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摘要： 以双蒸水为溶剂，用反相高效液相色谱-紫外检测法测定蚕蛹虫草样品中虫草素和腺苷含量，并用该方法测定了19-3、17-3、MS、1-1以及1-Y等12种不同虫草菌株栽培的蚕蛹虫草、不同品质的蚕蛹虫草以及蚕蛹虫草不同组织中的虫草素和腺苷的含量。结果表明：1-Y菌株的虫草素和腺苷含量均最高，质量分数达15.45 mg/g和4.40 mg/g；不同品质的蚕蛹虫草中虫草素则以感染而未出草的僵蚕最高；蚕蛹虫草的僵蚕体对虫草素的富集能力高于子座，蚕蛹虫草的子座对腺苷的富集能力高于僵蚕体。该结果可对探求高虫草素含量和高腺苷含量的虫草材料提供理论依据。
关键词：虫草素；腺苷；含量；影响因素；高效液相色谱
中图分类号：S886.9 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2015）01-0109-03
Abstract The contents of cordycepin and adenosine in Cordyceps militaris samples of different qualities， different parts and inoculated with 12 different strains such as 19-3， 17-3， MS， 1-1 and 1-Y were determined by RP-HPLC using double distilled water as solvent. The results indicated that the contents of cordycepin and adenosine in 1-Y were both the highest， and the mass fraction reached 15.45 mg/g and 4.40 mg/g respectively. In Cordyceps militaris of different qualities， the content of cordycepin in silkworm infected but no fruiting were the highest. The enrichment ability of silkworm body to cordycepin was higher than stroma， while that of stroma to adenosine was higher than silkworm body. These results provided theoretical basis for seeking Cordyceps militaris with high cordycepin and adenosine contents.
Key words Cordycepin； Adenosine； Content； Influence factors； RP-HPLC
蚕蛹虫草（Cordyceps militaris），即以家蚕幼虫为寄主栽培的蛹虫草，其虫草形态更接近天然虫草[1]，其所特有虫草素具有抗肿瘤、抗病毒等方面的作用而引起医学界的高度重视。腺苷在抗病毒，抗菌，预防治疗脑血栓、脑溢血，抑制血小板积聚，防止血栓形成，消除面斑和抗衰防皱等方面效果较佳[2]。
由于虫草中虫草素和腺苷含量均偏低，因此快速、准确检测虫草中虫草素和腺苷含量，对蚕蛹虫草品质鉴定至关重要，而提供高虫草素和腺苷含量的蚕蛹虫草材料对于蚕蛹虫草的提纯、深加工等开发、利用具有举足轻重的作用，但是相关报道较少。为此，笔者建立了反相高效液相色谱法，利用19-3、17-3、MS、1-1以及1-Y等12种不同蛹虫草菌株栽培蚕蛹虫草，快速测定虫草素和腺苷含量，以探求高虫草素和腺苷含量的虫草材料。
1 材料与方法
1.1 材料及主要试剂和仪器
菌株：1-Y、DL-4 、MS、DL-5、DL-2、DL-6、19-3、DL-1，用于测定不同菌株对蚕蛹虫草中虫草素和腺苷含量的影响； JL-3、 JL-9，用于测定同一菌株接种后出草的虫草和不出草蚕体虫草素及腺苷含量比较；MS、19-3、1-Y、17-3和1-1，用于测定虫草不同部位中虫草素和腺苷的含量。
