论文部分内容阅读
摘要[目的]扩大鄂西地区稻瘟病菌菌库，分析其群体结构。[方法]收集鄂西不同地区2011年间的感病稻秆，分离保存稻秆上的穗颈瘟病菌，通过RAPD、repPot2PCR、REMAP 3种标记对分离的菌株进行分子标记。[结果]从9个稻秆上共分离得到29个稻瘟病菌。遗传多样性分析结果表明，相似性水平在75%时， 2011年供试菌株可分为5个遗传宗谱，宗谱3（7个菌株）和4（19个菌株）为优势宗谱，其余3个为稀有宗谱。[结论] 2011年鄂西地区稻瘟病菌由5个遗传宗谱组成。
关键词水稻稻瘟病菌；鄂西地区；遗传多样性
中图分类号S435.111.4+1文献标识码A文章编号0517-6611（2014）14-04249-03
Genetic Diversity of Magnaporthe oryzae in Western Hubei Province in 2011
LI Mi， XU Xin et al（Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plants in Wuling Area of China， Key Laboratory of State Ethnic Affairs Commission for Biological Technology， College of Life Science， South-Central University for Nationalities， Wuhan， Hubei 430074）
Abstract[Objective] To enlarge the physiological race library of Magnaporthe oryzae in Western Hubei Province， analyze the population structure. [Method] The Magnaporthe oryzae spores were isolated from the infected rice panicles， which were collected from western Hubei Province area in 2011. Cluster analysis of the test samples was conducted by RAPD， REMAP and repPot2PCR. [Result] 29 Magnaporthe grisea strains were isolated from 9 panicles. The result of cluster analysis showed there were 5 genetic lineages at similarity coefficient of 0.75. Lineages III and IV， which included 7 strains and 19 strains， respectively， were dominant lineage. [Conclusion]Magnaporthe oryzae in West Hubei Province in 2011 was divided into 5 genetic lineages.
Key wordsMagnaporthe oryzae； Western Hubei Province； Genetic diversity
稻瘟病是由Magnaporthe oryzae引起的一类真菌病害，是水稻的三大病害之一。稻瘟病具有发生地域广、流行频率高、危害影响重等特点。防治稻瘟病的方法主要有药物防治和抗性品种筛选2种方法，受环境和成本等因素的制约，目前主要以选择抗性品种为主。但由于稻瘟病生理小种遗传和致病的多样性，同一水稻产区抗性品种在推广种植数年之后抗性会逐渐减弱，甚至完全丧失[1-2]。因此，利用现有抗性基因和发现新的抗性基因，收集生理小种，调查演变趋势，对合理布局抗病品种，长期、有效地防治稻瘟病具有重要意义。
鄂西地区地处武陵山区北端。该地区属于中亚热带温湿季风气候，雾露多、日照少、湿度大、雨熱同季，降水分布不均匀，极易引起稻瘟病的发生[3]。同时由于境内海拔高低悬殊，气候垂直差异明显，地形地貌复杂，水稻种植的品种和时间也存在明显差异，使得该地区稻瘟病菌生理小种具有品种丰富、组成复杂、致病力强等特点，是研究稻瘟病的代表性地区[4]。恩施地区常年水稻种植面积达4万hm2，据统计因稻瘟病危害常年损失10%～20%，严重的可达40%～50%，局部农田甚至颗粒无收[5]。
