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摘要 烟草类胡萝卜素对烟叶品质和可用性有重要作用，ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS）是调控类胡萝卜素合成积累的关键酶之一。为研究ZDS基因干扰表达对烟草类胡萝卜素生物合成的影响，从贵州省烟草科学研究院福泉试验基地取样品，采用不同株系相同部位的方式取样，与贵烟1号（GY1）对照，筛选出能够构建RNA干扰（RNAi）载体并成功转化的转基因植株，建立ZDS基因的SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR的检测方法，检测新鲜烟叶中ZDS基因表达水平并分析其遗传表型的变化。结果表明，ZDS和其他类胡萝卜素合成关键酶基因的表达均下调，其遗传后代出现异于正常植株的白化与矮化的表型。证明了ZDS基因对产生这种异同发挥了作用，也充分佐证了RNAi技术在基因功能分析中有着重要的作用，但这些样品表现出白化和矮化的表型是否是由于烟草类胡萝卜素的合成受到抑制尚不确定，还需要进一步验证。
关键词 烟草类胡萝卜素；ZDS基因；实时荧光定量PCR；RNA干扰
中图分类号 Q786 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）20-0231-03
Effects on Tobacco Carotenoid Biosynthesis of Expression of ZDS Gene Interference
JIANG Lu BAN Qiu-li WANG Shan-liang
（Guizhou Anweitian Detecting Technology Co.，Ltd.，Guiyang Guizhou 550009）
Abstract Tobacco carotenoids had an important effect on leaf quality and availability.ζ-carotene desaturase（ZDS）was a key enzyme in the regulation of carotenoid biosynthesis.In order to study the interference of ZDS gene expression of carotenoid biosynthesis in tobacco，this paper took samples from Fuquan test base of Guizhou Provincial Academy of Tobacco Science，using different strains of the same parts of the sampling methods，scalding out the transformed transgenic plants of RNA interference（RNAi）vector from tobacco on the 1st（GY1）.ZDS gene SYBR Green I RTFQ RT-PCR test method was built for detecting fresh tobacco leaves ZDS gene expression levels and phenotypic analysis of genetic variation.The results showed that ZDS and other carotenoid synthesis gene expression of key enzymes decreased，and their genetic offspring albino and dwarf phenotype were different from normal plants. It proved that ZDS genes played a key role in those similarities and differences，and it also demonstrated that the RNAi technology played an important role in the analysis of gene function.But it was not sure that the albino and dwarf phenotype of these samples was due to carotenoid synthesis inhibited in tobacco and it needed further validation.
Key words tobacco carotenoid；ZDS gene；RTFQ RT-PCR；RNA interference
植物類胡萝卜素主要分布在植物叶绿体和有色体膜中，而新鲜烟叶中的类胡萝卜素主要有叶黄素、新黄质、紫黄质和β-胡萝卜素。类胡萝卜素作为许多重要的香味成分的前体，在烟味的形成过程中起着重要的作用[1-4]。高等植物类胡萝卜素生物合成途径包括异戊二烯焦磷酸生物合成、八氢番茄红素生物合成、番茄红素生物合成、胡萝卜素生物合成、叶黄素生物合成和萝卜素裂解等过程[5]。由图1可知，异戊烯焦磷酸异构酶（IPP）、牻牛儿牻牛儿基焦磷酸合成酶（GGPS）、八氢番茄红素合成酶（PSY）、八氢番茄红素脱氢酶（PDS）、ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS）、番茄红素β环化酶（LCYB）、番茄红素ε环化酶（LCYE），其均位于类胡萝卜素合成途径中生成α-胡萝卜素和β-胡萝卜素的基因上游，其中某一个基因表达异常并不能说明整个类胡萝卜素合成代谢途径异常甚至终止。因此，在研究某一个基因表达情况时，往往需要考虑其他上下游基因表达的情况。