材料：本研究室培育的蚕蛹虫草样品，栽培方法见文献[3～5]，经80℃烘干，粉碎，过80目筛后，-20℃冷冻保存待测。
试剂：虫草素标样（SIGMA），腺苷（常州大康）；四氢呋喃（色谱纯），甲醇（色谱纯）；KH2PO4、K2HPO4、乙醇均为分析纯，试验用水为自制双蒸水。
仪器：高效液相色谱仪（大连依利特）配UV200紫外-可变波长检测器，WATERS NOVPAK- C18色谱柱 （5 μm×40 cm）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司生产）；格兰仕微波炉；0.2 μm滤膜，25 μL微量进样器。
1.2 方法
1.2.1 虫草素和腺苷的提取[6]准确称取虫草样品0.1 g，加入双蒸水1 mL，涡流1 min，微波中高火提取1 min，静置得虫草素、腺苷提取液，过0.2 μm滤膜得待测液。
1.2.2 测定方法 采用RP-HPLC法[7]，检测波长259 nm，流动相为四氢呋喃-0.1%甲醇-磷酸盐缓冲液（1∶2∶97，V/V），流速为1.0 mL/min，进样量20 μL，重复3次。分析软件为Echrom98工作站，外标法分析计算。测试完毕用流动相洗色谱柱30 min除去杂质，再用3%甲醇平衡30 min。
2 结果与分析
2.1 蚕蛹虫草的色谱图分析
以上述RP-HPLC方法测定样品中虫草素和腺苷的含量，色谱图（图1、图2）显示目标色谱峰分离效果好。精密度、稳定性、重现性和加样回收率等试验结果均表明该方法稳定可靠，是测定蚕蛹虫草样品中虫草素和腺苷含量的有效方法。 2.2 不同菌株对蚕蛹虫草中虫草素和腺苷含量的影响
以1-Y、MS、19-3、DL-1、DL-2、DL-4、DL-5和DL-6共计8种菌株侵染蚕体培育蚕蛹虫草，研究不同菌株对蚕蛹虫草中虫草素和腺苷含量影响。结果（表1）表明：菌株直接影响蚕蛹虫草中虫草素和腺苷的含量，其中1-Y菌株的虫草素和腺苷含量均最高，质量分数达15.45 mg/g和4.40 mg/g。DL-1的虫草素含量最低，质量分数为6.56 mg/g，DL-6的腺苷含量最低，质量分数为0.84 mg/g。
2.3 不同出草情况对蚕蛹虫草中虫草素和腺苷含量的影响
同一菌株接种感染后，有的蚕体经历僵化、菌丝旺盛生长、转色过程，但最终未能长出子座，简称为未出草僵蚕体。相反，蚕体经历僵化、菌丝旺盛生长、转色过程，最终长出若干子座的，简称蚕蛹虫草全株。由表2看出，JL-3和JL-9两种菌株接种后未出草蚕体中虫草素含量远高于出草的蚕蛹虫草，是正常出草蚕体的2倍还多；但腺苷的表现规律性不强，JL-3菌株出草的虫草全株中含量高于未出草的蚕体，而JL-9菌株出草的虫草全株中含量低于未出草的蚕体。
2.4 不同部位对蚕蛹虫草中虫草素和腺苷含量的影响
为了探讨不同部位对蚕蛹虫草中虫草素和腺苷含量的影响，测定了19-3、17-3、MS、1-1以及1-Y感染的蚕蛹虫草。图3表明虫草素含量在未出草僵蚕体内极高，尤其是MS菌株感染的虫草素含量达15.30 mg/g；出草的蚕蛹虫草中僵蚕体中虫草素含量高于子座中的，其中1-Y菌株感染的僵蚕含量最高，达9.44 mg/g，最低的是17-3菌株感染蚕蛹虫草的子座，仅为0.74 mg/g。图4表明，蚕蛹虫草子座中腺苷含量普遍高于僵蚕体中的，其中1-Y菌株感染的蚕蛹虫草子座中含量最高，达3.15 mg/g。比较可以看出MS 和1-Y菌株的性状较佳。
3 讨论
用RP-HPLC方法测定样品中虫草素和腺苷的含量，目标色谱峰分离效果好，结果稳定可靠，是测定各种虫草样品中虫草素和腺苷含量的有效方法。高虫草素含量的材料是蚕蛹虫草的僵蚕体，而高腺苷含量的虫草材料是蚕蛹虫草的子座。
蚕蛹虫草中的虫草素和腺苷含量受多种因素的影响，如菌株、温度、湿度和光照等。本研究结果显示蚕蛹虫草中的虫草素和腺苷含量均随侵染菌株、虫草品质以及虫草组织部位的不同而变化。其中出草的蚕蛹虫草中1-Y菌株感染的虫草素和腺苷含量最高，不同品质的蚕蛹虫草中虫草素则以感染而未出草的僵蚕最高，虫草素的富集部位则为僵蚕体，与孙迎节等[9]结论相同，但申鸿等[10]、温鲁等[8]认为虫草素的富集部位为子座。原因有两方面，一方面是由于菌株不同，表现不同而影响了结论；另一方面是出草管理如光照、湿度等对虫草素的积累可能也有一定的影响。应进一步研究明确虫草素的形成时期及其它影响虫草素形成的因素。
参 考 文 献：
[1]潘中华.蚕虫草的培育研究[J].江苏蚕业，2001，23（4）：13-14.
