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摘 要：建立一种采用微生物显色法对动物源性食品中抗生素残留进行初筛，之后再结合高效液相色谱-质谱（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）法对阳性样品进行复测的分析检验方法。利用大肠杆菌（E.coli）作为指示菌，制备96微孔板，选取pH 7.4磷酸钠-乙腈缓冲液进行提取，以反应液150 μL、菌液50 μL（初始A600 nm0.4左右）、样品提取液100 μL作为检测体系，可同时检测15 种喹诺酮类药物。结果表明：所建立的微生物显色法操作简便、快捷、成本低，结果准确且易判断，对动物源性食品中喹诺酮类药物检出限为40～200 μg/kg，符合国内外对抗生素残留限量的要求。对50 份动物源性样品进行检测，其结果与HPLC-MS复测结果一致，说明该微生物法稳定性良好，可用于动物源性食品中喹诺酮类药物残留的初筛检测。
关键词：微生物显色法；高效液相色谱-质谱法；喹诺酮类药物；动物源性食品
Abstract： A new microbial chromogenic assay was developed to analyze antibiotic residues in animal-derived food and after that， the positive samples were identified by a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric （HPLC-MS） method. E.coli was used as the indicator strain to produce a 96-well microplate for detecting 15 kinds of quinolones. Muscle samples were extracted by pH 7.4 phosphate-acetonitrile buffer. This system of microbial chromogenic assay consisted of 150 μL the reaction solution， 50 μL of bacterial suspension （the initial A600 nm value was around 0.4）， and
100 μL of the extract solution. The assay proved to be simple and cheap and the results were accurate and easy to interpret. The detection limits for 15 kinds of quinolones drugs were 40?200 μg/kg， meeting the domestic and international requirements for the determination of antibiotic residue limits. Consistent results were obtained for 50 samples of animal-derived food by microbial chromogenic assay and HPLC-MS， indicating that the assay could be used to detect antibiotic residues in animal-derived food with good stability.
Key words： microbial chromogenic assay； high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS）； quinolones； animal-derived food
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201704007
中国分类号：TS252.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2017）04-0036-07
引文格式：
范维， 高晓月， 陈超， 等. 动物源性食品中喹诺酮类药物残留的检测[J]. 肉类研究， 2017， 31（4）： 36-42. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201704007. http：//www.rlyj.pub
FAN Wei， GAO Xiaoyue， CHEN Chao， et al. Screening and confirmation of quinolones residues in animal-derived food[J]. Meat Research， 2017， 31（4）： 36-42. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201704007. http：//www.rlyj.pub
喹诺酮类药物（quinolones，QNs）是人工合成的具有1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸结构的一类药物总称[1]。该药作为抗生素使用已有超過50 年的历史，主要通过阻断特异性拓扑酶，抑制细菌DNA复制从而发挥抗菌作用[2]，该药具有价格低廉、抗菌谱广、无交叉耐药性等优点，广泛应用在临床及养殖领域。但喹诺酮类药物常有不合理使用和滥用的情况发生，使其或其代谢产物残留于动物的肌肉和脏器组织中，进而通过食物链导致人体产生抗药性，影响疾病治疗与康复，引起严重的食品安全问题和出口贸易问题[3]。因此，喹诺酮类药物残留问题越来越引起人们的重视。 目前，畜禽肉中检测抗生素残留方法主要有微生物检测法[4-5]、色谱法[6-7]和免疫分析法[8]等。其中色谱法较为常用，可以进行定性定量检测，结果灵敏准确，但设备投入大，人员技能要求高，适合大型综合性实验室进行仲裁判定和确证[9-10]；免疫分析法虽灵敏度高，但是检测成本昂贵，只能检测单一抗生素[11]，不易于推广；相较于前2 种方法，微生物法敏感性强、成本低廉、操作简单，可作为一种抗生素初筛方法应用在农产品安全监管环节，并可在中小型企业得到普及。因此，本研究建立了一种快速对动物源性食品中喹诺酮类药物残留进行初筛的微生物显色方法，并可根据具体需要进行色谱法复测，使结果更加准确可靠。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大肠杆菌（E.coli） 中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC1.1369）；禽畜肉购于超市，经检验不含喹诺酮类药物残留。
