将其外套膜内缘组织放入RNAstore样本保存液（天根生化科技有限公司，北京）中保存，后立即放入-80 ℃冰箱中存放。测量47个马氏珠母贝贝壳的壳宽、壳高、壳长、绞合线长、总壳重、左壳重、珠层厚度以及所产珍珠的直径、重量和珍珠质层厚度。贝壳和珍珠的珍珠层厚度采用光学相干断层扫描仪OSLF-1500（斯尔顿科技有限公司，深圳）测量。
1.2 RNA提取和cDNA合成
外套膜内缘组织的RNA提取采用TRNzolA+ 总RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京），操作步骤按说明书进行。cDNA合成采用Quant cDNA第一链合成试剂盒（天根生化科技有限公司，北京），合成的cDNA稀释6倍后保存于-20 ℃用于荧光定量PCR扩增。
1.3 荧光定量PCR扩增
参考基因使用β-actin，其正向引物序列actin-F为GGTCACTCACACCGTGCCTAT，反向引物序列actin-R为GTGATGTCTCTTCCGGCTAGGT[15]。mis60基因荧光定量PCR的正向引物msi60-F为AGGTGGACGAAGAGGTAGAGGTAG，反向引物msi60-R为AGCGGCAGCGGCAACATC[16]。荧光定量PCR扩增使用SuperReal PreMix （SYBR Green） （天根生化科技有限公司，北京）。荧光定量PCR反应体系：1 μL cDNA，10 μL 2×SuperReal PreMix （添加SYBR Green染料），0.4 μmol/L 的正反向引物，PCR总体积为20 μL。荧光定量PCR程序：95 ℃变性15 min；95 ℃变性15 s，60 ℃ 运行 30 s，共40个循环。每个样品的荧光定量PCR反应重复3次，取平均值作为基因表达量的最终结果。采用溶解曲线法（60～95 ℃）检测是否存在非特异性扩增。
1.4 数据分析
计算贝壳和珍珠各个经济性状的平均值、标准差、最大值和最小值；基因表达量的结果分析采用ΔΔCT法[17]； 采用SPSS 15.0软件（SPSS，Chicago，USA）估算msi60在外套膜内缘组织的基因表达量与珍珠和贝壳经济性状之间的相关性。
2 结果与分析
2.1 贝壳和珍珠的经济性状
47个马氏珠母贝的贝壳和珍珠经济性状的平均值、标准差、最小值和最大值见表1。由表1可知，珍珠的珠层厚度（0.32 mm）比贝壳的珠层厚度（0.94 mm）薄；msi60在外套膜内缘组织的相对表达量在不同马氏珠母贝个体中的差异较大（标准差 = 4.22）。
2.2 相关性分析
msi60在外套膜内缘组织的基因表达量与珍珠、贝壳经济性状之间的相关性分析结果见表2。由表2可知，珍珠的珠层厚度、珍珠直径和珍珠重量3个经济性状均与育珠贝贝壳的壳宽、壳长、总壳重和左壳重具有显著相关性。虽然表1中贝壳的珍珠质层厚度比珍珠厚，但从表2可以看出，贝壳和珍珠的珠层厚度存在显著相关性（P=0.019）。msi60在外套膜内缘组织的相对表达量与珍珠重量存在相关性（P = 0.059）。 3 讨论
3.1 贝壳与珍珠经济性状之间的相关性分析
影响贝壳和海水珍珠价值的品质除色泽、大小等性状外，还有一个比较特殊的性状即珠层厚度[18]，在养殖珍珠分级国家标准中明确规定了海水养殖珍珠珠层厚度的分级标准（GB/T 18781—2008）。珠层厚度越厚，珍珠的经济价值越高，但珍珠生长在珍珠囊中，在不伤害育珠贝的前提下，很难检测到珍珠的珠层厚度。该研究发现，珍珠的珠层厚度与贝壳的壳宽和壳长等性状呈显著相关性，这为根据壳宽和壳长等性状推测珍珠的珠层厚度提供了可能。
Wada等[19]研究发现，育珠贝的贝壳重量与所产珍珠的重量呈正相关性，该研究也得到类似的结果。珍珠的珠层厚度、珍珠直径和珍珠重量3个珍珠的经济性状均与育珠贝贝壳的壳宽、壳长、总壳重和左壳重具有显著相关性，说明马氏珠母贝育珠贝的生长速度越快，个体越大，贝壳越隆起，培育大型珍珠的可能性越高，推测育珠贝的生长状况在一定程度上影响珍珠的培育，在实践中可以将贝壳的壳宽、壳长等经济性状作为育珠贝选择育种的重要指标。
