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摘要：【目的】分析芒果不同花芽分化时期的转录组，了解成花过程相关基因的表达情况，为芒果开花时间的分子调控机制研究提供理论参考。【方法】以芒果品种南逗迈4号为材料，采用Illumina高通量测序技术，分别对其新梢停长期（I期）和基部膨大期（II期）2个不同花芽分化时期顶芽进行转录组测序，并利用基因功能注释、差异表达基因筛选等生物信息学方法对测序获得的高质量序列进行分析。通过实时荧光定量PCR（qPCR）检测差异表达基因的表达情况以验证转录组测序结果的可信度。【结果】共获得85691条Unigenes，平均长度为870 bp，N50为1077 bp，与UniProt数据库比对，发现48589条Unigenes有同源信息，注释比例为56.7%，广泛涉及细胞组分、生物过程和分子功能三大类，共55个小类，其中参与生物过程的Unigene数量最多（有21个小类），以参与分子功能的Unigene数量最少（有14个小类）。以Fold-Change≥2为条件，筛选出花芽分化I和II期转录组间的2031个差异表达基因，其中1073个基因表达上调，958个基因表达下调，涉及247条代谢通路，富集的KEGG通路为内质网蛋白加工、次生物质的生物合成和积累、糖代谢和光合作用等，其中注释为内质网蛋白加工的基因数量最多。从2个不同时期顶芽的转录组数据中获得了春化、光周期、赤霉素（GA）、成花抑制、自主和年龄等途径的开花相关基因。将MiSOC1、MiVIN3、MiDof和MiMADS1的qPCR检测结果与其转录组测序结果进行比对，发现这4个基因虽然在II期的表达量比I期上调差异倍数上存在一定差异，但表达量变化趋势一致，说明转录组测序结果的可信度较高。【结论】芒果花芽分化过程与内质网蛋白加工、次生代谢生物合成、植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢等途径密切相关，可为芒果花期人工调控和产期调节提供参考。
关键词： 芒果；转录组；花芽分化；成花；生物信息学；注释；差异表达基因
中图分类号： S667.706.6 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）07-1257-08
0 引言
【研究意义】芒果（Mangifera indica L.）素有热带水果之王的美誉，是全球热带亚热带地区主栽水果之一（莫宇，2015）。研究发现，芒果花期时间对其产量影响较大，花期早易受低温阴雨影响，花期晚易受高温危害，导致其挂果率和梢果率明显降低，从而大幅度降低芒果产量（莫宇，2015）。花芽分化是植物生命周期中由營养生长向生殖生长转变的重要标志，已成为果树生理学和发育学的研究重点，其过程主要包括成花诱导、成花启动和花发育（孙俪和徐启江，2009），其中，成花诱导完成时期即成花启动的起始时期，茎尖分生组织中成花基因启动且大量特异性表达，分化出可辨认的花原基，是调控花芽分化形成的关键时期，也是研究成花启动相关基因的重要时期（曹尚银等，2003；王忠，2008）。因此，了解芒果花芽分化的分子机理，制定相应的花期调控措施，对芒果增产具有重要意义。【前人研究进展】目前，芒果花芽分化研究主要集中在生理栽培方面，如芒果喷施多效唑可使开花数量增加、花期提早（Jose et al.，2000；Hau et al.，2002；黄台明等，2007；胡后祥等，2011）；芒果花枝短截可提高脱落酸含量，促进芒果成花等（高小俊等，2009；彭磊等，2011），而分子水平层面的相关研究报道较少。自1991年Arumuganathan等首次报道芒果是二倍体（2n=40），基因组大小约439 Mb以来，其具体的基因组信息一直尚未见报道，限制了其功能基因的发掘，且其花期调控机制非常复杂，利用传统方法无法对其进行系统研究。随着基因组测序技术的发展，转录组测序技术已成为发掘缺乏基因组信息的物种功能基因的重要研究手段。该技术是利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序，能准确获取研究材料特定组织在某一状态下的全部转录本信息，具有处理数据量大、运行成本低、灵敏度高等优点（Wilhelm and Landry，2009；Chen et al.，2012；白献晓等，2017）。近年来，大量研究利用该技术不断完善植物花期调控网络。Tsanakas等（2014）对开花时长不同的栀子花材料进行转录组测序，结果表明，栀子花的衰败与乙烯合成途径相关；费元等（2015）对大岩桐的花萼和幼叶进行转录组测序，结果发现，促进生长激素合成基因和激素信号转导组分基因在花萼中的表达量明显高于幼叶；周华（2015）对不同开花习性的牡丹花芽进行转录组测序，成功构建其高质量、全面的转录组数据库，并筛选出决定开花时间的关键候选功能基因；付永琦等（2016）对水稻颖花开放前两个时期的浆片进行转录组测序，结果表明，参与调控碳水化合物和茉莉酸等激素代谢、运输、信号转导等生理过程的基因与浆片细胞吸水膨大密切相关，能调控水稻颖花开放。【本研究切入点】目前，鲜见有关芒果不同花芽分化时期转录组测序及分析的研究报道。