奥比沙星（orbifloxacin，ORB）、丹诺沙星（danofloxacin，DAN）、二氟沙星（difloxacin，DIF）、恶喹酸（oxolinic，OXO）、恩诺沙星（enrofloxacin，ENR）、氟甲喹（flumequine，FLU）、氟罗沙星（fleroxacin，FLE）、环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、洛美沙星（lomefloxacin，LOM）、诺氟沙星（norfloxacin，NOR）、培氟沙星（pefloxacin，PEF）、沙拉沙星（sarafloxacin，SAR）、司帕沙星（sparfloxacin，SPA）、氧氟沙星（ofloxacin，OFL）、依诺沙星（enoxacin，ENO）标
准品 德国Dr.Ehrenstorfer公司；蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、牛肉粉、葡萄糖、琼脂、营养肉汤、营养琼脂、溴甲酚紫 北京陆桥技术有限责任公司；甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯；其他试剂均为分析纯。
培养基：1）固体培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏3.0 g、NaCl 5.0 g、琼脂15.0 g溶于1 000 mL蒸馏水中，用NaOH溶液调pH值为7.3，121 ℃高压灭菌15 min。2）液体培养基：胰蛋白胨10.0 g、葡萄糖2.0 g、牛心粉5.0 g、NaCl 5.0 g、蒸馏水1 000 mL，用Na2HPO4·12 H2O溶液调pH值为7.4，121 ℃高压灭菌15 min。3）检测液：蛋白胨10.0 g、牛肉浸膏3.0 g、葡萄糖10.0 g、NaCl 5.0 g、溴甲酚紫指示剂0.04 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH值调至7.0，121 ℃高压灭菌15 min。
1.2 仪器与设备
SYNERGY H4酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；DHP-9272恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；UltiMate3000-TSQ QUANTUM ULTRA液相色谱-质谱联用仪（配有电喷雾离子源） 美国Thermo公司；SCR20BA离心机 日本日立仪器有限公司；PHS-3C pH计
上海雷韵仪器有限公司；ESJ120-4电子天平 龙腾仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 溶液配制
抗生素标准储备液：将15 种喹诺酮标准品分别称取0.010 0 g，置于10.0 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成质量浓度为1 mg/mL的标准储备液，
-20 ℃可保存3 个月。
混合标准工作液：将以上各标准储备液稀释，配成混合标准溶液，各组分质量浓度为10 μg/mL，4 ℃条件下可保存3 个月。
不同pH值磷酸钠缓冲溶液：A液：称取72 g Na2HPO4·12H2O，用去离子水定容至1 000 mL。B液：称取31 g NaH2PO4·2H2O，用去离子水定容至1 000 mL。pH 6.8：取A液49.5 mL和B液50.0 mL进行混合；pH 7.0：取A液61.0 mL和B液39.0 mL进行混合；pH 7.4：取A液81 mL和B液19 mL进行混合；pH 8.0：取A液94.7 mL和B液5.3 mL进行混合。
磷酸钠-乙腈缓冲液：将不同pH值的磷酸钠缓冲溶液和乙腈等体积混合。
磷酸钠-丙酮缓冲液：将不同pH值的磷酸钠缓冲溶液和丙酮等体积混合。
1.3.2 样品预处理
1.3.2.1 微生物显色法
称取8 份均质好的10 g鲜肉样品（精确到0.1 g）于50 mL离心管中，分别向其中4 份加入10 mL pH值为6.8、7.0、7.4、8.0的磷酸鈉-乙腈缓冲溶液，其余4 份各加入10 mL不同pH值的磷酸钠-丙酮缓冲溶液，漩涡振荡3 min，开盖置于70 ℃水浴中加热10 min，5 000 r/min离心3 min，取上清液用于微生物检测。
1.3.2.2 高效液相色谱-质谱（high performance liquid chroma-mass spectrography，HPLC-MS）法
样品参照GB/T 21312—2007[12]进行前处理。
1.3.3 微生物显色法检测
1.3.3.1 微生物初始浓度及检测体系组成比例的确定
无菌状态下，从固体培养基上挑取已培养24 h的嗜热脂肪芽孢杆菌菌落，接入液体培养基中，分别配成吸光度（A600 nm）为0.1、0.4、0.6、0.8、1.0的菌悬液。取96孔板，将各菌悬液分别加入到以下3 组体系中，A组为检测液180 μL、菌悬液20 μL、生理盐水100 μL；B组为检测液150 μL、菌悬液50 μL、生理盐水100 μL、C组为检测液100 μL、菌悬液100 μL、生理盐水100 μL。于36 ℃恒温箱中培养，确定各组变色（反应液由紫变黄）时间。将变色时间较短的组合中生理盐水换成0.1 μg/mL恩诺沙星标准溶液，进行抗生素敏感度实验，于36 ℃条件下恒温培养，观察变色情况，选出结果呈阳性组（检测液紫色为阳性，黄色为阴性），最终优化出最适的微生物初始浓度和检测体系组成比例。 1.3.3.2 微生物显色法检测程序
取96孔板，按1.3.3.1节优化的比例，在第1列只加入检测液，在第2～12列加入检测液和菌悬液，之后在第2列加入无抗生素的鲜肉提取液，在第3～12列加入不同抗生素标准液或样品提取液，于36 ℃条件下恒温培养至第2列变成黄色，观察其他列颜色变化。
1.3.3.3 微生物显色法检出限的确定
用去离子水将15 种抗生素标准储备液分别稀释成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 μg/mL共10 个梯度，以注射的方式加入到无抗生素鲜肉中，静置使其充分吸收。按上述微生物法进行检测，确定各种抗生素检出限。
1.3.3.4 指示菌传代稳定性的确定
将大肠杆菌连续传代至第5代，用各代菌对恩诺沙星、沙拉沙星、氟甲喹和二氟沙星的检出限进行测定，并确定反应时间，以此判断指示菌的传代稳定性。
1.3.4 HPLC-MS法检测
1.3.4.1 检测条件