基因表达，即DNA到蛋白质的过程。其中，蛋白质由mRNA编码而成，利用实时荧光定量RT-PCR[6-9]对其进行定量分析以获取其基因表达水平。而对于基因表达调控，通过RNA干扰[10-11]（RNAi）载体构建人为引入与內源靶基因具有相同序列的非正常双链RNA（dsRNA），从而诱导內源靶基因mRNA降解，达到阻止基因表达的目的，使细胞出现靶基因缺失的表型，引发植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默（TGS）和转录后水平的基因沉默（PTGS）。而PTGS在植物基因研究中有着极其重要的应用，比如植物基因功能分析、作物品种改良、抗病虫和抗逆性等方面[12]。在多种植物如水仙、小麦和草莓中都有ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的相关研究报道[13-15]，通过基因表型变化，鉴定该基因功能，而有关烟草中ζ-胡萝卜素脱氢酶基因特性与RNAi引起的基因沉默尚未见报道。因此，本研究针对ZDS基因干扰在烟草类胡萝卜素中的表达情况，建立高效可控的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测法，准确定量地检测ZDS基因表达水平，对研究烟草类胡萝卜素的生物合成具有重要意义。 1 材料与方法
1.1 试验材料
通过TaKaRa 公司PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synt-hesis Kit试剂盒提取的烟草cDNA模板，SYBR Premix Dimer Eraser（50×），上下游引物，ROX I，灭菌水，冰块，量程1 mL、200 μL、100 μL、20 μL、10 μL、2.5 μL的Eppendorf 移液槍及枪头，ABI公司Stepone，微孔板迷你离心机，迷你离心机，一次性医用橡胶手套与口罩，记号笔。
1.2 试验方法
参照烟草基因ZDS全序列[15]和IPP、LCYE、LCYB、内参基因Gene21的全序列，用Primer Premier V5.0软件设计引物，引物序列见表1。
使用Stepone时，设置RT-PCR反应系统为SYBRR Green Reagents，定量方法为Quantitation-Comparative Ct（ΔΔCt），程序运行速度为标准Standard，模板类型选择cDNA。各 cDNA 样品分别以ZDS、IPP、LCYE、LCYB和 Gene21引物进行定量PCR反应。反应体系为20 μL：SYBR Premix Dimer Eraser（50×）10 μL，上下游引物分别为0.6 μL，ROX I 0.4 μL，cDNA模板1 μL，灭菌水7.4 μL。反应程序采用三步法：95 ℃预变性30 s、95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s（收集信号），72 ℃延伸30 s，40次循环，溶解曲线条件为95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s（收集信号）。每个PCR反应重复2次，并且设立空白对照和非转基因GY1的对照组。在每一循环的退火阶段收集荧光信号以便进行实时检测。反应结束后得到含有所有标本的记录点曲线。在调整Baseline cycles和计算 Threshold value（阈值）后，得出循环阈值Cycle threshold （即Ct值）。
2 结果与分析
2.1 检测基因表达的准确性
样品在荧光定量 PCR 仪上扩增后，得到1条反映核酸扩增ZDS基因过程的S形荧光定量动力学曲线（图2）。用循环阈值（Ct）作为临界点，该点位于PCR产物消除荧光背景后进入指数扩增期的开始点。可以看出，荧光定量动力学曲线基线平整，指数区斜率较大且比较平滑，扩增曲线比较理想。同时，空白对照组一直保持水平线，无引物二聚体产生。
对于基因表达的准确性还必须注意到荧光PCR产物的溶解曲线，用于判断产物是否相对专一。温度升高使双链PCR产物解链，以致于不能与荧光染料SYBR Green I分子结合，荧光信号减弱。刚开始升温时荧光信号变化不大，当温度接近解链温度时，信号变化过大而出现了峰值。再加热，双链PCR产物解链，所以几乎是平的，接近解链温度Tm时，突然变化加大，所以出现峰值。再升温，产物全部解离，就又是一条直线了。在加热过程中出现一些比较矮、宽的峰（图3），这是由于非特异性产物的影响，因而这一试验数据就不能采用。若是阴性对照GY1出现非特异性产物，那么这一样品就不能作为对照，在Stepone的分析中换成溶解曲线正常的对照。图4为荧光PCR产物的溶解曲线，同一引物Tm值较稳定，有一些矮但并不宽的峰，非特异性产物不明显，基因表达结果能够说明问题。
2.2 检测基因表达的重现性
为了验证该技术方法的重复性，以同一个cDNA样品为例进行重复测定，2次重复的误差和变异系数都较小（表2）。同时从图2的S型荧光定量曲线也可看出，曲线的重复性和稳定性很好，在扩增前期，特别是在阈值附近，同一样品的曲线基本是重叠的，扩增后期即进入平台期后曲线仍比较平稳，符合S型。
2.3 ZDS基因干扰表达对烟草类胡萝卜素生物合成的影响