【拟解决的关键问题】以芒果品种南逗迈4号为材料，对其新梢停长期（I期）和顶芽基部膨大期（II期）2个花芽分化时期的顶端分生组织进行转录组测序，并利用基因功能注释、差异表达基因筛选等生物信息学方法对测序获得的高质量序列进行分析，以期发掘芒果成花相关基因，为芒果花期的人工调控和产期调节提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试芒果品种为南逗迈4号，种植于广西亚热带作物研究所芒果种质资源圃，分别于2017年10月中旬和12月上旬采集其新梢停长期（I期）和顶芽基部膨大期（II期）的花芽，各设3个重复。RNAqueousTM Phenol-free Total RNA试剂盒、ReverTra Ace qPCR Kit和SYBR Green qPCR试剂盒购自宝生物工程（上海）股份有限公司，RNeasy Micro Kit和RNase-free DNase Set试剂盒购自德国凯杰生物工程（深圳）股份有限公司。主要仪器设备：NanoDrop ND-2000分光光度计（Thermo，美国）、Agilent Bioanalyzer 2100生物芯片分析仪（Agilent，美国）和7900 HT Sequence Detection System定量PCR仪（ABI，美国）等。 1. 2 总RNA提取
参照RNAqueousTM Phenol-free Total RNA试剂盒说明提取花芽总RNA，并利用Agilent Bioanalyzer 2100电泳仪检测其质量。经RNeasy Micro Kit和RNase-free DNase Set试剂盒纯化后，利用NanoDrop ND-2000分光光度计和Agilent Bioanalyzer 2100生物芯片分析仪进行质量检查，分别将质量合格的3个重复样品的总RNA按等量混合成一个测序样本，用于后续试验。
1. 3 cDNA文库构建及测序
用带有Oligo（dT）的磁力珠将poly（A） RNA从混合測序样本中分离出来，并加入片段化缓冲液使mRNA成为短片段。参照Dautt-Castro等（2015）的方法构建cDNA文库，并委托上海伯豪生物技术有限公司完成cDNA文库测序工作。
1. 4 转录本组装和基因功能注释
利用FASTX对测序获得的原始序列进行过滤，以得到可用于数据分析的高质量序列。将2个测序样本数据合并形成序列池，应用CLC Genomics Workbench的Scaffolding contig进行de novo拼接（Br?utigam et al.，2011；Garg et al.，2011；Su et al.，2011），并将拼接得到的Final Unigene序列翻译成蛋白后与UniProt数据库进行BLAST比对。UniProt是目前对蛋白功能结构注释最详细且准确的蛋白数据库。
1. 5 差异表达基因筛选及富集分析
分别以各测序样本的总表达量为内标，对2个测序样本的RPKM（每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数）进行Fisher-test差异检验。以FDR（错误发现率）≤0.05、Fold-Change（表达差异倍数）≥2为条件进行差异基因筛选。将筛选的差异表达基因（Differentially expressed genes，DGEs）与UniProt蛋白数据库进行比对以获得其在UniProt的注释信息，与COG（Cluster of Orthologous Groups of Proteins）数据库进行比对以获得其COG注释及分类，与GO（Gene Ontology）数据库进行比对以获得其GO注释及分类。
1. 6 差异表达基因的实时荧光定量PCR（qPCR）检测
通过查询相关文献和转录组测序数据（Moon et al.，2005；Ward et al.，2005；赵翔宇，2005；Finnegan and Dennis，2007；de Lucas et al.，2008），利用同源比对方法，筛选出在成花途径中调控开花时间的基因SOC1、VIN3、MADS1和Dof的同源序列，根据其分别设计引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用于检测芒果MiSOC1、MiVIN3、MiMADS1和MiDof基因的表达量，以验证转录组数据的可靠性。
以1.2中提取的RNA为模板，按照ReverTra Ace qPCR Kit反转录试剂盒说明反转录合成cDNA第一链。采用SYBR Green qPCR试剂盒检测上述基因的表达量，选用Mi18S为内参。PCR反应体系10.0 μL：2×SYBR Green PCR Buffer 5.0 μL，10 μmol/L正、反向引物0.5 μL，cDNA模板5 ng，ddH2O补足至10.0 μL。将其置于7900 HT Sequence Detection System定量PCR仪，扩增程序：50 ℃孵育2 min；95 ℃预变性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，进行40个循环。每个反应设3个重复。采用2-ΔΔCt法计算基因的差异倍数。
