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【摘要】 本文分别采用盐酸沉淀前处理方法和亚铁氰化钾沉淀前处理方法提取乳粉中的牛磺酸，并采用丹磺酰氯柱前衍生高效液相色谱法对乳粉中的牛磺酸含量进行测定。结果表明采用亚铁氰化钾沉淀法所得的谱图存在的杂质峰对牛磺酸谱峰产生干扰，造成牛磺酸谱峰出现肩峰影响测试结果。而采用盐酸沉淀法所得液相色谱谱图出现的杂质峰对牛磺酸谱峰不造成干扰。
【关键词】 牛磺酸;前处理方法;液相色谱法;肩峰
【DOI编码】 10.3969/j.issn.1674-4977.2021.06.029
Optimization of Pretreatment Conditions for HPLC Determination of Taurine in Milk Powder
YU Jiao-zhu1，LIN Yang1，ZHANG Hong-hong1，WANG Yun1，LIU Peng2*
（1.Shenyang Food and Drug Inspection Institute，Shenyang 110036，China;2.Shenyang Jianzhu University，Shenyang 110036，China）
Abstract： Taurine in milk powder was extracted with hydrochloric acid or potassium ferrocyanide. The content of taurine was determined by high performance liquid chromatography（HPLC）with dansulfonyl chloride as pre-column derivatization. The shoulder peak may affect the test results when using potassium ferrocyanide as the precipitation. While the impurity peaks make no differences in the spectrogram when using hydrochloric acid as the precipitation.
Key words： taurine;pretreatment method;HPLC;shoulder peak
牛磺酸（2-氨基乙磺酸）是一种非蛋白类氨基酸，它在人体内主要以游离氨基酸形式存在，具有一定的抗肿瘤活性，对提高婴幼儿机体免疫力和抗病能力有十分重要的作用[1-2]。目前国内外测定牛磺酸含量的方法有高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法、氨基酸自动分析法、薄层层析法等[3-6]。高效液相色谱法具有样品处理简单、方法精确度高和灵敏度高等特点，因此在牛磺酸含量测定中应用最为广泛。国家标准GB 5009.169—2016即规定了两种液相色谱法：第一法为OPA柱后衍生法，第二法为丹磺酰氯柱前衍生法[7]。由于第一法使用的色谱柱价格昂贵，且需要使用柱后衍生装置，对实验室要求较高，所以大多数实验室使用标准中的第二法。
笔者在用高效液相色谱法测定乳粉中的牛磺酸含量时，发现采用亚铁氰化钾沉淀的方法处理样品时，色谱图上往往出现干扰峰，容易对测定结果带来一定影响。干扰峰严重时，还需进一步调整色谱条件提高谱峰分离度进行定量，因而严重影响工作效率。
本文采用盐酸沉淀法对乳粉进行前处理，采用丹磺酰氯柱前衍生高效液相色谱法对乳粉中牛磺酸的含量进行测定，并将测试结果和亚铁氰化钾沉淀法进行对比，分析造成两种提取方式测试结果差异的原因。采用两种提取方法分别测试了三种乳粉样品中的牛磺酸含量，对比了两种方法的重现性。
1 实验部分
1.1 实验原理
牛磺酸在紫外光下没有特征吸收，先利用衍生剂丹磺酰氯和牛磺酸N-端氨基作用，得到在紫外光下具有特征吸收的牛磺酸衍生物。再用配有紫外检测器的高效液相色谱对其含量进行测定。
1.2 牛磺酸提取
1.2.1 亚铁氰化钾沉淀前处理方法
称取5 g（精确至0.01 g）样品，加入40～50 ℃温水30 mL，超声溶解。放冷至室温，加入沉淀剂150 g/L亚铁氰化钾水溶液，300 g/L乙酸锌水溶液各1 mL，用水定容至100 mL，混匀。8000 r/min转速离心5 min，取上清备用。
1.2.2 盐酸沉淀前处理方法
称取5 g（精确至0.01 g）样品于100 mL容量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液60 mL，充分摇匀，超声溶解。用2.0 mol/L乙酸钠溶液调节pH至3.9，用水定容至刻度，摇匀过滤，取上清液备用。
1.3 牛磺酸衍生