样品参照GB/T 21312—2007《动物源性食品中14 种喹诺酮药物残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》[12]，运用UltiMate 3000-TSQ QUANTUM ULTRA液相色谱-质谱联用仪进行检测。
1.3.4.2 HPLC-MS法标准曲线及检出限确定
将混合标准工作液配制成0.005、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 μg/mL共6 个梯度，用上述色谱条件进行测定，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。并以3 倍信噪比（RS/N=3）确定其方法检出限，10 倍信噪比（RS/N=10）确定其定量限。
1.3.5 样品测定
将无喹诺酮类药物残留的鲜肉样品（猪肉20 份、牛肉10 份、羊肉10 份、禽肉10 份），分别用序号1～50标识。随机从中抽取15 个样品，每个样品注射1 种一定浓度（该种抗生素国家规定的最大残留限量值）的喹诺酮类药物，用微生物法和HPLC-MS法同时对50 个样品中喹诺酮类药物残留进行检测。
2 结果与分析
2.1 微生物法提取缓冲液的确定
本实验所用指示剂为溴甲酚紫，其变色范围是pH值6.8（紫色）～5.6（黄色），而市售鲜肉的pH值一般在6.6～5.8之间，肉汁本身酸碱性对检测液变色效果影响较大[13-14]。实验选取不同pH值的磷酸盐缓冲溶液和有机试剂进行组合，对样品进行前处理，结果见表1。
由表1可知，当提取液pH值小于7.4时，鲜肉提取液加入到检测体系中，会使检测液瞬间变黄；当提取液pH值较高时，则会延长反应时间。选用乙腈作为蛋白沉淀剂效果较好且反应时间较丙酮短，可能由于乙腈对大肠杆菌活性影响较小[15-17]。因此，选取pH值为7.4的磷酸钠-乙腈缓冲溶液对样品中的喹诺酮药物进行提取。
2.2 微生物初始浓度及检测体系的确定
用生理盐水作为样品提取液按比例加入到检测体系中，确定菌悬液浓度和检测体系组成比例对反应时间的影响，结果见表2。
由表2可知，当菌悬液初始吸光度A600 nm≥0.4时，B、C两组反应时间较短，均能在4 h内变色，因此用这2 组进行抗生素敏感度实验，结果见表3。
由表3可知，菌悬液初始吸光度较高或加入菌悬液体积较大时，抗生素对菌的抑制效果不明显，反应液变为黄色，达不到检测目的，因此选择A600 nm为0.4作为菌悬液初始吸光度，反应液150 μL、菌悬液50 μL、样品提取液100 μL作为检测体系。该法比传统平板法省时省力，采用指示剂显色作为判别标准也比抑菌圈更易于观察，满足快速检测的要求。
2.3 微生物显色法的检出限
按1.3.3.3节方法进行检测，以颜色未发生变化的标准液浓度为该抗生素的最小检测浓度，结果见表4。
由表4可知，本方法各类抗生素检出限均小于我国农业部规定的动物性食品中兽药最高残留限量[18]，虽然检出的阴性样品中可能含有抗生素，但其含量低于最高残留限量，依然是合格产品，因此该法可以满足初筛检测的要求。其中对恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星较为敏感，检出限为60 μg/kg，这与沈翠香[19]的研究结果相似。本研究选用的指示剂溴甲酚紫，颜色变化明显，易用肉眼区分。当样品中没有抗生素残留或是抗生素残留低于检出值时，大肠杆菌在36 ℃条件下快速生长产酸，使检测体系pH值下降，导致指示剂由紫色变成黄色；反之，若抗生素残留浓度高于检出值，则会抑制检测菌的生长，使得檢测体系的pH值基本保持不变，指示剂不会变色[20-22]。本研究所采用的96微孔板，除去空白对照列，还有80多个孔可以用于样品检测，即便采用4 次重复，仍然可以同时对20 个样品进行检测，并且可以对多种抗生素成分进行筛检，是一种高通量的微生物检测方法。
2.4 指示菌传代稳定性
由表5可知，对于同一种抗生素，各代菌测定的检出限相同，说明前5 代菌对抗生素的敏感程度一致。从反应时间来看，第1代菌所需反应时间略长，后几代菌的反应时间趋于稳定，5 代菌均能在3～4 h内使指示剂变色。因此，前5 代菌具有较好的稳定性，均可以用于微生物显色法检测。
2.5 HPLC-MS法检出限
将不同质量浓度的抗生素标准溶液分别在上述色谱条件下进行测定，15 种抗生素的质量浓度在0.005～0.1 μg/mL范围内，与其峰面积呈良好线性关系（R2>0.991），满足定量要求，其标准品色谱图见图1，
图1A～O分别为15 种喹诺酮类药物的多反应检测（multiple reaction monitoring，MRM）色谱图，检出限结果如表4所示。色谱法灵敏度较高，其检出限远小于国家规定的兽药最大残留限量，这就导致一些含有极少抗生素的合格样品被检测出来，造成时间和成本的浪费。相较于色谱法，微生物显色法的检出限更接近最大残留限量，因此用微生物法初筛呈阳性的样品更有可能是不合格样品，之后将这些阳性样品用色谱法进行复测，可以节约时间和成本。 由表6可知，微生物法检测共有18 个样品呈阳性，经HPLC-MS复测，其中15 个阳性样品含有喹诺酮类药物，其余3个为假阳性样品，据研究[23-26]大肠杆菌除对喹诺酮药物敏感外，对庆大霉素、链霉素、卡那霉素及青霉素类药物也有较高的敏感性，因此3 个假阳性样品存在含有其他抗生素残留的可能。而微生物法检测呈阴性的32 个样品，经HPLC-MS法验证，没有测出喹诺酮类药物残留，说明该微生物显色法结果较可靠，虽存在一定的假阳性结果，但只要抗生素残留量超过其方法检出限，无假阴性结果存在。
3 结 论
本研究选用的大肠杆菌对喹诺酮类药物具有较高敏感性，且产酸迅速，是一種理想的抗生素快速检测菌，按本研究优化的菌悬液初始浓度及检测体系进行实验，可在3～4 h内使指示剂变色，比传统平板法省时省力[27]。
该方法采用96孔板，可以在一个板上同时对几十个样品进行筛选，用指示剂显色作为判别标准也比传统抑菌圈便于观察[28-30]。该微生物显色法检测成本较低，检测一个样品成本不到1 元，是一种快捷、简单、低成本的检测方法。用HPLC-MS法对微生物法筛检出的32 个阴性样品进行检测，15 种抗生素均未被检出，说明本研究建立的微生物显色法结果可靠，没有假阴性。因此可以采用该微生物显色法对样品中喹诺酮类药物进行初筛，再以色谱法对呈阳性的样品进行检测，以便减少工作量和提高检测效率，这将在普通的检测实验室具有良好的应用前景。
参考文献：
[1] 张元， 周伟娥， 李绍辉， 等. 动物源性食品中喹诺酮类残留前处理及分析方法的研究[J]. 食品工业科技， 2016， 37（5）： 378-281. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.069.
[2] 林黎， 张毅， 涂小珂， 等. 液相色谱-串联质谱法同时测定化妆品中的25 种喹诺酮类药物[J]. 色谱， 2015， 33（3）： 275-281.
