【摘 要】
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目的:构建表达转录因子JunB的真核表达质粒,观察外源JunB分子在细胞中的表达、亚细胞定位及其对下游分子的转录调控作用。方法:采用PCR方法从人源肝cDNA文库中扩增JunB基因片
【机 构】
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第四军医大学肿瘤生物学国家重点实验室生物化学与分子生物学教研室,第四军医大学肿瘤生物学国家重点实验室免疫学教研室,
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目的:构建表达转录因子JunB的真核表达质粒,观察外源JunB分子在细胞中的表达、亚细胞定位及其对下游分子的转录调控作用。方法:采用PCR方法从人源肝cDNA文库中扩增JunB基因片段,克隆入T载体进行测序鉴定。而后将测序正确的基因片段分别亚克隆入pcDNA3.1(-)和pEGFP-C3真核表达载体中,获得重组载体pcDNA-JunB和pEGFP-JunB。采用脂质体瞬时转染法分别将pEGFP-JunB和pcDNA-JunB导入肝癌细胞HepG2中,用Westernblot法观察外源JunB在肝癌细胞中的表达;用荧光显微镜观察其在细胞内的定位;用双荧光素酶报告基因检测法观察JunB对下游靶分子VEGF的转录调控作用。结果:分别构建表达转录因子JunB和增强型绿色荧光蛋白融合JunB分子的重组表达质粒,并经KpnI/BamHI双酶切鉴定正确。将重组表达质粒转染HepG2细胞后,经免疫印迹法和荧光显微镜检测,可见外源导入的JunB分子在细胞中成功表达并特异性定位定位于细胞核内。荧光素酶报告系统检测显示:JunB对VEGF分子在转录水平具有明显的激活作用。结论:成功构建了增强型绿色荧光蛋白基因和转录因子JunB基因融合表达的重组质粒。在肝癌细胞中观察到外源瞬时表达的JunB定位于细胞核中,提示其可能发挥转录因子的活性。报告基因结果显示其对肿瘤血管生成密切相关的分子VEGF发挥转录激活的作用,提示JunB分子有可能成为抑制肝癌血管生成的新靶点。
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