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（华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州 510006）
摘要 [目的] 构建低甲醇生成的酿酒酵母工程菌用于酿造低甲醇酒。[方法] 利用基因敲除技术，敲除酵母代谢甘氨酸生成甲醇途径的甘氨酸裂解酶系的基因GCV2。[结果] 成功构建出基因敲除GCV2的工程酵母L5，用L5酿造酒中的相对甲醇含量为131 mg/L，比初始菌株的192 mg/L降低31%。[结论] 利用基因敲除GCV2的工程酵母菌可有效减少酒中由甘氨酸代谢生成甲醇的量。
关键词 基因敲除；甲醇；酿酒酵母
中图分类号 S188+.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）15-063-03
Construction of Saccharomyces cerevisiae with Gene Knockout GCV2
XIONG Zhiqin， ZHOU Shishui*
（School of Bioscience and Bioengineering， South China University of Technology， Guangzhou， Guangdong 510006）
Abstract [Objective] In order to brew low methanol wine， the engineering strain of Saccharomyces cerevisiae was constructed to produce low methanol wine. [Method] The technology of gene knockout was used to knockout GCV2 of glycine cleavage enzyme system in Saccharomyces cerevisiae metabolic pathway of glycine to methanol. [Result] It was succeed to construct the engineering strain L5 of knockout GCV2. The methanol is 131 mg/L in wine brewed by L5. It decreased 31% compared with 192 mg/L methanol in wine brewed by original strain. [Conclusion] It is effective to decrease methanol in wine from glycine metabolized by the Saccharomyces cerevisiae of gene knockout GCV2.
Key words Gene knockout； Methanol； Saccharomyces cerevisiae
甲醇是酒中一种对人体有害的物质，其对人体致死量为143 mg/kg，特别是在人体内有蓄积作用，不易排出[1]。因此，降低酒中甲醇的含量对饮酒人群的健康意义重大。而酒中甲醇来源主要有2个途径：一是由果胶、纤维素等酿酒原料分解产生的甲醇，二是酵母菌自身代谢甘氨酸生成的甲醇[2]，即甘氨酸经甘氨酸裂解酶系催化反应生成甲醇，该酶系复合体中的甘氨酸脱羧酶是由基因GCV2编码生成的P蛋白亚基。基因敲除或基因沉默GCV2能有效地阻断酵母代谢甘氨酸生成甲醇[3]。因此，笔者构建基因敲除酵母GCV2的工程菌，并应用于酿造低甲醇健康酒。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种与质粒。
酿酒酵母S1由华南理工大学发酵工程实验室保存，质粒pUG6（含抗G418的Kanr筛选标记）购于杭州宝赛生物科技有限公司。
1.1.2 酶、试剂和仪器。
TaqHS酶购于TaKaRa公司，G418、醋酸锂购于纽普诺博生物制品有限公司，小量酵母基因提取试剂盒、质粒制备试剂盒购于艾比根生物技术有限公司。安捷伦7890A气相色谱仪、DBFFAP 毛细管柱（30 m×0.53 m×1.00 μm）和安捷伦 7694E 顶空进样器。
1.1.3 引物。