[3] SEIDEL J， CLARKE T， MATHEW B. To cipro or not to cipro bilateral achilles ruptures with the use of quinolones[J]. Journal of the American Podiatric Medical Association， 2015， 105（2）： 185-188.
[4] PIKKEMAAT M G， DIJK S O， SCHOUTEN J， et al. A new microbial screening method for the detection of antimicrobial residues in slaughter animals： the Nouws antibiotic test （NAT-screening）[J]. Food Additives and Contaminants， 2008， 19（3）： 781-789. DOI：10.1080/19440049.2010.535027.
[5] PIKKEMAAT M G. Microbial screening methods for detection of antibiotic residues in slaughter animals[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry， 2009， 395（5）： 893-905. DOI：10.1080/19440049.2010.535027.
[6] 农以宁， 蔡江帆， 蒙肇云， 等. SPE-HPLC法同时测定猪肉中常见抗生素和克伦特罗的研究[J]. 桂林电子科技大学学报， 2009， 29（5）： 406-409. DOI：10.3969/j.issn.1673-808X.2009.05.009.
[7] 许蔚， 辛志宏， 张晓燕， 等. LC-MS/MS法测定蜂花粉中18 种喹诺酮类药物残留[J]. 环境化学， 2015， 34（4）： 810-813.
[8] 中华人民共和国农业部. 农业部1025号公告—2008 动物性食品中磺胺类药物残留检测酶联免疫吸附法[EB/OL]. （2008-05-10）
[2017-03-06]. http：//www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/gg/200805/t20080509_1036076.htm.
[9] PENG Y， HUANG Y C， CAI Y M. Screening for Streptomyces hygroscopicus strains with high production of agricultural antibiotics by streptomycin resistance[J]. Agricultural Science and Technology， 2008， 9（1）： 146-149.
[10] 卢坤， 童群义.动物源性食品中抗生素残留检测技术研究进展[J]. 广州化工， 2015， 43（12）： 13-14. DOI：10.3969/j.issn.1001-9677.2015.12.006.
[11] ZHANG Yulan， LU Shengxin， LIU Wei， et al. Preparation of anti-tetracycline antibodies and development of an indirect heterologous competitive enzyme-linked immunosorbent assay to detect residues of tetracycline in milk[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2007， 55（6）： 211-218. DOI：10.1021/jf062627s. [12] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局， 中国国家标准化管理委员会. GB/T 21312—2007 动物源性食品中14 种喹诺酮药物残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法[S]. 北京： 中国标准出版社， 2007.
[13] 李周敏， 孙艳艳， 姚开安， 等. 动物源性食品中抗生素残留检测前处理及其分析方法研究进展[J]. 药物分析杂志， 2013， 33（6）： 901-903. DOI：10.16155/j.0254-1793.2013.06.002.
[14] 潘媛， 牛华， 程晓云， 等. 動物源性食品中六种氟喹诺酮类残留检测前处理的优化[J]. 中国兽药杂志， 2011， 45（4）： 28-30.
[15] 王永乐. 大肠杆菌对有机溶剂的耐受性研究[D]. 天津： 天津科技大学， 2008： 28-35.
[16] 王永乐， 王敏， 申雁冰， 等. 有机溶剂对大肠杆菌细胞膜的影响[J]. 天津科技大学学报， 2008， 23（4）： 41-44.
[17] ADRIAN J， FERN?NDEZ F， S?NCHEZ-BAEZA F， et al. Preparation of antibodies and development of an enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） for the detemination of doxycycline antibiotic in milk samples[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2012， 57： 3837-3840.
[18] 中华人民共和国农业部. 235号公告 动物性食品中兽药最高残留限量 [EB/OL]. （2002-12-24）[2017-03-06]. http：//www.aqsiq.gov.cn/xxgk_13386/jgfl/jckspaqj/ywxx/201210/t20121016_252217.htm.
[19] 沈翠香. 微生物抑制法检测动物性食品中喹诺酮类药物残留的研究[D]. 新疆： 新疆农业大学， 2010： 22-28.
[20] 刘兴泉， 冯震， 姚蕾， 等. 采用高通量微生物法和HPLC法检测猪肉中四环素和磺胺类抗生素残留[J]. 食品与发酵工业， 2011， 37（4）： 194-197.
[21] 张亚丽， 哈婧， 赵静， 等. 动物组织中抗生素残留研究进展[J]. 河北科技大学学报， 2013， 34（6）： 517-520. DOI：10.7535/hbkd.2013yx06004.
[22] TAJICK M A， SHOHREH B. Detection of antibiotics residue in chicken meat using TLC[J]. International Journal of Poultry Science， 2006， 5（7）： 611-612.
[23] 席会平， 符明淳， 郭利兵， 等. 乳、肉制品中氟喹诺酮类抗生素残留检测研究[J]. 河南科学， 2007， 25（5）： 748-752. DOI：10.3969/j.issn.1004-3918.2007.05.017.
[24] 施奉英， 郭鑫， 杨汉春， 等.猪源大肠杆菌对20 种抗生素的敏感试验[J]. 中国兽医杂志， 2007， 43（8）： 8-9. DOI：10.3969/j.issn.0529-6005.2007.08.003.
[25] ESPINOSA-MANSILLA A， de la PENA A M， GOMEZ D G， et al.
Determination of fluoroquinolones in urine and serum by using high performance liquid chromatography and multiemission scan fluorimetric detection[J]. Talanta， 2006， 68： 1215-1221.
[26] LINDER J A， HUANG E S， STEINMAN M A， et al. Fluoroquinolone prescribing in the United States[J]. American Journal of Medicine， 2005， 118（3）： 259-268.
[27] 徐品. 动物源性食品中抗生素残留微生物学检测的方法与进展[J]. 职业与健康， 2010， 26（9）： 1057-1058.
[28] RENATA Z， JOANA S. An evaluation of different microbial and rapid tests for determining inhibitors in milk[J]. Food Control， 2007， 18（5）： 541-547.