[2]孙诗清，李多伟，任静，等.RP-HPLC测定不同产地人工蛹虫草中虫草素的含量[J].西北药学杂志，2005，20（6）：244-245.
[3]顾寅钰，李化秀，施新琴，等.蚕虫草人工栽培技术研究[J].中国蚕业，2012，33（2）：35-38.
[4]顾寅钰，张亚平，陈传杰，等.蛹虫草培养基碳源和氮源对菌丝生长量的影响[J].山东农业科学，2008（7）：77-79.
[5]张亚平，顾寅钰，施新琴，等.人工饲料育家蚕幼虫培育北虫草的试验[J].山东蚕业，2009（2）：33-34.
[6]夏敏.反相高效液相色谱法测定蛹虫草中虫草素的含量[J].淮阴工学院学报，2004，13（3）：22-24.
[7]施新琴，顾寅钰，张亚平，等.高效液相色谱法测定虫草中虫草素和腺苷含量的研究[J].山东蚕业， 2009（2）：8-10.
[8]温鲁，唐玉玲，尹起范，等.蚕虫草不同部位营养与活性成分分析[J]. 中国中药杂志 ， 2005，30（9）：659-661.
[9]孙迎节，吕鹏，凌建亚，等.九州虫草的核苷类成分及不同部位两种活性成分含量的分布[J].药学学报，2003，38（9）：690-694.
[10]申鸿，张龙，王兵，等.蚕体和蛹粉代料培养基上的蛹虫草生长状况与品质检测[J].蚕业科学，2012，38（1）：130-134.
关键词：虫草素；腺苷；含量；影响因素；高效液相色谱
中图分类号：S886.9 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2015）01-0109-03
Abstract The contents of cordycepin and adenosine in Cordyceps militaris samples of different qualities， different parts and inoculated with 12 different strains such as 19-3， 17-3， MS， 1-1 and 1-Y were determined by RP-HPLC using double distilled water as solvent. The results indicated that the contents of cordycepin and adenosine in 1-Y were both the highest， and the mass fraction reached 15.45 mg/g and 4.40 mg/g respectively. In Cordyceps militaris of different qualities， the content of cordycepin in silkworm infected but no fruiting were the highest. The enrichment ability of silkworm body to cordycepin was higher than stroma， while that of stroma to adenosine was higher than silkworm body. These results provided theoretical basis for seeking Cordyceps militaris with high cordycepin and adenosine contents.