目前，对于鄂西地区稻瘟病的研究多集中在水稻抗病品种的选育上，对稻瘟病菌生理小种多样性的研究相对缺乏[6-8]。笔者前期收集了2010年鄂西地区的稻瘟病菌，构建了该地区稻瘟病菌生理小种菌库，分析了稻瘟病菌生理小种的组成结构[9]。笔者通过收集的2011年稻瘟病菌，采用3种不同分子标记分析其遗传结构，为鄂西地区水稻抗病品种的选育和布局提供依据和参考。
1材料与方法
1.1材料水稻感病稻秆均取自湖北恩施自治州5个不同地区，以水稻穗颈部发病为主。每个感病植株取7个稻秆，保留发病部位，将稻秆截至7 cm左右，记录品种、地点、日期。材料取回后置于37 ℃烘箱中3 d后保存于4 ℃冰箱中。
1.2稻瘟病菌单孢的分离
1.2.1稻秆的处理。保存的稻秆于70%乙醇浸泡2 min后水洗3～5次。取灭菌平皿（95 mm×15 mm），底层铺单层纱布，一端用吸水滤纸做成枕头状垫高。将洗好的稻秆倾斜置于平皿中，加适量无菌水保持平皿底层湿润。在平皿上做好相应标记，置27 ℃培养箱中培养3 d，同一类型的稻秆每次培养3个。 1.2.2单孢的分离。配制1%氯霉素的水琼脂平板，用洗耳球轻轻吹打已长满孢子的稻秆，使孢子均匀洒落在上述培养基上。将平皿倒扣在显微镜载物台上，10倍镜下观察。调整视野使视野中只有一个孢子，转动物镜用已蘸有印泥的针头在平皿上标记出相应位置。用接种针将标记位置的孢子挑出来转移到燕麦培养基中培养，每个稻秆挑取7个单孢。
1.3稻瘟病菌的保存将灭菌滤纸条均匀覆盖在燕麦培养基上，每个平皿里放约4个滤纸条。将分离纯化后的菌株接种在覆盖滤纸条的培养基中，放入27 ℃培养箱中培养。待菌长满平皿，将滤纸条挑入5 ml离心管中并置于内含硅胶的玻璃干燥器中干燥30～60 d。用封口膜包好离心管管口，将干燥的菌株放在-80 ℃冰箱中保存待用。
1.4稻瘟病菌的形态观察将分离的稻瘟病菌统一接种到燕麦培养基上，培养7 d后用照相机拍照记录每个菌株的菌落形态。根据每个菌株的气生菌丝发达程度、菌体颜色、菌体边缘等特点，对菌株进行形态学上的初步分类。
1.5供试菌株DNA的分子标记扩增将菌株进行液体培养，收集菌丝提取基因组DNA[10]，运用RAPD、repPot2和REMAP分子标记进行PCR扩增检测[11-14]。使用NTSYS软件的UGMPA算法对扩增结果进行聚类分析[15]。
2结果与分析
2.1感病材料稻瘟病菌分离结果将不同年份间的材料按照编号和分离得到的单个菌落依次统计，从2011年的9个稻秆上成功分离得到29个菌株，编号为A1～A29（表1）。
2.2稻瘟病菌的分子多态性分析用筛选出的16条RAPD标记，3条ISSR标记，以及1对Pot2标记（表2）对分离的菌株DNA分别进行RAPD、REMAP、repPot2PCR扩增。电泳结果显示，多数菌株能扩增出3～8条带，扩增的片段大小为0.2～5.0 kb（图1）。所有供试菌群由上述引物通过PCR扩增共得到54条具有多态性的条带。把条带扩增情况转换成二进制数据，利用NTSYS软件对结果进行聚类分析（图2）。UPGMA聚类分析结果显示，该套分子标记可以将2011年所有供试材料进行有效区分和聚类。相似性水平在75%时，可将2011年供试菌株分为5个遗传宗谱。其中宗谱3包含7个菌株；宗谱4包含19个菌株，为优势宗谱；宗谱1、宗谱2和组宗谱5仅包含1个菌株，为稀有宗谱。（图2）。
3讨论
对稻瘟病的遗传结构和聚类分析多采用RAPD、REMAP或repPot2PCR等分子标记单独分型[16-18]。该研究将3种分子标记相结合，聚类分析结果显示，该方法可有效地将穗颈瘟进行区分和分类，从而建立了一套鉴定鄂西地区水稻穗颈瘟的分子标记体系。此后每年采集的穗颈瘟材料都可通过该套分子标记体系进行鉴定和聚类，从而有效研究该地区穗颈瘟的动态变化。
利用该套分子标记对2011年菌群的遗传结构进行了分析，体现了优势谱系和稀有谱系共存的特征。与2010年菌群结构[9]相比，2年间遗传结构没有发生明显变化。
由于2010和2011年采集的穗颈瘟病菌在宿主材料（水稻品种）上差异较大，可能会影响到其组成和结构。因此，下一步研究拟采用水稻稻瘟病抗性标准材料[19-20]，在孕穗期接种穗颈瘟病菌，进一步调查其毒性，分析该地区穗颈瘟的毒性与其动态变化的关系，从而为该地区水稻抗病品种的选育和布局提供依据和参考。
参考文献
[1] ZEIGLER R S，THOME J，NELSON R J，et al.Linking blast population analysis to rice breeding：a proposed strategy for durable resistance[M]//ZEIGLER R S，LEONG S，TENG P S，et al.Rice Blast Disease.Wallingford England：Commonwealth Agricultural Bureaux International，1994：267-292.