2 结果与分析
2. 1 文库测序结果及质量评估
通过分析碱基组成和质量值分布可评估原始数据的质量。本研究中2个测序样本绝大多数序列的碱基质量均大于20，碱基百分比（Q20）含量分别为96.36%和96.34%，即测序质量较好。
原始数据经过FASTX过滤后获得28.5百万和28.6百万条Clean reads。将2个样本测序数据合并形成序列池，通过两次拼接最终得到一个Unigene序列集合，集合共有85691条Unigenes，长度为200～15600 bp，集中在400～600 bp，平均长度为870 bp，N50为1077 bp。
2. 2 Unigenes功能注释与分类
将获得的Unigene序列与UniProt数据库比对，结果显示48589条Unigenes有同源信息，注释比例为56.7%，有37102条Unigenes未找到注释信息。
将Unigene与COG数据库比对进行功能分类预测。从图1可看出，在COG数据库中，Unigene的生物学功能包括信号传导、RNA加工和修饰、翻译后修饰、细胞运动、防卫、转录、核苷酸运输和代谢，氨基酸运输与代谢、能源生产和转换、复制、重组和修复等。其中，具有信号转导机制功能的Unigene所占比例最高，为16.90%，其次是只有一般功能的Unigene占10.70%，具有翻译后修饰、蛋白折叠和分子伴侣功能的Unigene占10.10%，而细胞运动所占比例最低，只有0.02%。
GO是国际标准基因功能分类系统，包括细胞组分、生物过程和分子功能3个部分。由图2可知，本研究中2个不同时期花芽Unigene广泛涉及这三大类，共55个小类。其中，参与生物过程的Unigene最多，有21个小类，以参与细胞过程、代谢过程和的Unigene所占比例较高，均在10.00%以上，其次是参与单一的生物过程、生物调控、刺激应答和定位等的Unigene；参与形成细胞组分的Unigene有20个小类，以参与形成细胞和细胞要素的Unigene所占比例较高，均在6.00%以上，其次是参与形成膜、细胞器、膜要素和细胞器要素等的Unigene；具有分子功能的Unigene有14个小类，以具有结合和催化活性的Unigenes所占比例较高，均在10.00%以上，其次是具有结构分子活性、转录因子活性和核酸结合的转录因子活性Unigene。 2. 3 差异表达基因筛选及GO富集分析结果
通过对各测序样本的RPKM进行Fisher-test差异检验，并以Fold-Change≥2为条件，筛选出在花芽分化I和II期转录组间的差异表达基因2031个，其中有1073个基因表达上调、958个基因表达下调。
利用GO富集分析差异表达基因的功能，并在表2中列出在生物过程、分子功能和细胞组成各排名前5的GO注释。在生物过程方面，差异表达基因主要富集于代谢过程、氧化还原、转录调控、DNA模板和应激反应等生物学过程；在分子功能方面，差异表达基因主要富集于金属离子结合、氧化还原酶活性及DNA结合和催化等分子功能；在细胞组成中，主要富集于细胞核、细胞质、胞外区和质体外等细胞组成。
2. 4 差异表达基因代谢通路分析结果
KEGG数据库信息包含细胞内分子互作网络、信息和特异生物学变化。通过KEGG通路分析可深入了解基因的生物学功能。将差异表达基因与KEGG数据库进行比对及注释，结果发现，差异表达基因涉及247条代谢通路，富集的KEGG通路为内质网蛋白加工、次生物质的生物合成、糖代谢和光合作用等，其中注释为内质网蛋白加工的差异表达基因数量最多，为82个，占代谢通路中全部差异表达基因数的14.94%。
植物成花过程中，其体内的碳水化合物、细胞分裂素和生长素等物质的生理生化代谢会发生改变。不同顶芽分化时期的糖代谢、激素代谢和信号转导相关的差异基因KEGG通路如表3所示，与I期相比，II期基因表达上调的KEGG通路为淀粉和蔗糖代谢、戊糖磷酸途径、嘌呤代谢、色氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、雌激素受体信号传导途径、钙信号通路和双组份系统等。KEGG通路中淀粉和蔗糖代谢通路中24个基因表达量发生改变，其中23个基因表达量上调，蔗糖代谢中的关键酶蔗糖合成酶SS、α-淀粉酶和β-淀粉酶等基因表达量明显上调；细胞分裂素的合成前體是腺嘌呤，KEGG通路中涉及嘌呤代谢的9个基因表达量均上调，如丙酮酸激酶基因、硫酸腺苷酸转移酶基因等；生长素的合成前体是色氨酸，涉及色氨酸代谢途径的8个基因中有6个基因表达量上调，如乙酰-CoA乙酰转移酶基因、磺基转移酶基因等。
2. 5 开花相关基因分析结果
植物成花诱导是一个复杂过程，主要受春化、光周期、赤霉素（GA）、自主和年龄等途径调控。本研究从2个不同时期顶芽的转录组数据中获得多个调控途径中的开花相关基因，如春化途径相关基因VIN3、FRI、SVP和AP2等，其中FRI基因为下调基因，其余均为上调基因；光周期途径中光受体光敏色素基因PHYB、隐花色素基因CRY1和CRY2、向光素基因PHOT及生物节律基因CO、GI、CCA1、TOC1和ELF4等，其中CRY2和CCA1基因为下调基因，其余为上调基因；GA途径相关基因GID1、GA20OX、GA2OX和GA3OX等，除GA2OX基因为下调基因外，其余均为上调基因；自主途径相关基因REF6为下调基因；成花抑制途径相关基因EMF和TFL1分别为上调和下调基因；年龄途径相关基因SPL为上调基因；成花整合子基因SOC1和LFY为上调基因；未发现成花整合基因FT。
