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【摘要】目的 研究中西医结合治疗对混合性中风大鼠急性期神经元特异性烯醇化酶(Neuron specific enolase,NSE)表达的影响。方法 将50只SD大鼠随机分为5组,分别给予不同干预后,检测5组大鼠脑组织含水量及血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)水平。结果 模型组脑组织含水量及NSE水平最高,依次是中药组、西药组、中西药结合组,假手术组(P<0.05)。结论 中西医结合治疗能够降低混合性中风大鼠急性期脑组织含水量及NSE的表达。
【关键词】化痰祛瘀止血汤 混合性中风 脑组织含水量 神经元特异性烯醇化酶
【中图分类号】R473.6 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2010)09-00-02
同一患者脑内不同血管供血区同时或极短时间先后发生的出血和梗塞,称为混合性中风。发病率约2.7%～13.1%不等[1,2]。西医治疗存在扩血管、抗凝、溶栓与止血之间的矛盾,中药活血化瘀法可对两种病灶同时治之[3]。并且中西医结合治疗混合性中风急性期有一定优势,其表现为临床缓解率有明显提高,生存率也明显延长[4]。本课题试图通过实验研究化痰祛瘀止血汤联合西药治疗对混合性中风急性期大鼠NSE表达的影响,从而探索化痰祛瘀止血汤联合西药治疗混合性中风的作用机制。
1 一般资料
1.1 动物和试剂
健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只,体重280-300g,鼠龄8-10周,由新疆医科大学实验动物中心提供。 黄连、陈皮、半夏、枳实、竹茹、胆南星、石菖蒲等15味中药购自新疆乌鲁木齐市参茸药业有限责任公司。使用前常规方法煎煮后浓缩成1g/mL的混悬液。20%甘露醇由石家庄四药有限公司生产(批准文号:国药准字H14023085),速尿由广东南国药业有限责任公司生产(批准文号:国药准字H14023185),胞二磷胆碱由山东新时代药业有限公司生产(批准文号:国药准字H14023083)。大鼠神经元特异性烯醇化酶(NSE)测定试剂盒(批号20070605)购自美国ADL公司。
1.2 实验分组及模型制备
实验前将大鼠于实验室饲养1周,自由进食,室温22-25℃,每日光照12h。实验大鼠共分为5组:假手术组、中药组、西药组、模型组、中西药结合组,每组10只。采用改良的Longa线栓法制作局灶性脑缺血模型[5]与自体血注入脑出血模型[6]相结合制作混合性中风大鼠模型。步骤如下:暴露分离左侧的颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA),结扎ECA近头端及翼腭动脉,夹闭CCA、ICA,在距颈总动脉分叉约4mm处剪断ECA,将栓线插入ECA残端经ICA缓送至颅内,插入深度约为18.5±0.5mm,此时栓线头端已达大脑中动脉(MCA)起始端,减少了MCA的血流,即为MCAO模型。之后立即将大鼠俯卧位固定于大鼠脑立体定位仪上,门齿沟水平比耳间线低2.4mm,沿头皮正中切开一长约10mm纵切口,将微量注射仪尖端定位于前囟前0.5mm,中线右侧旁开3mm处,用微型手钻在此处钻一直径0.5mm的小孔,在大鼠尾部上1/3段,用微量注射仪在尾动脉处取血25ul,迅速将微量注射仪装入立体定位仪上,并沿所钻小孔进针6mm(相当于大鼠尾状核部位),按10ul/min的速度缓慢匀速注入,注血结束后留针5min,缓慢退针,缝合切口并消毒,至此混合性中风大鼠造模完毕。假手术组大鼠只分离、暴露左侧颈内外动脉分叉,不闭塞左侧大脑中动脉,并用25ul生理盐水代替自体不凝血注入右侧尾状核。除假手术组外,其它各组均按照MCAO线栓法及自体血注入脑出血模型法制成混合性中风大鼠模型。