3.2 msi60相对表达量与经济性状之间的相关性
该研究发现，贝壳和珍珠的珍珠层厚度存在显著相关性（P=0.019），虽然珍珠和贝壳具有相同组成成分的珍珠质层，但贝壳的矿化过程对于育珠贝而言是一个必需的生长过程，而珍珠的形成对于育珠贝而言是一个排斥异物的免疫过程[18]，由于形成珍珠的珍珠囊是来源于小片贝的组织，其遗传物质与育珠贝不同，msi60基因在珍珠囊的表达和在外套膜内缘的表达并不完全相同。另外，生物矿化受多基因调控且易受环境因素的影响，因此，该研究仅发现msi60在外套膜内缘的相对表达量与珍珠重量（P = 0.059）存在相关性。
该研究通过探讨马氏珠母贝珍珠、贝壳经济性状和msi60在外套膜内缘组织基因表达量之间的相关性，初步探讨了生物矿化过程在珍珠形成和贝壳的珍珠质层形成过程中的异同，为阐明生物矿化分子机制研究提供资料。
参考文献
[1]曹占旺，王大鹏，甘西.马氏珠母贝及海水珍珠的研究进展[J].广西农业科学，2009，40 （12）：1618-1622.
[2]童银洪，邓陈茂，陈敬中.中国珍珠业的历史、现状和发展[J].中国宝玉石，2005，57（3）：27-29.
[3]SUDO S，FUJIKAWA T，NAGAKURA T，et al.Structure of mollusk shell framework proteins[J].Nature，1997，387：563-564.
[4]WADA K.Science of the pearl oyster[M].Tokyo：Shinju Shinbunsha，1999.
[5]TAKEUCHI T，ENDO K.Biphasic and dually coordinated expression of the genes encoding major shell matrix proteins in the pearl oyster Pinctada fucata[J].Marine biotechnology，2006，8：52-61.
[6]ZHANG C，ZHANG R Q.Matrix proteins in the outer shells of mollusks[J].Marine biotechnology，2006，8：572-586.
[7]王爱民，阎冰，叶力，等.马氏珠母贝不同地理种群内自繁和种群间杂交子一代主要性状的比较[J].水产学报，2003，27（3）：200-206.
[8]王爱民，石耀华，顾志峰，等.马氏珠母贝遗传育种与养殖新技术[C]//国际海洋论坛.中国湛江，2005：16-22.
[9]熊大仁.珍珠的质量和影响珍珠质量的因素[J].水产与教育，1975（1）：56-61.
[10]龚源海.聚乙烯吡咯烷酮（PVP）处理小片加速珍珠形成研究的统计分析[J].水产与教育，1975 （2）：60-70.
[11]符韶，邓陈茂，黄海立，等.马氏珠母贝养殖与育珠笼具的改进[J].海洋科学，2001，25（3）：23-24.
[12]INOUE N，ISHIBASHI R，ISHIIKAWA T，et al.Gene expression patterns and pearl formation in the Japanese pearl oyster （Pinctada fucata）：A comparison of gene expression patterns between the pearl sac and mantle tissues[J].Aquaculture，2010，308：68-74.
[13]MCGINTY E，ZENGER K R，TAYLOR J U，et al.Diagnostic genetic markers unravel the interplay between host and donor oyster contribution in cultured pearl formation[J].Aquaculture，2011，316：20-24.