2. 6 差异表达基因的qPCR检测结果
从图3可知，转录组测序结果显示，MiSOC1、MiVIN3、MiDof和MiMADS1 4个差异表达基因在II期的表达量较I期明显升高，上调差异倍数为1.6～2.4；qPCR验证结果显示，4个基因上调差异倍数为1.4～2.6。虽然转录组测序结果与qPCR检测结果在差异倍数上存在一定差距，但表达量变化趋势一致，说明转录组测序结果的可信度较高。
3 讨论
本研究以芒果品种南逗迈4号为材料，对其2个花芽分化时期的顶端分生组织进行转录组测序，GO功能富集分析结果显示，差异表达基因的分子功能主要涉及金属离子结合、氧化还原酶活性、DNA结合和催化等；差异表达基因参与的生物过程主要富集于代谢、氧化还原、转录调控和DNA模板等，但KEGG通路分析结果显示，差异表达基因主要富集于内质网蛋白加工、次生代谢生物合成和代谢及植物激素信号转导等通路，与前人对油茶花（胡玉玲等，2014）、油桐（孙颖等，2014）和牡丹（周华，2015）等植物花芽分化转录组的研究结果相似。内质网是蛋白质加工的主要场所，可将糖和蛋白质上的氨基酸残基形成糖苷键，最终形成糖蛋白，其携带大量蛋白质代谢信息，具有传导信号的功能（纪洪涛等，2006）。本研究发现，生物学过程富集于内质网蛋白加工途径的差异表达基因数量最多，为82个，占代谢通路中全部差异表达基因数的14.94%，与COG功能分类中具有信号转导机制功能的Unigene所占比例最多相对应，其原因可能是当外界条件适宜芒果开花时，内质网通过对蛋白质进行糖基化加工，调控芒果生理生化代谢，为芒果开花创造必要的生理条件。
前人研究发现，SOC1、VIN3、MADS1和Dof基因在成花途径中发挥重要作用，主要参与开花时间的调控。其中，SOC1基因是重要的开花整合子（Moon et al.，2005），VIN3基因是春化途径中成花抑制基因FLC的直接抑制子（Finnegan and Dennis，2007；de Lucas et al.，2008），Dof基因可调控植物光敏色素和隐花色素的信号转导途径（Ward et al.，2005），MADS1基因与花发育密切相关（赵翔宇，2005）。本研究转录组测序结果和qPCR验证结果均发现，MiSOC1、MiVIN3、MiDof和MiMADS1 4个差异表达基因在II期的表达量较I期均明显升高，说明其在芒果成花过程中发挥重要作用。
温度是影响植物花芽分化的另一个重要环境因素，适当低温可诱导芒果成花（Kumar and Wigge，2010）。本研究发现，在芒果成花诱导中VIN3基因在II期的表达量较I期明显上升，与Sung和Amasino（2004）的研究结果一致，进一步证实只有长时间低温诱导下春化途径VIN3基因才会表达或表达量上调。但本研究未发掘到与VIN3基因功能相似的VIN1和VIN2基因及春化稳定相关的VRN类基因。 GA是影响植物成花的重要激素，与GA途径相关的两类基因分别是生物合成相关基因和信号转导关键基因。本研究中从两个时期顶芽的转录组数据中获得调控途径中多个开花相关基因：GA生物合成基因GA20OX、GA2OX和GA3OX，无GA信号转导基因；自主途径相关基因REF6；成花抑制相关基因EMF和TFL1；年龄途径相关基因SPL。光周期、春化、GA和自主等途径的基因效应最终汇集于关键开花整合基因SOC1、FT和LFY，其共同决定高等植物是否开花（孟晓庆等，2013）。本研究在芒果转录组中还发掘到LFY和SOC1的同源基因。SOC1基因是关键的开花激活子之一，其表达不能被CO直接调控，而需通过调控FT基因的表达才能激活（Yoo et al.，2005），SOC1基因又可激活下游基因LFY的表达，LFY基因在植物成花转变中参与花分生组织的形成，是花分生组织特征基因，位于光周期和GA途径交叉处，既可调控成花时间，又能诱导花分生组织形成（Yu et al.，2012）。目前，有关芒果基因组及转录组信息研究报道较少。本研究在芒果转录组中未发现成花整合基因FT，但罗聪（2012）研究报道，芒果FT基因所编码的氨基酸数明显比其他植物FT基因多，且与其他不同物种FT蛋白聚类时只能单独聚为一类，因此，推测在芒果转录组中可能存在FT基因的同源基因。
光周期是诱导植物开花的主要环境因子。拟南芥的成熟叶片通过隐花色素CRY（Lin，1998）和光敏色素PHYB（Yasushi and Weigel，2007）等受体基因感受昼夜节律，将信号传递进入生物钟，启动生物钟中的重要调控基因GI和TOC1的表达（Mizoguchi et al.，2005），从而激活CO基因表达，促进开花（Suarez-Lopez et al.，2001）。本研究发现，光敏色素基因PHYB、隐花色素基因CRY1和CRY2及向光素基因PHOT表达上调，昼夜节律基因GI和TOC1的表达量也随之上调，从而激活该途径中关键基因CO使其表达量上調，表明此时芒果光周期途径已被启动。但在木本果树中，除少数几种果树如蓝莓等对光敏感外（Spann et al.，2003），其余大多数对光周期不敏感，芒果就是其中之一（Nú?ez-Elisea and Davenport，1995）。虽然芒果成花对光周期不敏感，但光周期与温度等外界环境紧密相连，外界环境的变化会调节光周期途径相关基因的表达，从而启动光周期途径以调控芒果成花（陈洁等，2010）。在芒果开花过程中光周期途径是如何与其他途径共同协作调控开花，其他与环境相关的途径启动后能否在与光周期途径交汇处引起基因表达量变化从而启动光周期途径，均需进一步研究。