1.3 模型成功的判定标准
大鼠脑组织病理切片可见出血灶和梗塞灶并存。
1.4 动物给药方法
假手术组及模型组予等量生理盐水灌胃;中药组予化痰祛瘀止血汤混悬液灌胃,给药/生理盐水剂量(按人与大鼠体表面积换算法[7]),1.5ml/次,2次/天;西药组予20%甘露醇2.625ml、速尿0.42mg、胞二磷胆碱5.25mg尾静脉注射,每天1次;中西药结合组予化痰祛瘀止血汤灌胃(方法同中药组),并予20%甘露醇、速尿、胞二磷胆碱尾静脉注射(方法同西药组)。所有大鼠连续给药3天,每日1次。
1.5 取材
末次给药后24h,给予过量水合氯醛深度麻醉,经腹主动脉取血,血液离心后储存于-80℃冰箱中。心脏生理盐水灌洗,断头取脑,一部分置于冰箱中保存,一部分置于中性福尔马林中固定,作常规HE染色。
1.6 脑组织含水量测定
采用干湿重法。按Elliott公式计算:脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。
1.7 血清NSE含量测定
采用酶联免疫吸附(ELISA)法定量测试。
1.8 统计学处理
所有数据用均数±标准差表示,SPSS 12.0统计软件对5组大鼠指标进行单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
(1)动物行为学指征评价
动物造模后清醒时可见右眼眼睑下垂,左眼眼裂变小,毛色暗淡,枯槁,活动明显减少,嗜睡,摄食及饮水减少;双侧肢体均不同程度瘫痪,提鼠尾悬空时,双侧前肢回收屈曲于胸前,躯体无扭转现象。治疗3天后,模型组大鼠行为学指征较前无改善;中药组、西药组、中西药组大鼠毛色较前有光泽,活动有所增加,摄食及饮水增加;假手术组大鼠一切活动均正常。
(2)脑组织H-E染色光镜观察
假手术组:正常。模型组可见细胞肿胀,胞浆嗜酸性变,胞核深染、碎裂、溶解、固缩或消失,胶质细胞呈空泡样变性,细胞间质疏松。在右侧出血侧,可见基底节区瘀血,血肿周围大部分细胞坏死。梗死灶及血肿周围脑组织间隙均明显扩大,呈疏松网状,细胞肿胀胞浆染色浅淡,多数细胞核溶解,细胞界限不清,为典型水肿变性改变;中药组、西药组水肿情况改善,血肿周围坏死细胞减少,中性粒细胞数减少,神经细胞变性减轻;中西药结合组脑水肿及炎性反应改善最明显,神经细胞变性亦明显减轻。
(3)假手术组、模型组、中药组、西药组、中西药结合组大鼠脑组织含水量比较:模型组脑组织含水量比假手术组、中药组、西药组、中西药组明显升高(P<0.05),并且,中西药组脑组织含水量比中药组、西药组都低(P<0.05),西药组比中药组偏低(P<0.05)(表1)。
(4)假手术组、模型组、中药组、西药组、中西药结合组大鼠血清NSE含量比较:模型组NSE含量明显高于假手术组、中药组、西药组、中西药组(P<0.05),并且,中西药组NSE含量比中药组、西药组都低(P<0.05),中药组高于西药组(P<0.05)(表2)。
3 讨论
神经元特异性烯醇化酶(NSE)为神经元损伤的标志酶[8]。可以敏感反映脑组织的损伤程度。本实验结果表明,混合性中风导致大鼠血清NSE含量明显升高,神经元损伤明显,而中西药结合组血清NSE含量比中药组、西药组都低(P<0.05),说明中西药联合时对神经元保护作用最强。由于本次实验受多方面条件的限制,化痰祛瘀止血汤联合甘露醇、速尿、胞二磷胆碱对混合性中风急性期治疗作用的其它药理机制、各时间点对药理作用的影响有待于进一步研究。
参考文献
[1] 黄如训,钟思陶.动脉硬化性混合性中风.中国神经精神疾病杂志,1989,15(4):1953.
[2] 宋建平,龚自强.混合性中风22例分析.临床神经病学杂志,2000,17(4):125.
[3] 张忠.混合性中风现状与活血化瘀治疗的思考.中国乡村医药杂志,2001,8(12):30.
[4] 唐桂华,王晓霖,武爱云.混合性脑卒中122例分析.中华神经精神科杂志,1993.26(6):338.