准确吸取1.00 mL上清液，加入1.00 mL碳酸钠缓冲液（pH9.5），1.00 mL丹磺酰氯-乙腈溶液（1.5 mg/mL），充分混合，室温避光衍生反应2 h，加入0.10 mL盐酸甲胺溶液（20 g/L），涡旋混合以终止反应，避光静置至沉淀完全。取上清液经0.45 μm微孔濾膜过滤，取滤液待上机。
1.4 液相色谱仪器条件
色谱柱：C18反相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：乙酸钠缓冲液（10 mmol/L）+乙腈=70+30（体积比）;检测波长：二极管阵列检测器，254 nm。
2 结果与讨论
2.1 前处理方法对牛磺酸测试谱图的影响
分别采用酸沉淀前处理方法和亚铁氰化钾沉淀前处理方法测定乳粉中的牛磺酸，相应谱图如图1～图4所示。图1为牛磺酸标准谱液相色谱图，图2、图3分别为采用盐酸沉淀前处理方法和亚铁氰化钾沉淀前处理方法测定的液相色谱图及局部放大图，图4为图3中牛磺酸谱峰和杂质峰对应的吸收光谱图。从图3可以看出，采用亚铁氰化钾沉淀前处理方法处理乳粉，牛磺酸的液相谱图中存在明显的杂质峰。对照图4可以看出，杂质峰与牛磺酸谱峰具有相似的吸收光谱。对比图2、图3局部放大图，可以看出采用亚铁氰化钾沉淀法处理的乳粉，牛磺酸谱峰峰形较差，杂质峰与牛磺酸谱峰产生包裹，造成牛磺酸谱峰出现肩峰，在积分定量时容易造成干扰从而影响测试结果的准确度。而采用盐酸沉淀法处理的乳粉，谱图中虽然存在杂质峰，但是杂质峰和牛磺酸谱峰具有较高的分离度，牛磺酸谱峰峰形对称规整，无肩峰，杂质峰不会对牛磺酸的积分定量产生干扰，因此测试结果的准确度更高。从图3谱图推断，造成肩峰的原因是亚铁氰化钾沉淀法对乳粉中的一些氨基酸和蛋白质沉淀不完全，导致这些氨基酸也参与衍生反应，并在液相色谱测试中被检出，而盐酸沉淀法对其他氨基酸和蛋白质的去除效果更好，因而在谱图中杂质峰对牛磺酸谱峰不产生干扰。 2.2 前处理方法对牛磺酸含量的影响
分别采用盐酸沉淀法和亚铁氰化钾沉淀法对三种乳粉样品进行前处理，采用丹磺酰氯柱前衍生液相色谱法进行牛磺酸含量测定，供试品编号为1#～6#，三组样品六次测定的结果如表1所示。从表格中可以看出，采用两种前处理方法得到三组乳粉样品的牛磺酸测试均值（单位mg/100g）分别为35.46，41.10，48.49和36.28，40.25，47.38，精密度分别为2.29%，3.14%，3.01%和4.52%，5.08%，4.11%。采用两种前处理方法测得的牛磺酸含量相近，均能满足测试要求。此外，采用盐酸沉淀法进行前处理得到的测试结果具有较小的精密度，说明盐酸沉淀法具有更好的数据再现性。
3 结论
本文分别采用盐酸沉淀法和亚铁氰化钾沉淀法两种前处理方法提取乳粉中的牛磺酸，采用高效液相色谱法测定牛磺酸含量。测试结果表明：相同条件下，采用盐酸沉淀法得到的液相色谱图牛磺酸谱峰峰形较好，无肩峰，色谱图上其他杂质谱峰对测试结果不产生干扰。而采用亚铁氰化钾沉淀方法得到的液相色谱图牛磺酸谱峰出现肩峰，进而影响测试结果。采用两种前处理方法得到三组乳粉样品的牛磺酸测试均值分别为35.46 mg/100 g、41.10 mg/100 g、48.49 mg/100 g和36.28 mg/100 g、40.25 mg/100 g、47.38 mg/100 g，精密度分别为2.29%、3.14%、3.01%和4.52%、5.08%、4.11%。两种前处理方法均能满足测试要求，盐酸沉淀法具有更好的数据重现性。
【参考文献】
[1] Owoeye O，Adedara I A，Farombi E O. Pretreatment with taurine prevented brain injury ndexploratory behaviour associated with administration of anticancer drug cisplatin in rats[J].Biomedicine &Pharmacotherapy，2018（102）：375-384.
[2] 富瑤，胡云东，尹冬冬.食品营养强化剂牛磺酸[J].化学教育，2006（10）：1-2.
[3] Brad McConn. Determination of taurine in energy drinks by High performance liquid chromatography[J].Concordia College Journal of Analytical Chemistry，2012（3）：47-52.
[4] 黄喆雯，唐钦强.2，4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相色谱法测定婴幼儿配方乳粉中牛磺酸含量[J].食品科学，2008（3）：415-417.
[5] Orth D L. HPLC Determination of Taurine in Sports Drinks[J].Journal of chemical education，2001（6）：791-792.
[6] 张婷，陈雷，刘芸，等.高效液相色谱-高分辨质谱法测定乳粉中的牛磺酸[J].食品安全质量检测学报，2017（6）：2086-2090.