根据SGD（Saccharomyces genome database）数据库的GCV2基因（S000004801）和GenBank的pUG6序列（No.AF298793.1）设计引物，基因GCV2验证引物 A1、A2，KanA、KanB，GCV2基因敲除引物R2、L2，由英潍捷基贸易有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 基因GCV2的验证。
以0.4 μl提取S1的DNA为模板，A1、A2为引物的PCR反应体系10 μl，反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃预变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环30次，最后72 ℃延伸10 min，用琼脂糖电泳验证。
1.2.2 S1对抗生素G418耐受试验。
抗生素G418的浓度分别为0、10、20、30和40 μg/ml。将S1分别涂布上述不同抗生素浓度的YPD平板上，30 ℃培养。
1.2.3 GCV2基因敲除组件的构建。
以pUG6为模板，R2、L2为引物（5′端有45 bp与GCV2同源[4]），PCR扩增100 μl GCV2基因敲除组件。
1.2.4 醋酸锂法[5]转化与阳性菌落PCR验证。
將GCV2基因敲除组件用醋酸锂转化到OD600 nm=1的S1细胞中，涂布在含G418 40 μg/ml的YPD平板上，30 ℃培养3 d。挑选阳性菌落用引物KanA、KanB进行菌落PCR，验证GCV2敲除组件是否整合到S1。 1.2.5 阳性菌株与S1的发酵试验。
用12°P麦芽汁 100 ml，接种1×107 CFU/ml，30 ℃发酵5 d，蒸馏出40%体积的酒，并测定乙醇和甲醇含量。
1.2.6 甲醇的顶空气相测定法。
1.2.6.1 色谱分离条件。N2流速1.0 ml/min，干燥空气流速350 ml/min，H2流速30 ml/min，压力10.56 psi，分流比50∶1，检测器温度250 ℃，汽化室温度150 ℃，进样量1 μl。程序升温：先35 ℃保温4 min，再以20 ℃/min升温到180 ℃，并保温5 min。
1.2.6.2 顶空进样条件。顶空瓶温度80 ℃、平衡5 min，定量环温度85 ℃、气体填充0.5 min、平衡0.1 min，气体传输线温度90 ℃，样品瓶压力平衡0.2 min，进样1 min，振荡幅度为1。
1.2.6.3 样品的制备。配置300 mg/L乙酸丁酯为内标的40%vol样品，其甲醇浓度分别为0、20、40、60、80、100 mg/L。
2 结果与分析
2.1 甘氨酸裂解酶系基因GCV2的验证
按“1.2.1”方法用引物A1、A2进行PCR验证S1的GCV2基因，琼脂糖凝胶电泳结果见图1。
由图1可知，PCR产物长度在353 bp，与设计GCV2基因的DNA大小一致，表明菌种S1含有甘氨酸裂解酶系的GCV2基因。
2.2 S1对抗生素G418的耐受试验
按“1.2.2”方法进行S1对抗生素G418的耐受性试验，G418浓度为0、10、20、
30、40 μg/ml的YPD平板培养S1的结果見图2。
由图2可知，当G418浓度达到40 μg/ml时，无Kanr抗性基因的酵母不能生长。
2.3 GCV2基因敲除组件的转化结果
按“1.2.4”的醋酸锂转化法将GCV2基因敲除组件转化S1，挑选在含40 μg/ml的G418平板上生长的阳性菌落，按“1.2.1”方法进行菌落PCR验证，结果见图3。
由图3可知，阳性菌L5、L6中含有大小为667 bp的GCV2敲除组件，与设计PCR验证的DNA大小一致，说明GCV2敲除组件已正确整合到目标酵母菌中。
2.4 菌株L5的发酵结果
取工程酵母菌L5、L6和S1，分别接种1×107 CFU/ml到12°P麦芽汁中进行发酵，蒸馏后测定酒中乙醇和甲醇含量。
按“1.2.6”的甲醇顶空气相测定，结果见图4，根据气相测定结果绘制出甲醇测定的标准曲线和线性方程：y=0.000 3x-0.006 4，其中，x为甲醇浓度，y为甲醇测定峰面积RF。
图4 甲醇测定的标准曲线
将测定甲醇的RF值带入方程y=0.000 3x-0.006 4，得到甲醇含量最低的菌株L5，其发酵酒（酒精度为10.2%vol）的相对甲醇含量为131 mg/L，S1发酵酒（酒精度为9.6%vol）的相对甲醇含量为192 mg/L，L5酿造酒测定的色谱图见图5。由图5可知，L5酿造酒中的相对甲醇含量比初始菌株S1的降低了31%，降到131 mg/L，且发酵酒的乙醇含量也有一定程度的提高，达到10.2%vol。这表明用基因敲除GCV2的工程酵母菌能够有效降低酿造酒中的甲醇含量。
图5 L5酿造酒的气相色谱图
2.5 L5的传代稳定性