[5] Longa EZ, weinstein PR, CarIson 5,et al.Reversibe middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat [J].Stroke 1989,20(1):84-91.
[6] 汤继宏.大鼠脑出血模型.国外医学脑血管疾病分册,1996,4(4):212-214.
[7] 杜冠华.《实验药理学》[M].中国协和医科大学出版社,2004,1:33.
[8] 关景霞,余倡祖,曾庆杏.神经元特异性烯醇化酶和-100蛋白在脑血管疾病中的临床意义(综述)[J].国外医学脑血管病分册12000,8(4):2421.
作者单位:新疆自治区中医医院 830000
【关键词】化痰祛瘀止血汤 混合性中风 脑组织含水量 神经元特异性烯醇化酶
【中图分类号】R473.6 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2010)09-00-02
同一患者脑内不同血管供血区同时或极短时间先后发生的出血和梗塞,称为混合性中风。发病率约2.7%～13.1%不等[1,2]。西医治疗存在扩血管、抗凝、溶栓与止血之间的矛盾,中药活血化瘀法可对两种病灶同时治之[3]。并且中西医结合治疗混合性中风急性期有一定优势,其表现为临床缓解率有明显提高,生存率也明显延长[4]。本课题试图通过实验研究化痰祛瘀止血汤联合西药治疗对混合性中风急性期大鼠NSE表达的影响,从而探索化痰祛瘀止血汤联合西药治疗混合性中风的作用机制。
1 一般资料
1.1 动物和试剂
健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只,体重280-300g,鼠龄8-10周,由新疆医科大学实验动物中心提供。 黄连、陈皮、半夏、枳实、竹茹、胆南星、石菖蒲等15味中药购自新疆乌鲁木齐市参茸药业有限责任公司。使用前常规方法煎煮后浓缩成1g/mL的混悬液。20%甘露醇由石家庄四药有限公司生产(批准文号:国药准字H14023085),速尿由广东南国药业有限责任公司生产(批准文号:国药准字H14023185),胞二磷胆碱由山东新时代药业有限公司生产(批准文号:国药准字H14023083)。大鼠神经元特异性烯醇化酶(NSE)测定试剂盒(批号20070605)购自美国ADL公司。
1.2 实验分组及模型制备
实验前将大鼠于实验室饲养1周,自由进食,室温22-25℃,每日光照12h。实验大鼠共分为5组:假手术组、中药组、西药组、模型组、中西药结合组,每组10只。采用改良的Longa线栓法制作局灶性脑缺血模型[5]与自体血注入脑出血模型[6]相结合制作混合性中风大鼠模型。步骤如下:暴露分离左侧的颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA),结扎ECA近头端及翼腭动脉,夹闭CCA、ICA,在距颈总动脉分叉约4mm处剪断ECA,将栓线插入ECA残端经ICA缓送至颅内,插入深度约为18.5±0.5mm,此时栓线头端已达大脑中动脉(MCA)起始端,减少了MCA的血流,即为MCAO模型。之后立即将大鼠俯卧位固定于大鼠脑立体定位仪上,门齿沟水平比耳间线低2.4mm,沿头皮正中切开一长约10mm纵切口,将微量注射仪尖端定位于前囟前0.5mm,中线右侧旁开3mm处,用微型手钻在此处钻一直径0.5mm的小孔,在大鼠尾部上1/3段,用微量注射仪在尾动脉处取血25ul,迅速将微量注射仪装入立体定位仪上,并沿所钻小孔进针6mm(相当于大鼠尾状核部位),按10ul/min的速度缓慢匀速注入,注血结束后留针5min,缓慢退针,缝合切口并消毒,至此混合性中风大鼠造模完毕。假手术组大鼠只分离、暴露左侧颈内外动脉分叉,不闭塞左侧大脑中动脉,并用25ul生理盐水代替自体不凝血注入右侧尾状核。除假手术组外,其它各组均按照MCAO线栓法及自体血注入脑出血模型法制成混合性中风大鼠模型。
1.3 模型成功的判定标准
大鼠脑组织病理切片可见出血灶和梗塞灶并存。
1.4 动物给药方法