[14]SHI Y H，YU C C，GU Z F，et al.Characterization of the pearl oyster （Pinctada martensii） mantle transcriptome unravels biomineralization genes[J].Marine biotechnology，2013，15（2）：175-187.
[15]MIYAZAKI Y，NISHIDA T，AOKI H，et al.Expression of genes responsible for biomineralization of Pinctada fucata during development[J].Comp Biochem Physiol B，2010，155：241-248.
[16]WANG N，KINOSHITA S，RIHO C，et al.Quantitative expression analysis of nacreous shell matrix protein genes in the process of pearl biogenesis[J].Comp Biochem Physiol B，2009，154：346-350.
[17]LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CT method[J].Methods，2001，25（4）：402-408.
[18]蒙钊美，李有宁，邢孔武.珍珠养殖理论与技术[M].北京：科学出版社，1995.
[19]WADA K，KOMARU A.Color and weight of pearls produced by grafting the mantle tissues from a selected population for white shell color of the Japanese pearl oyster Pinctada fucata martensii （Dunker）[J].Aquaculture，1996，142：25-32.
关键词 贝壳；珍珠；经济性状；壳基质蛋白；马氏珠母贝
中图分类号 S968.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）23-084-03
马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）是培育海水珍珠的主要珍珠母贝，其贝壳具有珍珠质层，可用于制作贝雕、珍珠粉，亦可作为珍珠的代用品供药用和化妆品的制造[1]。目前，我国海水珍珠产业已成为广东、广西和海南部分地区重要的支柱性产业[2]，因此，对于马氏珠母贝的遗传育种和海水珍珠矿化过程的研究一直是热点问题。
马氏珠母贝的贝壳由珍珠层和棱柱层组成，珍珠质层是由外套膜内缘的上皮细胞分泌的[3-5]，贝壳和珍珠的珍珠层组成成分完全相同。贝类贝壳的绝大部分由CaCO3晶体构成，仅不到5%的组成成分是有机基质，包括蛋白质和多糖。蛋白质是由贝类的外套膜组织分泌的，负责调控贝壳的形成[6]，mis60是参与贝壳珍珠质层形成的蛋白之一，不溶于水，在形成贝壳珍珠质层的外套膜内缘组织中表达[3，5]。
马氏珠母贝的研究主要包括遗传育种[7-8]、插核育珠[9-11]、珍珠形成的分子机制研究[12-14]，但很少将育珠贝的生长性状、珍珠的经济性状和矿化基因表达量进行综合分析，探讨育珠贝对珍珠形成的影响。笔者分析了msi60基因在马氏珠母贝外套膜内缘组织的基因表达量，贝壳经济性状和珍珠经济性状之间的相关性，旨在为贝类生物矿化分子机制的研究提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 样品和数据收集
马氏珠母贝于2012年11月采自海南省陵水市马氏珠母贝养殖场，从506个育珠贝中选取培育优质珍珠的马氏珠母贝47个，将其外套膜内缘组织放入RNAstore样本保存液（天根生化科技有限公司，北京）中保存，后立即放入-80 ℃冰箱中存放。测量47个马氏珠母贝贝壳的壳宽、壳高、壳长、绞合线长、总壳重、左壳重、珠层厚度以及所产珍珠的直径、重量和珍珠质层厚度。贝壳和珍珠的珍珠层厚度采用光学相干断层扫描仪OSLF-1500（斯尔顿科技有限公司，深圳）测量。
1.2 RNA提取和cDNA合成