不同样品对烟草ZDS基因表达的影响如图5所示，其中Gene21为内参基因，GY1为非转基因对照组。诱导ZDS 基因在mRNA转录水平上的表达结果显示，样品140-7和140-10对 ZDS基因表达均明显下调，而IPP、LCYE、LCYB也同时表达下调。由图1 植物烟草类胡萝卜素的生物合成途径可知，IPP、ZDS、LCYE、LCYB均为参与烟草类胡萝卜素生物合成的重要酶之一，其中一个受到干扰，都会影响类胡萝卜素的生物合成。IPP位于ZDS的基因上游，LCYE和LCYB位于ZDS的基因下游，若ZDS基因表达下调，那么IPP基因表达的产物就会不断积累，产生负反馈调节，最终抑制了上游产物异戊烯焦磷酸的合成，而出现 IPP基因表达下调的情况。此外，ZDS基因表达受限，导致产物番茄红素含量下降，而番茄红素分别在LCYE和LCYB这2种酶的作用下生成α-胡萝卜素和β-胡萝卜素的这一代谢效率降低，产生正反馈调节，最终也抑制了α-胡萝卜素和β-胡萝卜素酶的合成，而出现LCYE和LCYB基因表达下调的情况。若这种猜测成立，将更好地解释分子生物学中基因沉默的规律变化。
从图5还可看出，样品140-7的基因相对表达量较 140-10的相对表达量低，说明干扰载体对140-7的ZDS基因的干扰效率较140-10的高。通过RNAi载体构建得到的烟草转基因阳性植株，其种子在营养基质中播种后，与对照样品GY1比较，140-7出现大面积的白化和矮化表型，140-10出现部分的白化，矮化暂不明显（图6）。由此表明，通过RNAi这一技术降低烟草中ZDS基因的表达后，使得其与正常植株相比表现出了异同，证明ZDS对产生这种异同发挥了作用。3 结论与讨论
采用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR展开ZDS基（下转第235页）
（上接第233页）
因干扰表达试验，结果表明，ZDS基因表达下调，其他关键酶基因也随之下调，说明ZDS基因干扰表达能够影响烟草类胡萝卜素的生物合成。通过RNAi这一技术使得烟草中ZDS基因的表达水平降低，出现了异于正常植株的表型变化，证明了ZDS对产生这种异同发挥作用。本试验定量检测了ZDS基因干扰表达对烟草类胡萝卜素的生物合成的影响，对阐明烟草类胡萝卜素中致香前体物合成途径所需的关键酶基因表达以及功能具有重要的借鉴作用。
关键词 烟草类胡萝卜素；ZDS基因；实时荧光定量PCR；RNA干扰
中图分类号 Q786 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）20-0231-03
Effects on Tobacco Carotenoid Biosynthesis of Expression of ZDS Gene Interference
JIANG Lu BAN Qiu-li WANG Shan-liang
（Guizhou Anweitian Detecting Technology Co.，Ltd.，Guiyang Guizhou 550009）
Abstract Tobacco carotenoids had an important effect on leaf quality and availability.ζ-carotene desaturase（ZDS）was a key enzyme in the regulation of carotenoid biosynthesis.In order to study the interference of ZDS gene expression of carotenoid biosynthesis in tobacco，this paper took samples from Fuquan test base of Guizhou Provincial Academy of Tobacco Science，using different strains of the same parts of the sampling methods，scalding out the transformed transgenic plants of RNA interference（RNAi）vector from tobacco on the 1st（GY1）.ZDS gene SYBR Green I RTFQ RT-PCR test method was built for detecting fresh tobacco leaves ZDS gene expression levels and phenotypic analysis of genetic variation.The results showed that ZDS and other carotenoid synthesis gene expression of key enzymes decreased，and their genetic offspring albino and dwarf phenotype were different from normal plants. It proved that ZDS genes played a key role in those similarities and differences，and it also demonstrated that the RNAi technology played an important role in the analysis of gene function.But it was not sure that the albino and dwarf phenotype of these samples was due to carotenoid synthesis inhibited in tobacco and it needed further validation.