[2] 肖丹凤，张佩胜，王玲，等.中国稻瘟病菌种群分布及优势生理小种的研究进展[J].中国水稻科学，2013（3）：312-320.
[3] 吴双清，王林，卿明凤.水稻区试品种抗稻瘟病鉴定结果分析[J].中国稻米，2011，17（4）：53-55.
[4] 李求文，楊隆维，吴双清，等.武陵山区水稻抗稻瘟病品种的选育与利用[J].种子，2008，27（3）：95-97.
[5] 杨隆维，李继辉，王光建，等.武陵山区杂交水稻育种目标与策略初探[J].杂交水稻，2004，19（6）：13-17.
[6] 袁利群，杨隆维，向极钎，等.三交育种在三系杂交水稻抗瘟育种中的应用研究[J].杂交水稻，2003（6）：10-12.
[7] 谭艳平，王春台，刘兵，等.武陵山区抗稻瘟病新组合长优72的选育及应用[J].安徽农业科学，2013（1）：57-58.
[8] 吕泽文，李求文，秦光才，等.武陵山区国家水稻品种试验回顾和建议[J].中国种业，2013（8）：38-40.
[9] 龙子文，周杰，王春台，等.鄂西地区稻瘟病菌生理小种文库的构建及初步鉴定[J].安徽农业科学，2012（24）：12065-12067.
[10] 吴发红，黄东益，黄小龙，等.几种真菌DNA提取方法的比较[J].中国农学通报，2009（8）：62-64.
[11] GEOGRE M L C，NELSON R J，ZEIGLER R S，et al.Rapid population analysis of Magnaporthe grisea by using rep-PCR and endogenous repetitive DNA sequence[J].Phytopathology，1998，88（3）：223-228. [12] NGUEKO R B，SHEN Y，WANG H K，et al.Genetic diversity analysis of Magnaporthe grisea from some blast nurseries of Hunan province using random amplified polymorphic DNA[J].Journal of Zhejiang University（Agric.&Life Sci.），2004，30（4）：355-362.
[13] CHADHA S，GOPALAKRISHNA T.Comparative assessment of REMAP and ISSR marker assays for genetic polymorphism studies in Magnapothe grisea[J].Current Science，2007，93：5-10.
[14] SCHULMAN A H，FLAVELL A J，PAUX E，et al.The Application of LTR Retrotransposons as Molecular Markers in Plants[M].Methods in Molecular Biology，2012，859：115-150.
[15] ROHLF F J.NTSYSpc：Numerical Taxonomy System，ver.2.20[M].Setauket，NY： Exeter Publishing，Ltd.，2008.
[16] SILVA G B，PRABHU A S，FILIPPI M C C，et al.Genetic and phenotypic diversity of Exeter Publishing，Ltd.：Magnaporthe oryzae Exeter Publishing，Ltd.：from leaves and panicles of rice in commercial fields in the State of Goiás，Brazil[J].Tropical Plant Pathology，2009，34（2）：77-86.
[17] 汪尚，索娜娜，趙红燕，等.反转录转座子分子标记及其在植物研究中的应用[J].杭州师范大学学报：自然科学版，2012（5）：410-415，442.
[18] 曾凡松，杨小林，史文琦，等.湖北省恩施和远安稻区稻瘟病菌群体DNA的指纹分析及宗谱多样性检测[J].华中农业大学学报，2009（6）：669-674.
[19] 李进斌，李成云，张庆，等.22个垂抗稻瘟病基因在云南的利用价值评价[J].云南大学学报：自然科学版，2008（S1）：12-20.
[20] 朱小源，杨祁云，杨健源，等.抗稻瘟病单基因系对籼稻稻瘟病菌小种鉴别力分析[J].植物病理学报，2004（4）：361-368.