[29] 刘兴泉， 冯震， 姚蕾， 等. 采用高通量微生物法检测四种抗生素在鸡蛋中的残留[J]. 现代食品科技， 2011， 27（4）： 465-467. DOI：10.13982/j.mfst.1673-9078.2011.04.004.
[30] 王民权. 水产品中恩诺沙星、氯霉素残留初检技术研究[D]. 上海： 上海水产大学， 2005： 16-34.
关键词：微生物显色法；高效液相色谱-质谱法；喹诺酮类药物；动物源性食品
Abstract： A new microbial chromogenic assay was developed to analyze antibiotic residues in animal-derived food and after that， the positive samples were identified by a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric （HPLC-MS） method. E.coli was used as the indicator strain to produce a 96-well microplate for detecting 15 kinds of quinolones. Muscle samples were extracted by pH 7.4 phosphate-acetonitrile buffer. This system of microbial chromogenic assay consisted of 150 μL the reaction solution， 50 μL of bacterial suspension （the initial A600 nm value was around 0.4）， and
100 μL of the extract solution. The assay proved to be simple and cheap and the results were accurate and easy to interpret. The detection limits for 15 kinds of quinolones drugs were 40?200 μg/kg， meeting the domestic and international requirements for the determination of antibiotic residue limits. Consistent results were obtained for 50 samples of animal-derived food by microbial chromogenic assay and HPLC-MS， indicating that the assay could be used to detect antibiotic residues in animal-derived food with good stability.
Key words： microbial chromogenic assay； high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS）； quinolones； animal-derived food
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201704007
中国分类号：TS252.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2017）04-0036-07
引文格式：
范维， 高晓月， 陈超， 等. 动物源性食品中喹诺酮类药物残留的检测[J]. 肉类研究， 2017， 31（4）： 36-42. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201704007. http：//www.rlyj.pub
FAN Wei， GAO Xiaoyue， CHEN Chao， et al. Screening and confirmation of quinolones residues in animal-derived food[J]. Meat Research， 2017， 31（4）： 36-42. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201704007. http：//www.rlyj.pub
喹诺酮类药物（quinolones，QNs）是人工合成的具有1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸结构的一类药物总称[1]。该药作为抗生素使用已有超過50 年的历史，主要通过阻断特异性拓扑酶，抑制细菌DNA复制从而发挥抗菌作用[2]，该药具有价格低廉、抗菌谱广、无交叉耐药性等优点，广泛应用在临床及养殖领域。但喹诺酮类药物常有不合理使用和滥用的情况发生，使其或其代谢产物残留于动物的肌肉和脏器组织中，进而通过食物链导致人体产生抗药性，影响疾病治疗与康复，引起严重的食品安全问题和出口贸易问题[3]。因此，喹诺酮类药物残留问题越来越引起人们的重视。 目前，畜禽肉中检测抗生素残留方法主要有微生物检测法[4-5]、色谱法[6-7]和免疫分析法[8]等。其中色谱法较为常用，可以进行定性定量检测，结果灵敏准确，但设备投入大，人员技能要求高，适合大型综合性实验室进行仲裁判定和确证[9-10]；免疫分析法虽灵敏度高，但是检测成本昂贵，只能检测单一抗生素[11]，不易于推广；相较于前2 种方法，微生物法敏感性强、成本低廉、操作简单，可作为一种抗生素初筛方法应用在农产品安全监管环节，并可在中小型企业得到普及。因此，本研究建立了一种快速对动物源性食品中喹诺酮类药物残留进行初筛的微生物显色方法，并可根据具体需要进行色谱法复测，使结果更加准确可靠。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大肠杆菌（E.coli） 中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC1.1369）；禽畜肉购于超市，经检验不含喹诺酮类药物残留。
奥比沙星（orbifloxacin，ORB）、丹诺沙星（danofloxacin，DAN）、二氟沙星（difloxacin，DIF）、恶喹酸（oxolinic，OXO）、恩诺沙星（enrofloxacin，ENR）、氟甲喹（flumequine，FLU）、氟罗沙星（fleroxacin，FLE）、环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、洛美沙星（lomefloxacin，LOM）、诺氟沙星（norfloxacin，NOR）、培氟沙星（pefloxacin，PEF）、沙拉沙星（sarafloxacin，SAR）、司帕沙星（sparfloxacin，SPA）、氧氟沙星（ofloxacin，OFL）、依诺沙星（enoxacin，ENO）标