Key words tobacco carotenoid；ZDS gene；RTFQ RT-PCR；RNA interference
植物類胡萝卜素主要分布在植物叶绿体和有色体膜中，而新鲜烟叶中的类胡萝卜素主要有叶黄素、新黄质、紫黄质和β-胡萝卜素。类胡萝卜素作为许多重要的香味成分的前体，在烟味的形成过程中起着重要的作用[1-4]。高等植物类胡萝卜素生物合成途径包括异戊二烯焦磷酸生物合成、八氢番茄红素生物合成、番茄红素生物合成、胡萝卜素生物合成、叶黄素生物合成和萝卜素裂解等过程[5]。由图1可知，异戊烯焦磷酸异构酶（IPP）、牻牛儿牻牛儿基焦磷酸合成酶（GGPS）、八氢番茄红素合成酶（PSY）、八氢番茄红素脱氢酶（PDS）、ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS）、番茄红素β环化酶（LCYB）、番茄红素ε环化酶（LCYE），其均位于类胡萝卜素合成途径中生成α-胡萝卜素和β-胡萝卜素的基因上游，其中某一个基因表达异常并不能说明整个类胡萝卜素合成代谢途径异常甚至终止。因此，在研究某一个基因表达情况时，往往需要考虑其他上下游基因表达的情况。
基因表达，即DNA到蛋白质的过程。其中，蛋白质由mRNA编码而成，利用实时荧光定量RT-PCR[6-9]对其进行定量分析以获取其基因表达水平。而对于基因表达调控，通过RNA干扰[10-11]（RNAi）载体构建人为引入与內源靶基因具有相同序列的非正常双链RNA（dsRNA），从而诱导內源靶基因mRNA降解，达到阻止基因表达的目的，使细胞出现靶基因缺失的表型，引发植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默（TGS）和转录后水平的基因沉默（PTGS）。而PTGS在植物基因研究中有着极其重要的应用，比如植物基因功能分析、作物品种改良、抗病虫和抗逆性等方面[12]。在多种植物如水仙、小麦和草莓中都有ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的相关研究报道[13-15]，通过基因表型变化，鉴定该基因功能，而有关烟草中ζ-胡萝卜素脱氢酶基因特性与RNAi引起的基因沉默尚未见报道。因此，本研究针对ZDS基因干扰在烟草类胡萝卜素中的表达情况，建立高效可控的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测法，准确定量地检测ZDS基因表达水平，对研究烟草类胡萝卜素的生物合成具有重要意义。 1 材料与方法
1.1 试验材料
通过TaKaRa 公司PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synt-hesis Kit试剂盒提取的烟草cDNA模板，SYBR Premix Dimer Eraser（50×），上下游引物，ROX I，灭菌水，冰块，量程1 mL、200 μL、100 μL、20 μL、10 μL、2.5 μL的Eppendorf 移液槍及枪头，ABI公司Stepone，微孔板迷你离心机，迷你离心机，一次性医用橡胶手套与口罩，记号笔。
1.2 试验方法
参照烟草基因ZDS全序列[15]和IPP、LCYE、LCYB、内参基因Gene21的全序列，用Primer Premier V5.0软件设计引物，引物序列见表1。
使用Stepone时，设置RT-PCR反应系统为SYBRR Green Reagents，定量方法为Quantitation-Comparative Ct（ΔΔCt），程序运行速度为标准Standard，模板类型选择cDNA。各 cDNA 样品分别以ZDS、IPP、LCYE、LCYB和 Gene21引物进行定量PCR反应。反应体系为20 μL：SYBR Premix Dimer Eraser（50×）10 μL，上下游引物分别为0.6 μL，ROX I 0.4 μL，cDNA模板1 μL，灭菌水7.4 μL。反应程序采用三步法：95 ℃预变性30 s、95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s（收集信号），72 ℃延伸30 s，40次循环，溶解曲线条件为95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s（收集信号）。每个PCR反应重复2次，并且设立空白对照和非转基因GY1的对照组。在每一循环的退火阶段收集荧光信号以便进行实时检测。反应结束后得到含有所有标本的记录点曲线。在调整Baseline cycles和计算 Threshold value（阈值）后，得出循环阈值Cycle threshold （即Ct值）。