外套膜内缘组织的RNA提取采用TRNzolA+ 总RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京），操作步骤按说明书进行。cDNA合成采用Quant cDNA第一链合成试剂盒（天根生化科技有限公司，北京），合成的cDNA稀释6倍后保存于-20 ℃用于荧光定量PCR扩增。
1.3 荧光定量PCR扩增
参考基因使用β-actin，其正向引物序列actin-F为GGTCACTCACACCGTGCCTAT，反向引物序列actin-R为GTGATGTCTCTTCCGGCTAGGT[15]。mis60基因荧光定量PCR的正向引物msi60-F为AGGTGGACGAAGAGGTAGAGGTAG，反向引物msi60-R为AGCGGCAGCGGCAACATC[16]。荧光定量PCR扩增使用SuperReal PreMix （SYBR Green） （天根生化科技有限公司，北京）。荧光定量PCR反应体系：1 μL cDNA，10 μL 2×SuperReal PreMix （添加SYBR Green染料），0.4 μmol/L 的正反向引物，PCR总体积为20 μL。荧光定量PCR程序：95 ℃变性15 min；95 ℃变性15 s，60 ℃ 运行 30 s，共40个循环。每个样品的荧光定量PCR反应重复3次，取平均值作为基因表达量的最终结果。采用溶解曲线法（60～95 ℃）检测是否存在非特异性扩增。
1.4 数据分析
计算贝壳和珍珠各个经济性状的平均值、标准差、最大值和最小值；基因表达量的结果分析采用ΔΔCT法[17]； 采用SPSS 15.0软件（SPSS，Chicago，USA）估算msi60在外套膜内缘组织的基因表达量与珍珠和贝壳经济性状之间的相关性。
2 结果与分析
2.1 贝壳和珍珠的经济性状
47个马氏珠母贝的贝壳和珍珠经济性状的平均值、标准差、最小值和最大值见表1。由表1可知，珍珠的珠层厚度（0.32 mm）比贝壳的珠层厚度（0.94 mm）薄；msi60在外套膜内缘组织的相对表达量在不同马氏珠母贝个体中的差异较大（标准差 = 4.22）。
2.2 相关性分析
msi60在外套膜内缘组织的基因表达量与珍珠、贝壳经济性状之间的相关性分析结果见表2。由表2可知，珍珠的珠层厚度、珍珠直径和珍珠重量3个经济性状均与育珠贝贝壳的壳宽、壳长、总壳重和左壳重具有显著相关性。虽然表1中贝壳的珍珠质层厚度比珍珠厚，但从表2可以看出，贝壳和珍珠的珠层厚度存在显著相关性（P=0.019）。msi60在外套膜内缘组织的相对表达量与珍珠重量存在相关性（P = 0.059）。 3 讨论
3.1 贝壳与珍珠经济性状之间的相关性分析
影响贝壳和海水珍珠价值的品质除色泽、大小等性状外，还有一个比较特殊的性状即珠层厚度[18]，在养殖珍珠分级国家标准中明确规定了海水养殖珍珠珠层厚度的分级标准（GB/T 18781—2008）。珠层厚度越厚，珍珠的经济价值越高，但珍珠生长在珍珠囊中，在不伤害育珠贝的前提下，很难检测到珍珠的珠层厚度。该研究发现，珍珠的珠层厚度与贝壳的壳宽和壳长等性状呈显著相关性，这为根据壳宽和壳长等性状推测珍珠的珠层厚度提供了可能。
Wada等[19]研究发现，育珠贝的贝壳重量与所产珍珠的重量呈正相关性，该研究也得到类似的结果。珍珠的珠层厚度、珍珠直径和珍珠重量3个珍珠的经济性状均与育珠贝贝壳的壳宽、壳长、总壳重和左壳重具有显著相关性，说明马氏珠母贝育珠贝的生长速度越快，个体越大，贝壳越隆起，培育大型珍珠的可能性越高，推测育珠贝的生长状况在一定程度上影响珍珠的培育，在实践中可以将贝壳的壳宽、壳长等经济性状作为育珠贝选择育种的重要指标。
3.2 msi60相对表达量与经济性状之间的相关性
该研究发现，贝壳和珍珠的珍珠层厚度存在显著相关性（P=0.019），虽然珍珠和贝壳具有相同组成成分的珍珠质层，但贝壳的矿化过程对于育珠贝而言是一个必需的生长过程，而珍珠的形成对于育珠贝而言是一个排斥异物的免疫过程[18]，由于形成珍珠的珍珠囊是来源于小片贝的组织，其遗传物质与育珠贝不同，msi60基因在珍珠囊的表达和在外套膜内缘的表达并不完全相同。另外，生物矿化受多基因调控且易受环境因素的影响，因此，该研究仅发现msi60在外套膜内缘的相对表达量与珍珠重量（P = 0.059）存在相关性。
该研究通过探讨马氏珠母贝珍珠、贝壳经济性状和msi60在外套膜内缘组织基因表达量之间的相关性，初步探讨了生物矿化过程在珍珠形成和贝壳的珍珠质层形成过程中的异同，为阐明生物矿化分子机制研究提供资料。
参考文献
[1]曹占旺，王大鹏，甘西.马氏珠母贝及海水珍珠的研究进展[J].广西农业科学，2009，40 （12）：1618-1622.