4 结论
芒果花芽分化过程与内质网蛋白加工、次生代谢生物合成、植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢等途径密切相关，可为芒果花期人工调控和产期调节提供参考。
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（責任编辑 陈 燕）
关键词： 芒果；转录组；花芽分化；成花；生物信息学；注释；差异表达基因
中图分类号： S667.706.6 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）07-1257-08
0 引言
【研究意义】芒果（Mangifera indica L.）素有热带水果之王的美誉，是全球热带亚热带地区主栽水果之一（莫宇，2015）。研究发现，芒果花期时间对其产量影响较大，花期早易受低温阴雨影响，花期晚易受高温危害，导致其挂果率和梢果率明显降低，从而大幅度降低芒果产量（莫宇，2015）。花芽分化是植物生命周期中由營养生长向生殖生长转变的重要标志，已成为果树生理学和发育学的研究重点，其过程主要包括成花诱导、成花启动和花发育（孙俪和徐启江，2009），其中，成花诱导完成时期即成花启动的起始时期，茎尖分生组织中成花基因启动且大量特异性表达，分化出可辨认的花原基，是调控花芽分化形成的关键时期，也是研究成花启动相关基因的重要时期（曹尚银等，2003；王忠，2008）。因此，了解芒果花芽分化的分子机理，制定相应的花期调控措施，对芒果增产具有重要意义。【前人研究进展】目前，芒果花芽分化研究主要集中在生理栽培方面，如芒果喷施多效唑可使开花数量增加、花期提早（Jose et al.，2000；Hau et al.，2002；黄台明等，2007；胡后祥等，2011）；芒果花枝短截可提高脱落酸含量，促进芒果成花等（高小俊等，2009；彭磊等，2011），而分子水平层面的相关研究报道较少。自1991年Arumuganathan等首次报道芒果是二倍体（2n=40），基因组大小约439 Mb以来，其具体的基因组信息一直尚未见报道，限制了其功能基因的发掘，且其花期调控机制非常复杂，利用传统方法无法对其进行系统研究。随着基因组测序技术的发展，转录组测序技术已成为发掘缺乏基因组信息的物种功能基因的重要研究手段。该技术是利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序，能准确获取研究材料特定组织在某一状态下的全部转录本信息，具有处理数据量大、运行成本低、灵敏度高等优点（Wilhelm and Landry，2009；Chen et al.，2012；白献晓等，2017）。近年来，大量研究利用该技术不断完善植物花期调控网络。Tsanakas等（2014）对开花时长不同的栀子花材料进行转录组测序，结果表明，栀子花的衰败与乙烯合成途径相关；费元等（2015）对大岩桐的花萼和幼叶进行转录组测序，结果发现，促进生长激素合成基因和激素信号转导组分基因在花萼中的表达量明显高于幼叶；周华（2015）对不同开花习性的牡丹花芽进行转录组测序，成功构建其高质量、全面的转录组数据库，并筛选出决定开花时间的关键候选功能基因；付永琦等（2016）对水稻颖花开放前两个时期的浆片进行转录组测序，结果表明，参与调控碳水化合物和茉莉酸等激素代谢、运输、信号转导等生理过程的基因与浆片细胞吸水膨大密切相关，能调控水稻颖花开放。【本研究切入点】目前，鲜见有关芒果不同花芽分化时期转录组测序及分析的研究报道。【拟解决的关键问题】以芒果品种南逗迈4号为材料，对其新梢停长期（I期）和顶芽基部膨大期（II期）2个花芽分化时期的顶端分生组织进行转录组测序，并利用基因功能注释、差异表达基因筛选等生物信息学方法对测序获得的高质量序列进行分析，以期发掘芒果成花相关基因，为芒果花期的人工调控和产期调节提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试芒果品种为南逗迈4号，种植于广西亚热带作物研究所芒果种质资源圃，分别于2017年10月中旬和12月上旬采集其新梢停长期（I期）和顶芽基部膨大期（II期）的花芽，各设3个重复。RNAqueousTM Phenol-free Total RNA试剂盒、ReverTra Ace qPCR Kit和SYBR Green qPCR试剂盒购自宝生物工程（上海）股份有限公司，RNeasy Micro Kit和RNase-free DNase Set试剂盒购自德国凯杰生物工程（深圳）股份有限公司。主要仪器设备：NanoDrop ND-2000分光光度计（Thermo，美国）、Agilent Bioanalyzer 2100生物芯片分析仪（Agilent，美国）和7900 HT Sequence Detection System定量PCR仪（ABI，美国）等。 1. 2 总RNA提取