[7] 食品中牛磺酸的测定（发布稿）：GB 5009.169—2016[S].
【作者简介】
郁蕉竹，女，1989年出生，工程师，硕士，研究方向为食品检验检测。
通讯作者：刘鹏，男，liupeng6955@126.com。
【关键词】 牛磺酸;前处理方法;液相色谱法;肩峰
【DOI编码】 10.3969/j.issn.1674-4977.2021.06.029
Optimization of Pretreatment Conditions for HPLC Determination of Taurine in Milk Powder
YU Jiao-zhu1，LIN Yang1，ZHANG Hong-hong1，WANG Yun1，LIU Peng2*
（1.Shenyang Food and Drug Inspection Institute，Shenyang 110036，China;2.Shenyang Jianzhu University，Shenyang 110036，China）
Abstract： Taurine in milk powder was extracted with hydrochloric acid or potassium ferrocyanide. The content of taurine was determined by high performance liquid chromatography（HPLC）with dansulfonyl chloride as pre-column derivatization. The shoulder peak may affect the test results when using potassium ferrocyanide as the precipitation. While the impurity peaks make no differences in the spectrogram when using hydrochloric acid as the precipitation.
Key words： taurine;pretreatment method;HPLC;shoulder peak
牛磺酸（2-氨基乙磺酸）是一种非蛋白类氨基酸，它在人体内主要以游离氨基酸形式存在，具有一定的抗肿瘤活性，对提高婴幼儿机体免疫力和抗病能力有十分重要的作用[1-2]。目前国内外测定牛磺酸含量的方法有高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法、氨基酸自动分析法、薄层层析法等[3-6]。高效液相色谱法具有样品处理简单、方法精确度高和灵敏度高等特点，因此在牛磺酸含量测定中应用最为广泛。国家标准GB 5009.169—2016即规定了两种液相色谱法：第一法为OPA柱后衍生法，第二法为丹磺酰氯柱前衍生法[7]。由于第一法使用的色谱柱价格昂贵，且需要使用柱后衍生装置，对实验室要求较高，所以大多数实验室使用标准中的第二法。
笔者在用高效液相色谱法测定乳粉中的牛磺酸含量时，发现采用亚铁氰化钾沉淀的方法处理样品时，色谱图上往往出现干扰峰，容易对测定结果带来一定影响。干扰峰严重时，还需进一步调整色谱条件提高谱峰分离度进行定量，因而严重影响工作效率。
本文采用盐酸沉淀法对乳粉进行前处理，采用丹磺酰氯柱前衍生高效液相色谱法对乳粉中牛磺酸的含量进行测定，并将测试结果和亚铁氰化钾沉淀法进行对比，分析造成两种提取方式测试结果差异的原因。采用两种提取方法分别测试了三种乳粉样品中的牛磺酸含量，对比了两种方法的重现性。
1 实验部分
1.1 实验原理
牛磺酸在紫外光下没有特征吸收，先利用衍生剂丹磺酰氯和牛磺酸N-端氨基作用，得到在紫外光下具有特征吸收的牛磺酸衍生物。再用配有紫外检测器的高效液相色谱对其含量进行测定。
1.2 牛磺酸提取
1.2.1 亚铁氰化钾沉淀前处理方法
称取5 g（精确至0.01 g）样品，加入40～50 ℃温水30 mL，超声溶解。放冷至室温，加入沉淀剂150 g/L亚铁氰化钾水溶液，300 g/L乙酸锌水溶液各1 mL，用水定容至100 mL，混匀。8000 r/min转速离心5 min，取上清备用。
1.2.2 盐酸沉淀前处理方法
称取5 g（精确至0.01 g）样品于100 mL容量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液60 mL，充分摇匀，超声溶解。用2.0 mol/L乙酸钠溶液调节pH至3.9，用水定容至刻度，摇匀过滤，取上清液备用。
1.3 牛磺酸衍生
准确吸取1.00 mL上清液，加入1.00 mL碳酸钠缓冲液（pH9.5），1.00 mL丹磺酰氯-乙腈溶液（1.5 mg/mL），充分混合，室温避光衍生反应2 h，加入0.10 mL盐酸甲胺溶液（20 g/L），涡旋混合以终止反应，避光静置至沉淀完全。取上清液经0.45 μm微孔濾膜过滤，取滤液待上机。
1.4 液相色谱仪器条件