Key words Cordycepin； Adenosine； Content； Influence factors； RP-HPLC
蚕蛹虫草（Cordyceps militaris），即以家蚕幼虫为寄主栽培的蛹虫草，其虫草形态更接近天然虫草[1]，其所特有虫草素具有抗肿瘤、抗病毒等方面的作用而引起医学界的高度重视。腺苷在抗病毒，抗菌，预防治疗脑血栓、脑溢血，抑制血小板积聚，防止血栓形成，消除面斑和抗衰防皱等方面效果较佳[2]。
由于虫草中虫草素和腺苷含量均偏低，因此快速、准确检测虫草中虫草素和腺苷含量，对蚕蛹虫草品质鉴定至关重要，而提供高虫草素和腺苷含量的蚕蛹虫草材料对于蚕蛹虫草的提纯、深加工等开发、利用具有举足轻重的作用，但是相关报道较少。为此，笔者建立了反相高效液相色谱法，利用19-3、17-3、MS、1-1以及1-Y等12种不同蛹虫草菌株栽培蚕蛹虫草，快速测定虫草素和腺苷含量，以探求高虫草素和腺苷含量的虫草材料。
1 材料与方法
1.1 材料及主要试剂和仪器
菌株：1-Y、DL-4 、MS、DL-5、DL-2、DL-6、19-3、DL-1，用于测定不同菌株对蚕蛹虫草中虫草素和腺苷含量的影响； JL-3、 JL-9，用于测定同一菌株接种后出草的虫草和不出草蚕体虫草素及腺苷含量比较；MS、19-3、1-Y、17-3和1-1，用于测定虫草不同部位中虫草素和腺苷的含量。
材料：本研究室培育的蚕蛹虫草样品，栽培方法见文献[3～5]，经80℃烘干，粉碎，过80目筛后，-20℃冷冻保存待测。
试剂：虫草素标样（SIGMA），腺苷（常州大康）；四氢呋喃（色谱纯），甲醇（色谱纯）；KH2PO4、K2HPO4、乙醇均为分析纯，试验用水为自制双蒸水。
仪器：高效液相色谱仪（大连依利特）配UV200紫外-可变波长检测器，WATERS NOVPAK- C18色谱柱 （5 μm×40 cm）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司生产）；格兰仕微波炉；0.2 μm滤膜，25 μL微量进样器。
1.2 方法
1.2.1 虫草素和腺苷的提取[6]准确称取虫草样品0.1 g，加入双蒸水1 mL，涡流1 min，微波中高火提取1 min，静置得虫草素、腺苷提取液，过0.2 μm滤膜得待测液。
1.2.2 测定方法 采用RP-HPLC法[7]，检测波长259 nm，流动相为四氢呋喃-0.1%甲醇-磷酸盐缓冲液（1∶2∶97，V/V），流速为1.0 mL/min，进样量20 μL，重复3次。分析软件为Echrom98工作站，外标法分析计算。测试完毕用流动相洗色谱柱30 min除去杂质，再用3%甲醇平衡30 min。
2 结果与分析
2.1 蚕蛹虫草的色谱图分析
以上述RP-HPLC方法测定样品中虫草素和腺苷的含量，色谱图（图1、图2）显示目标色谱峰分离效果好。精密度、稳定性、重现性和加样回收率等试验结果均表明该方法稳定可靠，是测定蚕蛹虫草样品中虫草素和腺苷含量的有效方法。 2.2 不同菌株对蚕蛹虫草中虫草素和腺苷含量的影响
以1-Y、MS、19-3、DL-1、DL-2、DL-4、DL-5和DL-6共计8种菌株侵染蚕体培育蚕蛹虫草，研究不同菌株对蚕蛹虫草中虫草素和腺苷含量影响。结果（表1）表明：菌株直接影响蚕蛹虫草中虫草素和腺苷的含量，其中1-Y菌株的虫草素和腺苷含量均最高，质量分数达15.45 mg/g和4.40 mg/g。DL-1的虫草素含量最低，质量分数为6.56 mg/g，DL-6的腺苷含量最低，质量分数为0.84 mg/g。
2.3 不同出草情况对蚕蛹虫草中虫草素和腺苷含量的影响