准品 德国Dr.Ehrenstorfer公司；蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、牛肉粉、葡萄糖、琼脂、营养肉汤、营养琼脂、溴甲酚紫 北京陆桥技术有限责任公司；甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯；其他试剂均为分析纯。
培养基：1）固体培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏3.0 g、NaCl 5.0 g、琼脂15.0 g溶于1 000 mL蒸馏水中，用NaOH溶液调pH值为7.3，121 ℃高压灭菌15 min。2）液体培养基：胰蛋白胨10.0 g、葡萄糖2.0 g、牛心粉5.0 g、NaCl 5.0 g、蒸馏水1 000 mL，用Na2HPO4·12 H2O溶液调pH值为7.4，121 ℃高压灭菌15 min。3）检测液：蛋白胨10.0 g、牛肉浸膏3.0 g、葡萄糖10.0 g、NaCl 5.0 g、溴甲酚紫指示剂0.04 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH值调至7.0，121 ℃高压灭菌15 min。
1.2 仪器与设备
SYNERGY H4酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；DHP-9272恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；UltiMate3000-TSQ QUANTUM ULTRA液相色谱-质谱联用仪（配有电喷雾离子源） 美国Thermo公司；SCR20BA离心机 日本日立仪器有限公司；PHS-3C pH计
上海雷韵仪器有限公司；ESJ120-4电子天平 龙腾仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 溶液配制
抗生素标准储备液：将15 种喹诺酮标准品分别称取0.010 0 g，置于10.0 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成质量浓度为1 mg/mL的标准储备液，
-20 ℃可保存3 个月。
混合标准工作液：将以上各标准储备液稀释，配成混合标准溶液，各组分质量浓度为10 μg/mL，4 ℃条件下可保存3 个月。
不同pH值磷酸钠缓冲溶液：A液：称取72 g Na2HPO4·12H2O，用去离子水定容至1 000 mL。B液：称取31 g NaH2PO4·2H2O，用去离子水定容至1 000 mL。pH 6.8：取A液49.5 mL和B液50.0 mL进行混合；pH 7.0：取A液61.0 mL和B液39.0 mL进行混合；pH 7.4：取A液81 mL和B液19 mL进行混合；pH 8.0：取A液94.7 mL和B液5.3 mL进行混合。
磷酸钠-乙腈缓冲液：将不同pH值的磷酸钠缓冲溶液和乙腈等体积混合。
磷酸钠-丙酮缓冲液：将不同pH值的磷酸钠缓冲溶液和丙酮等体积混合。
1.3.2 样品预处理
1.3.2.1 微生物显色法
称取8 份均质好的10 g鲜肉样品（精确到0.1 g）于50 mL离心管中，分别向其中4 份加入10 mL pH值为6.8、7.0、7.4、8.0的磷酸鈉-乙腈缓冲溶液，其余4 份各加入10 mL不同pH值的磷酸钠-丙酮缓冲溶液，漩涡振荡3 min，开盖置于70 ℃水浴中加热10 min，5 000 r/min离心3 min，取上清液用于微生物检测。
1.3.2.2 高效液相色谱-质谱（high performance liquid chroma-mass spectrography，HPLC-MS）法
样品参照GB/T 21312—2007[12]进行前处理。
1.3.3 微生物显色法检测
1.3.3.1 微生物初始浓度及检测体系组成比例的确定
无菌状态下，从固体培养基上挑取已培养24 h的嗜热脂肪芽孢杆菌菌落，接入液体培养基中，分别配成吸光度（A600 nm）为0.1、0.4、0.6、0.8、1.0的菌悬液。取96孔板，将各菌悬液分别加入到以下3 组体系中，A组为检测液180 μL、菌悬液20 μL、生理盐水100 μL；B组为检测液150 μL、菌悬液50 μL、生理盐水100 μL、C组为检测液100 μL、菌悬液100 μL、生理盐水100 μL。于36 ℃恒温箱中培养，确定各组变色（反应液由紫变黄）时间。将变色时间较短的组合中生理盐水换成0.1 μg/mL恩诺沙星标准溶液，进行抗生素敏感度实验，于36 ℃条件下恒温培养，观察变色情况，选出结果呈阳性组（检测液紫色为阳性，黄色为阴性），最终优化出最适的微生物初始浓度和检测体系组成比例。 1.3.3.2 微生物显色法检测程序
取96孔板，按1.3.3.1节优化的比例，在第1列只加入检测液，在第2～12列加入检测液和菌悬液，之后在第2列加入无抗生素的鲜肉提取液，在第3～12列加入不同抗生素标准液或样品提取液，于36 ℃条件下恒温培养至第2列变成黄色，观察其他列颜色变化。
1.3.3.3 微生物显色法检出限的确定
用去离子水将15 种抗生素标准储备液分别稀释成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 μg/mL共10 个梯度，以注射的方式加入到无抗生素鲜肉中，静置使其充分吸收。按上述微生物法进行检测，确定各种抗生素检出限。
1.3.3.4 指示菌传代稳定性的确定
将大肠杆菌连续传代至第5代，用各代菌对恩诺沙星、沙拉沙星、氟甲喹和二氟沙星的检出限进行测定，并确定反应时间，以此判断指示菌的传代稳定性。
1.3.4 HPLC-MS法检测
1.3.4.1 检测条件
样品参照GB/T 21312—2007《动物源性食品中14 种喹诺酮药物残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》[12]，运用UltiMate 3000-TSQ QUANTUM ULTRA液相色谱-质谱联用仪进行检测。
1.3.4.2 HPLC-MS法标准曲线及检出限确定
将混合标准工作液配制成0.005、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 μg/mL共6 个梯度，用上述色谱条件进行测定，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。并以3 倍信噪比（RS/N=3）确定其方法检出限，10 倍信噪比（RS/N=10）确定其定量限。
1.3.5 样品测定