对菌株L5进行连续5代以上的传代，分别按接种量1×107 cfu/ml接种到12°P麦芽汁，30 ℃发酵5 d，蒸馏测定酒中乙醇和相对甲醇浓度，结果见表1。
3 结论与讨论
该试验成功敲除了酿酒酵母S1的基因GCV2，切断了甘氨酸生成甲醇的代谢途径，从而成功构建了低生成甲醇的酿酒酵母工程菌L5，利用L5的酿造酒中相对甲醇含量降低到131 mg/L，比初始酵母酿造酒的192 mg/L大幅度降低了31%。同时，L5不仅具有多次传代发酵性能的遗传稳定性，而且乙醇的发酵力还略有提高。
但由于甘氨酸裂解酶系包含了4个蛋白亚基，而该试验仅针对其编码P蛋白亚基的GCV2基因进行敲除。如果将另外3个蛋白亚基的基因进一步敲掉，可能会构建出甲醇生成更低的酿酒酵母菌，这将显著提高酿造酒的健康品质。
参考文献
[1] 赵福岐，陈小全，周秀艳，等.甲醇及其对人体的危害[J].中国科技信息，2008（10）：175，177.
[2] 武晓娜，康富帅，阎锐鸣，等.酿酒酵母与甘氨酸发酵生成甲醇关系的研究[J].安徽农业科学，2012，40（25）：12642，12645.
[3] RIBEIRO O，GOMBERT A K，TEIXEIRA J A，et al.Application of the Cre-loxP system for multiple gene disruption in the yeast Kluyveromyces marxianus[J].J Biotechnol，2007，131（1）：20-26.
[4] 张新宇，高燕宁.PCR引物设计及软件使用技巧[J].生物信息学，2004（4）：15-18.
[5] GIETZ R D，SCHIESTL R H.Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure[J].Yeast，1995，11（4）：355-360.
摘要 [目的] 构建低甲醇生成的酿酒酵母工程菌用于酿造低甲醇酒。[方法] 利用基因敲除技术，敲除酵母代谢甘氨酸生成甲醇途径的甘氨酸裂解酶系的基因GCV2。[结果] 成功构建出基因敲除GCV2的工程酵母L5，用L5酿造酒中的相对甲醇含量为131 mg/L，比初始菌株的192 mg/L降低31%。[结论] 利用基因敲除GCV2的工程酵母菌可有效减少酒中由甘氨酸代谢生成甲醇的量。
关键词 基因敲除；甲醇；酿酒酵母
中图分类号 S188+.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）15-063-03
Construction of Saccharomyces cerevisiae with Gene Knockout GCV2
XIONG Zhiqin， ZHOU Shishui*
（School of Bioscience and Bioengineering， South China University of Technology， Guangzhou， Guangdong 510006）
Abstract [Objective] In order to brew low methanol wine， the engineering strain of Saccharomyces cerevisiae was constructed to produce low methanol wine. [Method] The technology of gene knockout was used to knockout GCV2 of glycine cleavage enzyme system in Saccharomyces cerevisiae metabolic pathway of glycine to methanol. [Result] It was succeed to construct the engineering strain L5 of knockout GCV2. The methanol is 131 mg/L in wine brewed by L5. It decreased 31% compared with 192 mg/L methanol in wine brewed by original strain. [Conclusion] It is effective to decrease methanol in wine from glycine metabolized by the Saccharomyces cerevisiae of gene knockout GCV2.