同一菌株接种感染后，有的蚕体经历僵化、菌丝旺盛生长、转色过程，但最终未能长出子座，简称为未出草僵蚕体。相反，蚕体经历僵化、菌丝旺盛生长、转色过程，最终长出若干子座的，简称蚕蛹虫草全株。由表2看出，JL-3和JL-9两种菌株接种后未出草蚕体中虫草素含量远高于出草的蚕蛹虫草，是正常出草蚕体的2倍还多；但腺苷的表现规律性不强，JL-3菌株出草的虫草全株中含量高于未出草的蚕体，而JL-9菌株出草的虫草全株中含量低于未出草的蚕体。
2.4 不同部位对蚕蛹虫草中虫草素和腺苷含量的影响
为了探讨不同部位对蚕蛹虫草中虫草素和腺苷含量的影响，测定了19-3、17-3、MS、1-1以及1-Y感染的蚕蛹虫草。图3表明虫草素含量在未出草僵蚕体内极高，尤其是MS菌株感染的虫草素含量达15.30 mg/g；出草的蚕蛹虫草中僵蚕体中虫草素含量高于子座中的，其中1-Y菌株感染的僵蚕含量最高，达9.44 mg/g，最低的是17-3菌株感染蚕蛹虫草的子座，仅为0.74 mg/g。图4表明，蚕蛹虫草子座中腺苷含量普遍高于僵蚕体中的，其中1-Y菌株感染的蚕蛹虫草子座中含量最高，达3.15 mg/g。比较可以看出MS 和1-Y菌株的性状较佳。
3 讨论
用RP-HPLC方法测定样品中虫草素和腺苷的含量，目标色谱峰分离效果好，结果稳定可靠，是测定各种虫草样品中虫草素和腺苷含量的有效方法。高虫草素含量的材料是蚕蛹虫草的僵蚕体，而高腺苷含量的虫草材料是蚕蛹虫草的子座。
蚕蛹虫草中的虫草素和腺苷含量受多种因素的影响，如菌株、温度、湿度和光照等。本研究结果显示蚕蛹虫草中的虫草素和腺苷含量均随侵染菌株、虫草品质以及虫草组织部位的不同而变化。其中出草的蚕蛹虫草中1-Y菌株感染的虫草素和腺苷含量最高，不同品质的蚕蛹虫草中虫草素则以感染而未出草的僵蚕最高，虫草素的富集部位则为僵蚕体，与孙迎节等[9]结论相同，但申鸿等[10]、温鲁等[8]认为虫草素的富集部位为子座。原因有两方面，一方面是由于菌株不同，表现不同而影响了结论；另一方面是出草管理如光照、湿度等对虫草素的积累可能也有一定的影响。应进一步研究明确虫草素的形成时期及其它影响虫草素形成的因素。
参 考 文 献：
[1]潘中华.蚕虫草的培育研究[J].江苏蚕业，2001，23（4）：13-14.
[2]孙诗清，李多伟，任静，等.RP-HPLC测定不同产地人工蛹虫草中虫草素的含量[J].西北药学杂志，2005，20（6）：244-245.
[3]顾寅钰，李化秀，施新琴，等.蚕虫草人工栽培技术研究[J].中国蚕业，2012，33（2）：35-38.
[4]顾寅钰，张亚平，陈传杰，等.蛹虫草培养基碳源和氮源对菌丝生长量的影响[J].山东农业科学，2008（7）：77-79.
[5]张亚平，顾寅钰，施新琴，等.人工饲料育家蚕幼虫培育北虫草的试验[J].山东蚕业，2009（2）：33-34.
[6]夏敏.反相高效液相色谱法测定蛹虫草中虫草素的含量[J].淮阴工学院学报，2004，13（3）：22-24.
[7]施新琴，顾寅钰，张亚平，等.高效液相色谱法测定虫草中虫草素和腺苷含量的研究[J].山东蚕业， 2009（2）：8-10.
[8]温鲁，唐玉玲，尹起范，等.蚕虫草不同部位营养与活性成分分析[J]. 中国中药杂志 ， 2005，30（9）：659-661.
[9]孙迎节，吕鹏，凌建亚，等.九州虫草的核苷类成分及不同部位两种活性成分含量的分布[J].药学学报，2003，38（9）：690-694.
[10]申鸿，张龙，王兵，等.蚕体和蛹粉代料培养基上的蛹虫草生长状况与品质检测[J].蚕业科学，2012，38（1）：130-134.