将无喹诺酮类药物残留的鲜肉样品（猪肉20 份、牛肉10 份、羊肉10 份、禽肉10 份），分别用序号1～50标识。随机从中抽取15 个样品，每个样品注射1 种一定浓度（该种抗生素国家规定的最大残留限量值）的喹诺酮类药物，用微生物法和HPLC-MS法同时对50 个样品中喹诺酮类药物残留进行检测。
2 结果与分析
2.1 微生物法提取缓冲液的确定
本实验所用指示剂为溴甲酚紫，其变色范围是pH值6.8（紫色）～5.6（黄色），而市售鲜肉的pH值一般在6.6～5.8之间，肉汁本身酸碱性对检测液变色效果影响较大[13-14]。实验选取不同pH值的磷酸盐缓冲溶液和有机试剂进行组合，对样品进行前处理，结果见表1。
由表1可知，当提取液pH值小于7.4时，鲜肉提取液加入到检测体系中，会使检测液瞬间变黄；当提取液pH值较高时，则会延长反应时间。选用乙腈作为蛋白沉淀剂效果较好且反应时间较丙酮短，可能由于乙腈对大肠杆菌活性影响较小[15-17]。因此，选取pH值为7.4的磷酸钠-乙腈缓冲溶液对样品中的喹诺酮药物进行提取。
2.2 微生物初始浓度及检测体系的确定
用生理盐水作为样品提取液按比例加入到检测体系中，确定菌悬液浓度和检测体系组成比例对反应时间的影响，结果见表2。
由表2可知，当菌悬液初始吸光度A600 nm≥0.4时，B、C两组反应时间较短，均能在4 h内变色，因此用这2 组进行抗生素敏感度实验，结果见表3。
由表3可知，菌悬液初始吸光度较高或加入菌悬液体积较大时，抗生素对菌的抑制效果不明显，反应液变为黄色，达不到检测目的，因此选择A600 nm为0.4作为菌悬液初始吸光度，反应液150 μL、菌悬液50 μL、样品提取液100 μL作为检测体系。该法比传统平板法省时省力，采用指示剂显色作为判别标准也比抑菌圈更易于观察，满足快速检测的要求。
2.3 微生物显色法的检出限
按1.3.3.3节方法进行检测，以颜色未发生变化的标准液浓度为该抗生素的最小检测浓度，结果见表4。
由表4可知，本方法各类抗生素检出限均小于我国农业部规定的动物性食品中兽药最高残留限量[18]，虽然检出的阴性样品中可能含有抗生素，但其含量低于最高残留限量，依然是合格产品，因此该法可以满足初筛检测的要求。其中对恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星较为敏感，检出限为60 μg/kg，这与沈翠香[19]的研究结果相似。本研究选用的指示剂溴甲酚紫，颜色变化明显，易用肉眼区分。当样品中没有抗生素残留或是抗生素残留低于检出值时，大肠杆菌在36 ℃条件下快速生长产酸，使检测体系pH值下降，导致指示剂由紫色变成黄色；反之，若抗生素残留浓度高于检出值，则会抑制检测菌的生长，使得檢测体系的pH值基本保持不变，指示剂不会变色[20-22]。本研究所采用的96微孔板，除去空白对照列，还有80多个孔可以用于样品检测，即便采用4 次重复，仍然可以同时对20 个样品进行检测，并且可以对多种抗生素成分进行筛检，是一种高通量的微生物检测方法。
2.4 指示菌传代稳定性
由表5可知，对于同一种抗生素，各代菌测定的检出限相同，说明前5 代菌对抗生素的敏感程度一致。从反应时间来看，第1代菌所需反应时间略长，后几代菌的反应时间趋于稳定，5 代菌均能在3～4 h内使指示剂变色。因此，前5 代菌具有较好的稳定性，均可以用于微生物显色法检测。
2.5 HPLC-MS法检出限
将不同质量浓度的抗生素标准溶液分别在上述色谱条件下进行测定，15 种抗生素的质量浓度在0.005～0.1 μg/mL范围内，与其峰面积呈良好线性关系（R2>0.991），满足定量要求，其标准品色谱图见图1，
图1A～O分别为15 种喹诺酮类药物的多反应检测（multiple reaction monitoring，MRM）色谱图，检出限结果如表4所示。色谱法灵敏度较高，其检出限远小于国家规定的兽药最大残留限量，这就导致一些含有极少抗生素的合格样品被检测出来，造成时间和成本的浪费。相较于色谱法，微生物显色法的检出限更接近最大残留限量，因此用微生物法初筛呈阳性的样品更有可能是不合格样品，之后将这些阳性样品用色谱法进行复测，可以节约时间和成本。 由表6可知，微生物法检测共有18 个样品呈阳性，经HPLC-MS复测，其中15 个阳性样品含有喹诺酮类药物，其余3个为假阳性样品，据研究[23-26]大肠杆菌除对喹诺酮药物敏感外，对庆大霉素、链霉素、卡那霉素及青霉素类药物也有较高的敏感性，因此3 个假阳性样品存在含有其他抗生素残留的可能。而微生物法检测呈阴性的32 个样品，经HPLC-MS法验证，没有测出喹诺酮类药物残留，说明该微生物显色法结果较可靠，虽存在一定的假阳性结果，但只要抗生素残留量超过其方法检出限，无假阴性结果存在。
3 结 论
本研究选用的大肠杆菌对喹诺酮类药物具有较高敏感性，且产酸迅速，是一種理想的抗生素快速检测菌，按本研究优化的菌悬液初始浓度及检测体系进行实验，可在3～4 h内使指示剂变色，比传统平板法省时省力[27]。
该方法采用96孔板，可以在一个板上同时对几十个样品进行筛选，用指示剂显色作为判别标准也比传统抑菌圈便于观察[28-30]。该微生物显色法检测成本较低，检测一个样品成本不到1 元，是一种快捷、简单、低成本的检测方法。用HPLC-MS法对微生物法筛检出的32 个阴性样品进行检测，15 种抗生素均未被检出，说明本研究建立的微生物显色法结果可靠，没有假阴性。因此可以采用该微生物显色法对样品中喹诺酮类药物进行初筛，再以色谱法对呈阳性的样品进行检测，以便减少工作量和提高检测效率，这将在普通的检测实验室具有良好的应用前景。
参考文献：
[1] 张元， 周伟娥， 李绍辉， 等. 动物源性食品中喹诺酮类残留前处理及分析方法的研究[J]. 食品工业科技， 2016， 37（5）： 378-281. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.069.
[2] 林黎， 张毅， 涂小珂， 等. 液相色谱-串联质谱法同时测定化妆品中的25 种喹诺酮类药物[J]. 色谱， 2015， 33（3）： 275-281.
[3] SEIDEL J， CLARKE T， MATHEW B. To cipro or not to cipro bilateral achilles ruptures with the use of quinolones[J]. Journal of the American Podiatric Medical Association， 2015， 105（2）： 185-188.
[4] PIKKEMAAT M G， DIJK S O， SCHOUTEN J， et al. A new microbial screening method for the detection of antimicrobial residues in slaughter animals： the Nouws antibiotic test （NAT-screening）[J]. Food Additives and Contaminants， 2008， 19（3）： 781-789. DOI：10.1080/19440049.2010.535027.