色谱柱：C18反相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：乙酸钠缓冲液（10 mmol/L）+乙腈=70+30（体积比）;检测波长：二极管阵列检测器，254 nm。
2 结果与讨论
2.1 前处理方法对牛磺酸测试谱图的影响
分别采用酸沉淀前处理方法和亚铁氰化钾沉淀前处理方法测定乳粉中的牛磺酸，相应谱图如图1～图4所示。图1为牛磺酸标准谱液相色谱图，图2、图3分别为采用盐酸沉淀前处理方法和亚铁氰化钾沉淀前处理方法测定的液相色谱图及局部放大图，图4为图3中牛磺酸谱峰和杂质峰对应的吸收光谱图。从图3可以看出，采用亚铁氰化钾沉淀前处理方法处理乳粉，牛磺酸的液相谱图中存在明显的杂质峰。对照图4可以看出，杂质峰与牛磺酸谱峰具有相似的吸收光谱。对比图2、图3局部放大图，可以看出采用亚铁氰化钾沉淀法处理的乳粉，牛磺酸谱峰峰形较差，杂质峰与牛磺酸谱峰产生包裹，造成牛磺酸谱峰出现肩峰，在积分定量时容易造成干扰从而影响测试结果的准确度。而采用盐酸沉淀法处理的乳粉，谱图中虽然存在杂质峰，但是杂质峰和牛磺酸谱峰具有较高的分离度，牛磺酸谱峰峰形对称规整，无肩峰，杂质峰不会对牛磺酸的积分定量产生干扰，因此测试结果的准确度更高。从图3谱图推断，造成肩峰的原因是亚铁氰化钾沉淀法对乳粉中的一些氨基酸和蛋白质沉淀不完全，导致这些氨基酸也参与衍生反应，并在液相色谱测试中被检出，而盐酸沉淀法对其他氨基酸和蛋白质的去除效果更好，因而在谱图中杂质峰对牛磺酸谱峰不产生干扰。 2.2 前处理方法对牛磺酸含量的影响
分别采用盐酸沉淀法和亚铁氰化钾沉淀法对三种乳粉样品进行前处理，采用丹磺酰氯柱前衍生液相色谱法进行牛磺酸含量测定，供试品编号为1#～6#，三组样品六次测定的结果如表1所示。从表格中可以看出，采用两种前处理方法得到三组乳粉样品的牛磺酸测试均值（单位mg/100g）分别为35.46，41.10，48.49和36.28，40.25，47.38，精密度分别为2.29%，3.14%，3.01%和4.52%，5.08%，4.11%。采用两种前处理方法测得的牛磺酸含量相近，均能满足测试要求。此外，采用盐酸沉淀法进行前处理得到的测试结果具有较小的精密度，说明盐酸沉淀法具有更好的数据再现性。
3 结论
本文分别采用盐酸沉淀法和亚铁氰化钾沉淀法两种前处理方法提取乳粉中的牛磺酸，采用高效液相色谱法测定牛磺酸含量。测试结果表明：相同条件下，采用盐酸沉淀法得到的液相色谱图牛磺酸谱峰峰形较好，无肩峰，色谱图上其他杂质谱峰对测试结果不产生干扰。而采用亚铁氰化钾沉淀方法得到的液相色谱图牛磺酸谱峰出现肩峰，进而影响测试结果。采用两种前处理方法得到三组乳粉样品的牛磺酸测试均值分别为35.46 mg/100 g、41.10 mg/100 g、48.49 mg/100 g和36.28 mg/100 g、40.25 mg/100 g、47.38 mg/100 g，精密度分别为2.29%、3.14%、3.01%和4.52%、5.08%、4.11%。两种前处理方法均能满足测试要求，盐酸沉淀法具有更好的数据重现性。
【参考文献】
[1] Owoeye O，Adedara I A，Farombi E O. Pretreatment with taurine prevented brain injury ndexploratory behaviour associated with administration of anticancer drug cisplatin in rats[J].Biomedicine &Pharmacotherapy，2018（102）：375-384.
[2] 富瑤，胡云东，尹冬冬.食品营养强化剂牛磺酸[J].化学教育，2006（10）：1-2.
[3] Brad McConn. Determination of taurine in energy drinks by High performance liquid chromatography[J].Concordia College Journal of Analytical Chemistry，2012（3）：47-52.
[4] 黄喆雯，唐钦强.2，4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相色谱法测定婴幼儿配方乳粉中牛磺酸含量[J].食品科学，2008（3）：415-417.
[5] Orth D L. HPLC Determination of Taurine in Sports Drinks[J].Journal of chemical education，2001（6）：791-792.
[6] 张婷，陈雷，刘芸，等.高效液相色谱-高分辨质谱法测定乳粉中的牛磺酸[J].食品安全质量检测学报，2017（6）：2086-2090.
[7] 食品中牛磺酸的测定（发布稿）：GB 5009.169—2016[S].
【作者简介】
郁蕉竹，女，1989年出生，工程师，硕士，研究方向为食品检验检测。
通讯作者：刘鹏，男，liupeng6955@126.com。