参照RNAqueousTM Phenol-free Total RNA试剂盒说明提取花芽总RNA，并利用Agilent Bioanalyzer 2100电泳仪检测其质量。经RNeasy Micro Kit和RNase-free DNase Set试剂盒纯化后，利用NanoDrop ND-2000分光光度计和Agilent Bioanalyzer 2100生物芯片分析仪进行质量检查，分别将质量合格的3个重复样品的总RNA按等量混合成一个测序样本，用于后续试验。
1. 3 cDNA文库构建及测序
用带有Oligo（dT）的磁力珠将poly（A） RNA从混合測序样本中分离出来，并加入片段化缓冲液使mRNA成为短片段。参照Dautt-Castro等（2015）的方法构建cDNA文库，并委托上海伯豪生物技术有限公司完成cDNA文库测序工作。
1. 4 转录本组装和基因功能注释
利用FASTX对测序获得的原始序列进行过滤，以得到可用于数据分析的高质量序列。将2个测序样本数据合并形成序列池，应用CLC Genomics Workbench的Scaffolding contig进行de novo拼接（Br?utigam et al.，2011；Garg et al.，2011；Su et al.，2011），并将拼接得到的Final Unigene序列翻译成蛋白后与UniProt数据库进行BLAST比对。UniProt是目前对蛋白功能结构注释最详细且准确的蛋白数据库。
1. 5 差异表达基因筛选及富集分析
分别以各测序样本的总表达量为内标，对2个测序样本的RPKM（每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数）进行Fisher-test差异检验。以FDR（错误发现率）≤0.05、Fold-Change（表达差异倍数）≥2为条件进行差异基因筛选。将筛选的差异表达基因（Differentially expressed genes，DGEs）与UniProt蛋白数据库进行比对以获得其在UniProt的注释信息，与COG（Cluster of Orthologous Groups of Proteins）数据库进行比对以获得其COG注释及分类，与GO（Gene Ontology）数据库进行比对以获得其GO注释及分类。
1. 6 差异表达基因的实时荧光定量PCR（qPCR）检测
通过查询相关文献和转录组测序数据（Moon et al.，2005；Ward et al.，2005；赵翔宇，2005；Finnegan and Dennis，2007；de Lucas et al.，2008），利用同源比对方法，筛选出在成花途径中调控开花时间的基因SOC1、VIN3、MADS1和Dof的同源序列，根据其分别设计引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用于检测芒果MiSOC1、MiVIN3、MiMADS1和MiDof基因的表达量，以验证转录组数据的可靠性。
以1.2中提取的RNA为模板，按照ReverTra Ace qPCR Kit反转录试剂盒说明反转录合成cDNA第一链。采用SYBR Green qPCR试剂盒检测上述基因的表达量，选用Mi18S为内参。PCR反应体系10.0 μL：2×SYBR Green PCR Buffer 5.0 μL，10 μmol/L正、反向引物0.5 μL，cDNA模板5 ng，ddH2O补足至10.0 μL。将其置于7900 HT Sequence Detection System定量PCR仪，扩增程序：50 ℃孵育2 min；95 ℃预变性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，进行40个循环。每个反应设3个重复。采用2-ΔΔCt法计算基因的差异倍数。
2 结果与分析
2. 1 文库测序结果及质量评估
通过分析碱基组成和质量值分布可评估原始数据的质量。本研究中2个测序样本绝大多数序列的碱基质量均大于20，碱基百分比（Q20）含量分别为96.36%和96.34%，即测序质量较好。
原始数据经过FASTX过滤后获得28.5百万和28.6百万条Clean reads。将2个样本测序数据合并形成序列池，通过两次拼接最终得到一个Unigene序列集合，集合共有85691条Unigenes，长度为200～15600 bp，集中在400～600 bp，平均长度为870 bp，N50为1077 bp。
2. 2 Unigenes功能注释与分类
将获得的Unigene序列与UniProt数据库比对，结果显示48589条Unigenes有同源信息，注释比例为56.7%，有37102条Unigenes未找到注释信息。