[5] PIKKEMAAT M G. Microbial screening methods for detection of antibiotic residues in slaughter animals[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry， 2009， 395（5）： 893-905. DOI：10.1080/19440049.2010.535027.
[6] 农以宁， 蔡江帆， 蒙肇云， 等. SPE-HPLC法同时测定猪肉中常见抗生素和克伦特罗的研究[J]. 桂林电子科技大学学报， 2009， 29（5）： 406-409. DOI：10.3969/j.issn.1673-808X.2009.05.009.
[7] 许蔚， 辛志宏， 张晓燕， 等. LC-MS/MS法测定蜂花粉中18 种喹诺酮类药物残留[J]. 环境化学， 2015， 34（4）： 810-813.
[8] 中华人民共和国农业部. 农业部1025号公告—2008 动物性食品中磺胺类药物残留检测酶联免疫吸附法[EB/OL]. （2008-05-10）
[2017-03-06]. http：//www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/gg/200805/t20080509_1036076.htm.
[9] PENG Y， HUANG Y C， CAI Y M. Screening for Streptomyces hygroscopicus strains with high production of agricultural antibiotics by streptomycin resistance[J]. Agricultural Science and Technology， 2008， 9（1）： 146-149.
[10] 卢坤， 童群义.动物源性食品中抗生素残留检测技术研究进展[J]. 广州化工， 2015， 43（12）： 13-14. DOI：10.3969/j.issn.1001-9677.2015.12.006.
[11] ZHANG Yulan， LU Shengxin， LIU Wei， et al. Preparation of anti-tetracycline antibodies and development of an indirect heterologous competitive enzyme-linked immunosorbent assay to detect residues of tetracycline in milk[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2007， 55（6）： 211-218. DOI：10.1021/jf062627s. [12] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局， 中国国家标准化管理委员会. GB/T 21312—2007 动物源性食品中14 种喹诺酮药物残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法[S]. 北京： 中国标准出版社， 2007.
[13] 李周敏， 孙艳艳， 姚开安， 等. 动物源性食品中抗生素残留检测前处理及其分析方法研究进展[J]. 药物分析杂志， 2013， 33（6）： 901-903. DOI：10.16155/j.0254-1793.2013.06.002.
[14] 潘媛， 牛华， 程晓云， 等. 動物源性食品中六种氟喹诺酮类残留检测前处理的优化[J]. 中国兽药杂志， 2011， 45（4）： 28-30.
[15] 王永乐. 大肠杆菌对有机溶剂的耐受性研究[D]. 天津： 天津科技大学， 2008： 28-35.
[16] 王永乐， 王敏， 申雁冰， 等. 有机溶剂对大肠杆菌细胞膜的影响[J]. 天津科技大学学报， 2008， 23（4）： 41-44.
[17] ADRIAN J， FERN?NDEZ F， S?NCHEZ-BAEZA F， et al. Preparation of antibodies and development of an enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） for the detemination of doxycycline antibiotic in milk samples[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2012， 57： 3837-3840.
[18] 中华人民共和国农业部. 235号公告 动物性食品中兽药最高残留限量 [EB/OL]. （2002-12-24）[2017-03-06]. http：//www.aqsiq.gov.cn/xxgk_13386/jgfl/jckspaqj/ywxx/201210/t20121016_252217.htm.
[19] 沈翠香. 微生物抑制法检测动物性食品中喹诺酮类药物残留的研究[D]. 新疆： 新疆农业大学， 2010： 22-28.
[20] 刘兴泉， 冯震， 姚蕾， 等. 采用高通量微生物法和HPLC法检测猪肉中四环素和磺胺类抗生素残留[J]. 食品与发酵工业， 2011， 37（4）： 194-197.
[21] 张亚丽， 哈婧， 赵静， 等. 动物组织中抗生素残留研究进展[J]. 河北科技大学学报， 2013， 34（6）： 517-520. DOI：10.7535/hbkd.2013yx06004.
[22] TAJICK M A， SHOHREH B. Detection of antibiotics residue in chicken meat using TLC[J]. International Journal of Poultry Science， 2006， 5（7）： 611-612.
[23] 席会平， 符明淳， 郭利兵， 等. 乳、肉制品中氟喹诺酮类抗生素残留检测研究[J]. 河南科学， 2007， 25（5）： 748-752. DOI：10.3969/j.issn.1004-3918.2007.05.017.
[24] 施奉英， 郭鑫， 杨汉春， 等.猪源大肠杆菌对20 种抗生素的敏感试验[J]. 中国兽医杂志， 2007， 43（8）： 8-9. DOI：10.3969/j.issn.0529-6005.2007.08.003.
[25] ESPINOSA-MANSILLA A， de la PENA A M， GOMEZ D G， et al.
Determination of fluoroquinolones in urine and serum by using high performance liquid chromatography and multiemission scan fluorimetric detection[J]. Talanta， 2006， 68： 1215-1221.
[26] LINDER J A， HUANG E S， STEINMAN M A， et al. Fluoroquinolone prescribing in the United States[J]. American Journal of Medicine， 2005， 118（3）： 259-268.
[27] 徐品. 动物源性食品中抗生素残留微生物学检测的方法与进展[J]. 职业与健康， 2010， 26（9）： 1057-1058.
[28] RENATA Z， JOANA S. An evaluation of different microbial and rapid tests for determining inhibitors in milk[J]. Food Control， 2007， 18（5）： 541-547.
[29] 刘兴泉， 冯震， 姚蕾， 等. 采用高通量微生物法检测四种抗生素在鸡蛋中的残留[J]. 现代食品科技， 2011， 27（4）： 465-467. DOI：10.13982/j.mfst.1673-9078.2011.04.004.
[30] 王民权. 水产品中恩诺沙星、氯霉素残留初检技术研究[D]. 上海： 上海水产大学， 2005： 16-34.