目的:探索一种简单快速无需分开表皮和真皮即可分离得到人表皮角质形成细胞(KC)并进行体外培养的方法。方法:取皮肤组织切碎后,先用含分散酶和Ⅰ型胶原酶的消化液37℃浸泡60 min,然后加入胰酶消化30 min,再加入DNA酶继续消化5 min以获得单个细胞;加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中和消化,用100μm细胞过滤器过滤,离心后,用含10 mmol/L Rock蛋白激酶抑制剂的DMEM培养基(含10%FBS)培养,3 d后换成Cn T07培养基。每2 d换液1次,培养过程中,观察细胞生长状态。结果:与传统分散酶分离表皮KC方法相比,用该方法分离得到的表皮KC数量较多,第1代以克隆形式生长并且生长较快;传代后细胞呈角质细胞形态,主要表达未分化的角质蛋白K5,生长曲线和形成单细胞克隆能力和传统分离的表皮KC相近,并稍优于传统方法。采用新方法成功地从带毛发的头皮组织分离出大量的表皮KC并表达正常的角质蛋白。结论:该法得到的表皮KC形态、生长状态及形成单克隆的能力都接近或优于传统方法。该方法简单高效,具有较高的实用价值,尤其为以后临床上大量分离患者的表皮KC用于细胞治疗奠定基础。