[2]童银洪，邓陈茂，陈敬中.中国珍珠业的历史、现状和发展[J].中国宝玉石，2005，57（3）：27-29.
[3]SUDO S，FUJIKAWA T，NAGAKURA T，et al.Structure of mollusk shell framework proteins[J].Nature，1997，387：563-564.
[4]WADA K.Science of the pearl oyster[M].Tokyo：Shinju Shinbunsha，1999.
[5]TAKEUCHI T，ENDO K.Biphasic and dually coordinated expression of the genes encoding major shell matrix proteins in the pearl oyster Pinctada fucata[J].Marine biotechnology，2006，8：52-61.
[6]ZHANG C，ZHANG R Q.Matrix proteins in the outer shells of mollusks[J].Marine biotechnology，2006，8：572-586.
[7]王爱民，阎冰，叶力，等.马氏珠母贝不同地理种群内自繁和种群间杂交子一代主要性状的比较[J].水产学报，2003，27（3）：200-206.
[8]王爱民，石耀华，顾志峰，等.马氏珠母贝遗传育种与养殖新技术[C]//国际海洋论坛.中国湛江，2005：16-22.
[9]熊大仁.珍珠的质量和影响珍珠质量的因素[J].水产与教育，1975（1）：56-61.
[10]龚源海.聚乙烯吡咯烷酮（PVP）处理小片加速珍珠形成研究的统计分析[J].水产与教育，1975 （2）：60-70.
[11]符韶，邓陈茂，黄海立，等.马氏珠母贝养殖与育珠笼具的改进[J].海洋科学，2001，25（3）：23-24.
[12]INOUE N，ISHIBASHI R，ISHIIKAWA T，et al.Gene expression patterns and pearl formation in the Japanese pearl oyster （Pinctada fucata）：A comparison of gene expression patterns between the pearl sac and mantle tissues[J].Aquaculture，2010，308：68-74.
[13]MCGINTY E，ZENGER K R，TAYLOR J U，et al.Diagnostic genetic markers unravel the interplay between host and donor oyster contribution in cultured pearl formation[J].Aquaculture，2011，316：20-24.
[14]SHI Y H，YU C C，GU Z F，et al.Characterization of the pearl oyster （Pinctada martensii） mantle transcriptome unravels biomineralization genes[J].Marine biotechnology，2013，15（2）：175-187.
[15]MIYAZAKI Y，NISHIDA T，AOKI H，et al.Expression of genes responsible for biomineralization of Pinctada fucata during development[J].Comp Biochem Physiol B，2010，155：241-248.
[16]WANG N，KINOSHITA S，RIHO C，et al.Quantitative expression analysis of nacreous shell matrix protein genes in the process of pearl biogenesis[J].Comp Biochem Physiol B，2009，154：346-350.
[17]LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CT method[J].Methods，2001，25（4）：402-408.
[18]蒙钊美，李有宁，邢孔武.珍珠养殖理论与技术[M].北京：科学出版社，1995.
[19]WADA K，KOMARU A.Color and weight of pearls produced by grafting the mantle tissues from a selected population for white shell color of the Japanese pearl oyster Pinctada fucata martensii （Dunker）[J].Aquaculture，1996，142：25-32.