假手术组及模型组予等量生理盐水灌胃;中药组予化痰祛瘀止血汤混悬液灌胃,给药/生理盐水剂量(按人与大鼠体表面积换算法[7]),1.5ml/次,2次/天;西药组予20%甘露醇2.625ml、速尿0.42mg、胞二磷胆碱5.25mg尾静脉注射,每天1次;中西药结合组予化痰祛瘀止血汤灌胃(方法同中药组),并予20%甘露醇、速尿、胞二磷胆碱尾静脉注射(方法同西药组)。所有大鼠连续给药3天,每日1次。
1.5 取材
末次给药后24h,给予过量水合氯醛深度麻醉,经腹主动脉取血,血液离心后储存于-80℃冰箱中。心脏生理盐水灌洗,断头取脑,一部分置于冰箱中保存,一部分置于中性福尔马林中固定,作常规HE染色。
1.6 脑组织含水量测定
采用干湿重法。按Elliott公式计算:脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。
1.7 血清NSE含量测定
采用酶联免疫吸附(ELISA)法定量测试。
1.8 统计学处理
所有数据用均数±标准差表示,SPSS 12.0统计软件对5组大鼠指标进行单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
(1)动物行为学指征评价
动物造模后清醒时可见右眼眼睑下垂,左眼眼裂变小,毛色暗淡,枯槁,活动明显减少,嗜睡,摄食及饮水减少;双侧肢体均不同程度瘫痪,提鼠尾悬空时,双侧前肢回收屈曲于胸前,躯体无扭转现象。治疗3天后,模型组大鼠行为学指征较前无改善;中药组、西药组、中西药组大鼠毛色较前有光泽,活动有所增加,摄食及饮水增加;假手术组大鼠一切活动均正常。
(2)脑组织H-E染色光镜观察
假手术组:正常。模型组可见细胞肿胀,胞浆嗜酸性变,胞核深染、碎裂、溶解、固缩或消失,胶质细胞呈空泡样变性,细胞间质疏松。在右侧出血侧,可见基底节区瘀血,血肿周围大部分细胞坏死。梗死灶及血肿周围脑组织间隙均明显扩大,呈疏松网状,细胞肿胀胞浆染色浅淡,多数细胞核溶解,细胞界限不清,为典型水肿变性改变;中药组、西药组水肿情况改善,血肿周围坏死细胞减少,中性粒细胞数减少,神经细胞变性减轻;中西药结合组脑水肿及炎性反应改善最明显,神经细胞变性亦明显减轻。
(3)假手术组、模型组、中药组、西药组、中西药结合组大鼠脑组织含水量比较:模型组脑组织含水量比假手术组、中药组、西药组、中西药组明显升高(P<0.05),并且,中西药组脑组织含水量比中药组、西药组都低(P<0.05),西药组比中药组偏低(P<0.05)(表1)。
(4)假手术组、模型组、中药组、西药组、中西药结合组大鼠血清NSE含量比较:模型组NSE含量明显高于假手术组、中药组、西药组、中西药组(P<0.05),并且,中西药组NSE含量比中药组、西药组都低(P<0.05),中药组高于西药组(P<0.05)(表2)。
3 讨论
神经元特异性烯醇化酶(NSE)为神经元损伤的标志酶[8]。可以敏感反映脑组织的损伤程度。本实验结果表明,混合性中风导致大鼠血清NSE含量明显升高,神经元损伤明显,而中西药结合组血清NSE含量比中药组、西药组都低(P<0.05),说明中西药联合时对神经元保护作用最强。由于本次实验受多方面条件的限制,化痰祛瘀止血汤联合甘露醇、速尿、胞二磷胆碱对混合性中风急性期治疗作用的其它药理机制、各时间点对药理作用的影响有待于进一步研究。
参考文献
[1] 黄如训,钟思陶.动脉硬化性混合性中风.中国神经精神疾病杂志,1989,15(4):1953.
[2] 宋建平,龚自强.混合性中风22例分析.临床神经病学杂志,2000,17(4):125.
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[5] Longa EZ, weinstein PR, CarIson 5,et al.Reversibe middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat [J].Stroke 1989,20(1):84-91.
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作者单位:新疆自治区中医医院 830000