将Unigene与COG数据库比对进行功能分类预测。从图1可看出，在COG数据库中，Unigene的生物学功能包括信号传导、RNA加工和修饰、翻译后修饰、细胞运动、防卫、转录、核苷酸运输和代谢，氨基酸运输与代谢、能源生产和转换、复制、重组和修复等。其中，具有信号转导机制功能的Unigene所占比例最高，为16.90%，其次是只有一般功能的Unigene占10.70%，具有翻译后修饰、蛋白折叠和分子伴侣功能的Unigene占10.10%，而细胞运动所占比例最低，只有0.02%。
GO是国际标准基因功能分类系统，包括细胞组分、生物过程和分子功能3个部分。由图2可知，本研究中2个不同时期花芽Unigene广泛涉及这三大类，共55个小类。其中，参与生物过程的Unigene最多，有21个小类，以参与细胞过程、代谢过程和的Unigene所占比例较高，均在10.00%以上，其次是参与单一的生物过程、生物调控、刺激应答和定位等的Unigene；参与形成细胞组分的Unigene有20个小类，以参与形成细胞和细胞要素的Unigene所占比例较高，均在6.00%以上，其次是参与形成膜、细胞器、膜要素和细胞器要素等的Unigene；具有分子功能的Unigene有14个小类，以具有结合和催化活性的Unigenes所占比例较高，均在10.00%以上，其次是具有结构分子活性、转录因子活性和核酸结合的转录因子活性Unigene。 2. 3 差异表达基因筛选及GO富集分析结果
通过对各测序样本的RPKM进行Fisher-test差异检验，并以Fold-Change≥2为条件，筛选出在花芽分化I和II期转录组间的差异表达基因2031个，其中有1073个基因表达上调、958个基因表达下调。
利用GO富集分析差异表达基因的功能，并在表2中列出在生物过程、分子功能和细胞组成各排名前5的GO注释。在生物过程方面，差异表达基因主要富集于代谢过程、氧化还原、转录调控、DNA模板和应激反应等生物学过程；在分子功能方面，差异表达基因主要富集于金属离子结合、氧化还原酶活性及DNA结合和催化等分子功能；在细胞组成中，主要富集于细胞核、细胞质、胞外区和质体外等细胞组成。
2. 4 差异表达基因代谢通路分析结果
KEGG数据库信息包含细胞内分子互作网络、信息和特异生物学变化。通过KEGG通路分析可深入了解基因的生物学功能。将差异表达基因与KEGG数据库进行比对及注释，结果发现，差异表达基因涉及247条代谢通路，富集的KEGG通路为内质网蛋白加工、次生物质的生物合成、糖代谢和光合作用等，其中注释为内质网蛋白加工的差异表达基因数量最多，为82个，占代谢通路中全部差异表达基因数的14.94%。
植物成花过程中，其体内的碳水化合物、细胞分裂素和生长素等物质的生理生化代谢会发生改变。不同顶芽分化时期的糖代谢、激素代谢和信号转导相关的差异基因KEGG通路如表3所示，与I期相比，II期基因表达上调的KEGG通路为淀粉和蔗糖代谢、戊糖磷酸途径、嘌呤代谢、色氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、雌激素受体信号传导途径、钙信号通路和双组份系统等。KEGG通路中淀粉和蔗糖代谢通路中24个基因表达量发生改变，其中23个基因表达量上调，蔗糖代谢中的关键酶蔗糖合成酶SS、α-淀粉酶和β-淀粉酶等基因表达量明显上调；细胞分裂素的合成前體是腺嘌呤，KEGG通路中涉及嘌呤代谢的9个基因表达量均上调，如丙酮酸激酶基因、硫酸腺苷酸转移酶基因等；生长素的合成前体是色氨酸，涉及色氨酸代谢途径的8个基因中有6个基因表达量上调，如乙酰-CoA乙酰转移酶基因、磺基转移酶基因等。
2. 5 开花相关基因分析结果
植物成花诱导是一个复杂过程，主要受春化、光周期、赤霉素（GA）、自主和年龄等途径调控。本研究从2个不同时期顶芽的转录组数据中获得多个调控途径中的开花相关基因，如春化途径相关基因VIN3、FRI、SVP和AP2等，其中FRI基因为下调基因，其余均为上调基因；光周期途径中光受体光敏色素基因PHYB、隐花色素基因CRY1和CRY2、向光素基因PHOT及生物节律基因CO、GI、CCA1、TOC1和ELF4等，其中CRY2和CCA1基因为下调基因，其余为上调基因；GA途径相关基因GID1、GA20OX、GA2OX和GA3OX等，除GA2OX基因为下调基因外，其余均为上调基因；自主途径相关基因REF6为下调基因；成花抑制途径相关基因EMF和TFL1分别为上调和下调基因；年龄途径相关基因SPL为上调基因；成花整合子基因SOC1和LFY为上调基因；未发现成花整合基因FT。
2. 6 差异表达基因的qPCR检测结果
从图3可知，转录组测序结果显示，MiSOC1、MiVIN3、MiDof和MiMADS1 4个差异表达基因在II期的表达量较I期明显升高，上调差异倍数为1.6～2.4；qPCR验证结果显示，4个基因上调差异倍数为1.4～2.6。虽然转录组测序结果与qPCR检测结果在差异倍数上存在一定差距，但表达量变化趋势一致，说明转录组测序结果的可信度较高。
3 讨论