2 结果与分析
2.1 检测基因表达的准确性
样品在荧光定量 PCR 仪上扩增后，得到1条反映核酸扩增ZDS基因过程的S形荧光定量动力学曲线（图2）。用循环阈值（Ct）作为临界点，该点位于PCR产物消除荧光背景后进入指数扩增期的开始点。可以看出，荧光定量动力学曲线基线平整，指数区斜率较大且比较平滑，扩增曲线比较理想。同时，空白对照组一直保持水平线，无引物二聚体产生。
对于基因表达的准确性还必须注意到荧光PCR产物的溶解曲线，用于判断产物是否相对专一。温度升高使双链PCR产物解链，以致于不能与荧光染料SYBR Green I分子结合，荧光信号减弱。刚开始升温时荧光信号变化不大，当温度接近解链温度时，信号变化过大而出现了峰值。再加热，双链PCR产物解链，所以几乎是平的，接近解链温度Tm时，突然变化加大，所以出现峰值。再升温，产物全部解离，就又是一条直线了。在加热过程中出现一些比较矮、宽的峰（图3），这是由于非特异性产物的影响，因而这一试验数据就不能采用。若是阴性对照GY1出现非特异性产物，那么这一样品就不能作为对照，在Stepone的分析中换成溶解曲线正常的对照。图4为荧光PCR产物的溶解曲线，同一引物Tm值较稳定，有一些矮但并不宽的峰，非特异性产物不明显，基因表达结果能够说明问题。
2.2 检测基因表达的重现性
为了验证该技术方法的重复性，以同一个cDNA样品为例进行重复测定，2次重复的误差和变异系数都较小（表2）。同时从图2的S型荧光定量曲线也可看出，曲线的重复性和稳定性很好，在扩增前期，特别是在阈值附近，同一样品的曲线基本是重叠的，扩增后期即进入平台期后曲线仍比较平稳，符合S型。
2.3 ZDS基因干扰表达对烟草类胡萝卜素生物合成的影响
不同样品对烟草ZDS基因表达的影响如图5所示，其中Gene21为内参基因，GY1为非转基因对照组。诱导ZDS 基因在mRNA转录水平上的表达结果显示，样品140-7和140-10对 ZDS基因表达均明显下调，而IPP、LCYE、LCYB也同时表达下调。由图1 植物烟草类胡萝卜素的生物合成途径可知，IPP、ZDS、LCYE、LCYB均为参与烟草类胡萝卜素生物合成的重要酶之一，其中一个受到干扰，都会影响类胡萝卜素的生物合成。IPP位于ZDS的基因上游，LCYE和LCYB位于ZDS的基因下游，若ZDS基因表达下调，那么IPP基因表达的产物就会不断积累，产生负反馈调节，最终抑制了上游产物异戊烯焦磷酸的合成，而出现 IPP基因表达下调的情况。此外，ZDS基因表达受限，导致产物番茄红素含量下降，而番茄红素分别在LCYE和LCYB这2种酶的作用下生成α-胡萝卜素和β-胡萝卜素的这一代谢效率降低，产生正反馈调节，最终也抑制了α-胡萝卜素和β-胡萝卜素酶的合成，而出现LCYE和LCYB基因表达下调的情况。若这种猜测成立，将更好地解释分子生物学中基因沉默的规律变化。
从图5还可看出，样品140-7的基因相对表达量较 140-10的相对表达量低，说明干扰载体对140-7的ZDS基因的干扰效率较140-10的高。通过RNAi载体构建得到的烟草转基因阳性植株，其种子在营养基质中播种后，与对照样品GY1比较，140-7出现大面积的白化和矮化表型，140-10出现部分的白化，矮化暂不明显（图6）。由此表明，通过RNAi这一技术降低烟草中ZDS基因的表达后，使得其与正常植株相比表现出了异同，证明ZDS对产生这种异同发挥了作用。3 结论与讨论
采用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR展开ZDS基（下转第235页）
（上接第233页）
因干扰表达试验，结果表明，ZDS基因表达下调，其他关键酶基因也随之下调，说明ZDS基因干扰表达能够影响烟草类胡萝卜素的生物合成。通过RNAi这一技术使得烟草中ZDS基因的表达水平降低，出现了异于正常植株的表型变化，证明了ZDS对产生这种异同发挥作用。本试验定量检测了ZDS基因干扰表达对烟草类胡萝卜素的生物合成的影响，对阐明烟草类胡萝卜素中致香前体物合成途径所需的关键酶基因表达以及功能具有重要的借鉴作用。