Key words Gene knockout； Methanol； Saccharomyces cerevisiae
甲醇是酒中一种对人体有害的物质，其对人体致死量为143 mg/kg，特别是在人体内有蓄积作用，不易排出[1]。因此，降低酒中甲醇的含量对饮酒人群的健康意义重大。而酒中甲醇来源主要有2个途径：一是由果胶、纤维素等酿酒原料分解产生的甲醇，二是酵母菌自身代谢甘氨酸生成的甲醇[2]，即甘氨酸经甘氨酸裂解酶系催化反应生成甲醇，该酶系复合体中的甘氨酸脱羧酶是由基因GCV2编码生成的P蛋白亚基。基因敲除或基因沉默GCV2能有效地阻断酵母代谢甘氨酸生成甲醇[3]。因此，笔者构建基因敲除酵母GCV2的工程菌，并应用于酿造低甲醇健康酒。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种与质粒。
酿酒酵母S1由华南理工大学发酵工程实验室保存，质粒pUG6（含抗G418的Kanr筛选标记）购于杭州宝赛生物科技有限公司。
1.1.2 酶、试剂和仪器。
TaqHS酶购于TaKaRa公司，G418、醋酸锂购于纽普诺博生物制品有限公司，小量酵母基因提取试剂盒、质粒制备试剂盒购于艾比根生物技术有限公司。安捷伦7890A气相色谱仪、DBFFAP 毛细管柱（30 m×0.53 m×1.00 μm）和安捷伦 7694E 顶空进样器。
1.1.3 引物。
根据SGD（Saccharomyces genome database）数据库的GCV2基因（S000004801）和GenBank的pUG6序列（No.AF298793.1）设计引物，基因GCV2验证引物 A1、A2，KanA、KanB，GCV2基因敲除引物R2、L2，由英潍捷基贸易有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 基因GCV2的验证。
以0.4 μl提取S1的DNA为模板，A1、A2为引物的PCR反应体系10 μl，反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃预变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环30次，最后72 ℃延伸10 min，用琼脂糖电泳验证。
1.2.2 S1对抗生素G418耐受试验。
抗生素G418的浓度分别为0、10、20、30和40 μg/ml。将S1分别涂布上述不同抗生素浓度的YPD平板上，30 ℃培养。
1.2.3 GCV2基因敲除组件的构建。
以pUG6为模板，R2、L2为引物（5′端有45 bp与GCV2同源[4]），PCR扩增100 μl GCV2基因敲除组件。
1.2.4 醋酸锂法[5]转化与阳性菌落PCR验证。
將GCV2基因敲除组件用醋酸锂转化到OD600 nm=1的S1细胞中，涂布在含G418 40 μg/ml的YPD平板上，30 ℃培养3 d。挑选阳性菌落用引物KanA、KanB进行菌落PCR，验证GCV2敲除组件是否整合到S1。 1.2.5 阳性菌株与S1的发酵试验。
用12°P麦芽汁 100 ml，接种1×107 CFU/ml，30 ℃发酵5 d，蒸馏出40%体积的酒，并测定乙醇和甲醇含量。
1.2.6 甲醇的顶空气相测定法。
1.2.6.1 色谱分离条件。N2流速1.0 ml/min，干燥空气流速350 ml/min，H2流速30 ml/min，压力10.56 psi，分流比50∶1，检测器温度250 ℃，汽化室温度150 ℃，进样量1 μl。程序升温：先35 ℃保温4 min，再以20 ℃/min升温到180 ℃，并保温5 min。
1.2.6.2 顶空进样条件。顶空瓶温度80 ℃、平衡5 min，定量环温度85 ℃、气体填充0.5 min、平衡0.1 min，气体传输线温度90 ℃，样品瓶压力平衡0.2 min，进样1 min，振荡幅度为1。
1.2.6.3 样品的制备。配置300 mg/L乙酸丁酯为内标的40%vol样品，其甲醇浓度分别为0、20、40、60、80、100 mg/L。