本研究以芒果品种南逗迈4号为材料，对其2个花芽分化时期的顶端分生组织进行转录组测序，GO功能富集分析结果显示，差异表达基因的分子功能主要涉及金属离子结合、氧化还原酶活性、DNA结合和催化等；差异表达基因参与的生物过程主要富集于代谢、氧化还原、转录调控和DNA模板等，但KEGG通路分析结果显示，差异表达基因主要富集于内质网蛋白加工、次生代谢生物合成和代谢及植物激素信号转导等通路，与前人对油茶花（胡玉玲等，2014）、油桐（孙颖等，2014）和牡丹（周华，2015）等植物花芽分化转录组的研究结果相似。内质网是蛋白质加工的主要场所，可将糖和蛋白质上的氨基酸残基形成糖苷键，最终形成糖蛋白，其携带大量蛋白质代谢信息，具有传导信号的功能（纪洪涛等，2006）。本研究发现，生物学过程富集于内质网蛋白加工途径的差异表达基因数量最多，为82个，占代谢通路中全部差异表达基因数的14.94%，与COG功能分类中具有信号转导机制功能的Unigene所占比例最多相对应，其原因可能是当外界条件适宜芒果开花时，内质网通过对蛋白质进行糖基化加工，调控芒果生理生化代谢，为芒果开花创造必要的生理条件。
前人研究发现，SOC1、VIN3、MADS1和Dof基因在成花途径中发挥重要作用，主要参与开花时间的调控。其中，SOC1基因是重要的开花整合子（Moon et al.，2005），VIN3基因是春化途径中成花抑制基因FLC的直接抑制子（Finnegan and Dennis，2007；de Lucas et al.，2008），Dof基因可调控植物光敏色素和隐花色素的信号转导途径（Ward et al.，2005），MADS1基因与花发育密切相关（赵翔宇，2005）。本研究转录组测序结果和qPCR验证结果均发现，MiSOC1、MiVIN3、MiDof和MiMADS1 4个差异表达基因在II期的表达量较I期均明显升高，说明其在芒果成花过程中发挥重要作用。
温度是影响植物花芽分化的另一个重要环境因素，适当低温可诱导芒果成花（Kumar and Wigge，2010）。本研究发现，在芒果成花诱导中VIN3基因在II期的表达量较I期明显上升，与Sung和Amasino（2004）的研究结果一致，进一步证实只有长时间低温诱导下春化途径VIN3基因才会表达或表达量上调。但本研究未发掘到与VIN3基因功能相似的VIN1和VIN2基因及春化稳定相关的VRN类基因。 GA是影响植物成花的重要激素，与GA途径相关的两类基因分别是生物合成相关基因和信号转导关键基因。本研究中从两个时期顶芽的转录组数据中获得调控途径中多个开花相关基因：GA生物合成基因GA20OX、GA2OX和GA3OX，无GA信号转导基因；自主途径相关基因REF6；成花抑制相关基因EMF和TFL1；年龄途径相关基因SPL。光周期、春化、GA和自主等途径的基因效应最终汇集于关键开花整合基因SOC1、FT和LFY，其共同决定高等植物是否开花（孟晓庆等，2013）。本研究在芒果转录组中还发掘到LFY和SOC1的同源基因。SOC1基因是关键的开花激活子之一，其表达不能被CO直接调控，而需通过调控FT基因的表达才能激活（Yoo et al.，2005），SOC1基因又可激活下游基因LFY的表达，LFY基因在植物成花转变中参与花分生组织的形成，是花分生组织特征基因，位于光周期和GA途径交叉处，既可调控成花时间，又能诱导花分生组织形成（Yu et al.，2012）。目前，有关芒果基因组及转录组信息研究报道较少。本研究在芒果转录组中未发现成花整合基因FT，但罗聪（2012）研究报道，芒果FT基因所编码的氨基酸数明显比其他植物FT基因多，且与其他不同物种FT蛋白聚类时只能单独聚为一类，因此，推测在芒果转录组中可能存在FT基因的同源基因。
光周期是诱导植物开花的主要环境因子。拟南芥的成熟叶片通过隐花色素CRY（Lin，1998）和光敏色素PHYB（Yasushi and Weigel，2007）等受体基因感受昼夜节律，将信号传递进入生物钟，启动生物钟中的重要调控基因GI和TOC1的表达（Mizoguchi et al.，2005），从而激活CO基因表达，促进开花（Suarez-Lopez et al.，2001）。本研究发现，光敏色素基因PHYB、隐花色素基因CRY1和CRY2及向光素基因PHOT表达上调，昼夜节律基因GI和TOC1的表达量也随之上调，从而激活该途径中关键基因CO使其表达量上調，表明此时芒果光周期途径已被启动。但在木本果树中，除少数几种果树如蓝莓等对光敏感外（Spann et al.，2003），其余大多数对光周期不敏感，芒果就是其中之一（Nú?ez-Elisea and Davenport，1995）。虽然芒果成花对光周期不敏感，但光周期与温度等外界环境紧密相连，外界环境的变化会调节光周期途径相关基因的表达，从而启动光周期途径以调控芒果成花（陈洁等，2010）。在芒果开花过程中光周期途径是如何与其他途径共同协作调控开花，其他与环境相关的途径启动后能否在与光周期途径交汇处引起基因表达量变化从而启动光周期途径，均需进一步研究。
4 结论
芒果花芽分化过程与内质网蛋白加工、次生代谢生物合成、植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢等途径密切相关，可为芒果花期人工调控和产期调节提供参考。
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（責任编辑 陈 燕）