2 结果与分析
2.1 甘氨酸裂解酶系基因GCV2的验证
按“1.2.1”方法用引物A1、A2进行PCR验证S1的GCV2基因，琼脂糖凝胶电泳结果见图1。
由图1可知，PCR产物长度在353 bp，与设计GCV2基因的DNA大小一致，表明菌种S1含有甘氨酸裂解酶系的GCV2基因。
2.2 S1对抗生素G418的耐受试验
按“1.2.2”方法进行S1对抗生素G418的耐受性试验，G418浓度为0、10、20、
30、40 μg/ml的YPD平板培养S1的结果見图2。
由图2可知，当G418浓度达到40 μg/ml时，无Kanr抗性基因的酵母不能生长。
2.3 GCV2基因敲除组件的转化结果
按“1.2.4”的醋酸锂转化法将GCV2基因敲除组件转化S1，挑选在含40 μg/ml的G418平板上生长的阳性菌落，按“1.2.1”方法进行菌落PCR验证，结果见图3。
由图3可知，阳性菌L5、L6中含有大小为667 bp的GCV2敲除组件，与设计PCR验证的DNA大小一致，说明GCV2敲除组件已正确整合到目标酵母菌中。
2.4 菌株L5的发酵结果
取工程酵母菌L5、L6和S1，分别接种1×107 CFU/ml到12°P麦芽汁中进行发酵，蒸馏后测定酒中乙醇和甲醇含量。
按“1.2.6”的甲醇顶空气相测定，结果见图4，根据气相测定结果绘制出甲醇测定的标准曲线和线性方程：y=0.000 3x-0.006 4，其中，x为甲醇浓度，y为甲醇测定峰面积RF。
图4 甲醇测定的标准曲线
将测定甲醇的RF值带入方程y=0.000 3x-0.006 4，得到甲醇含量最低的菌株L5，其发酵酒（酒精度为10.2%vol）的相对甲醇含量为131 mg/L，S1发酵酒（酒精度为9.6%vol）的相对甲醇含量为192 mg/L，L5酿造酒测定的色谱图见图5。由图5可知，L5酿造酒中的相对甲醇含量比初始菌株S1的降低了31%，降到131 mg/L，且发酵酒的乙醇含量也有一定程度的提高，达到10.2%vol。这表明用基因敲除GCV2的工程酵母菌能够有效降低酿造酒中的甲醇含量。
图5 L5酿造酒的气相色谱图
2.5 L5的传代稳定性
对菌株L5进行连续5代以上的传代，分别按接种量1×107 cfu/ml接种到12°P麦芽汁，30 ℃发酵5 d，蒸馏测定酒中乙醇和相对甲醇浓度，结果见表1。
3 结论与讨论
该试验成功敲除了酿酒酵母S1的基因GCV2，切断了甘氨酸生成甲醇的代谢途径，从而成功构建了低生成甲醇的酿酒酵母工程菌L5，利用L5的酿造酒中相对甲醇含量降低到131 mg/L，比初始酵母酿造酒的192 mg/L大幅度降低了31%。同时，L5不仅具有多次传代发酵性能的遗传稳定性，而且乙醇的发酵力还略有提高。
但由于甘氨酸裂解酶系包含了4个蛋白亚基，而该试验仅针对其编码P蛋白亚基的GCV2基因进行敲除。如果将另外3个蛋白亚基的基因进一步敲掉，可能会构建出甲醇生成更低的酿酒酵母菌，这将显著提高酿造酒的健康品质。
参考文献
[1] 赵福岐，陈小全，周秀艳，等.甲醇及其对人体的危害[J].中国科技信息，2008（10）：175，177.
[2] 武晓娜，康富帅，阎锐鸣，等.酿酒酵母与甘氨酸发酵生成甲醇关系的研究[J].安徽农业科学，2012，40（25）：12642，12645.
[3] RIBEIRO O，GOMBERT A K，TEIXEIRA J A，et al.Application of the Cre-loxP system for multiple gene disruption in the yeast Kluyveromyces marxianus[J].J Biotechnol，2007，131（1）：20-26.
[4] 张新宇，高燕宁.PCR引物设计及软件使用技巧[J].生物信息学，2004（4）：15-18.
[5] GIETZ R D，SCHIESTL R H.Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure[J].Yeast，1995，11（4）：355-360.