关键词水稻稻瘟病菌；鄂西地区；遗传多样性
中图分类号S435.111.4+1文献标识码A文章编号0517-6611（2014）14-04249-03
Genetic Diversity of Magnaporthe oryzae in Western Hubei Province in 2011
LI Mi， XU Xin et al（Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plants in Wuling Area of China， Key Laboratory of State Ethnic Affairs Commission for Biological Technology， College of Life Science， South-Central University for Nationalities， Wuhan， Hubei 430074）
Abstract[Objective] To enlarge the physiological race library of Magnaporthe oryzae in Western Hubei Province， analyze the population structure. [Method] The Magnaporthe oryzae spores were isolated from the infected rice panicles， which were collected from western Hubei Province area in 2011. Cluster analysis of the test samples was conducted by RAPD， REMAP and repPot2PCR. [Result] 29 Magnaporthe grisea strains were isolated from 9 panicles. The result of cluster analysis showed there were 5 genetic lineages at similarity coefficient of 0.75. Lineages III and IV， which included 7 strains and 19 strains， respectively， were dominant lineage. [Conclusion]Magnaporthe oryzae in West Hubei Province in 2011 was divided into 5 genetic lineages.
Key wordsMagnaporthe oryzae； Western Hubei Province； Genetic diversity
稻瘟病是由Magnaporthe oryzae引起的一类真菌病害，是水稻的三大病害之一。稻瘟病具有发生地域广、流行频率高、危害影响重等特点。防治稻瘟病的方法主要有药物防治和抗性品种筛选2种方法，受环境和成本等因素的制约，目前主要以选择抗性品种为主。但由于稻瘟病生理小种遗传和致病的多样性，同一水稻产区抗性品种在推广种植数年之后抗性会逐渐减弱，甚至完全丧失[1-2]。因此，利用现有抗性基因和发现新的抗性基因，收集生理小种，调查演变趋势，对合理布局抗病品种，长期、有效地防治稻瘟病具有重要意义。
鄂西地区地处武陵山区北端。该地区属于中亚热带温湿季风气候，雾露多、日照少、湿度大、雨熱同季，降水分布不均匀，极易引起稻瘟病的发生[3]。同时由于境内海拔高低悬殊，气候垂直差异明显，地形地貌复杂，水稻种植的品种和时间也存在明显差异，使得该地区稻瘟病菌生理小种具有品种丰富、组成复杂、致病力强等特点，是研究稻瘟病的代表性地区[4]。恩施地区常年水稻种植面积达4万hm2，据统计因稻瘟病危害常年损失10%～20%，严重的可达40%～50%，局部农田甚至颗粒无收[5]。
目前，对于鄂西地区稻瘟病的研究多集中在水稻抗病品种的选育上，对稻瘟病菌生理小种多样性的研究相对缺乏[6-8]。笔者前期收集了2010年鄂西地区的稻瘟病菌，构建了该地区稻瘟病菌生理小种菌库，分析了稻瘟病菌生理小种的组成结构[9]。笔者通过收集的2011年稻瘟病菌，采用3种不同分子标记分析其遗传结构，为鄂西地区水稻抗病品种的选育和布局提供依据和参考。
1材料与方法
1.1材料水稻感病稻秆均取自湖北恩施自治州5个不同地区，以水稻穗颈部发病为主。每个感病植株取7个稻秆，保留发病部位，将稻秆截至7 cm左右，记录品种、地点、日期。材料取回后置于37 ℃烘箱中3 d后保存于4 ℃冰箱中。
1.2稻瘟病菌单孢的分离
1.2.1稻秆的处理。保存的稻秆于70%乙醇浸泡2 min后水洗3～5次。取灭菌平皿（95 mm×15 mm），底层铺单层纱布，一端用吸水滤纸做成枕头状垫高。将洗好的稻秆倾斜置于平皿中，加适量无菌水保持平皿底层湿润。在平皿上做好相应标记，置27 ℃培养箱中培养3 d，同一类型的稻秆每次培养3个。 1.2.2单孢的分离。配制1%氯霉素的水琼脂平板，用洗耳球轻轻吹打已长满孢子的稻秆，使孢子均匀洒落在上述培养基上。将平皿倒扣在显微镜载物台上，10倍镜下观察。调整视野使视野中只有一个孢子，转动物镜用已蘸有印泥的针头在平皿上标记出相应位置。用接种针将标记位置的孢子挑出来转移到燕麦培养基中培养，每个稻秆挑取7个单孢。
1.3稻瘟病菌的保存将灭菌滤纸条均匀覆盖在燕麦培养基上，每个平皿里放约4个滤纸条。将分离纯化后的菌株接种在覆盖滤纸条的培养基中，放入27 ℃培养箱中培养。待菌长满平皿，将滤纸条挑入5 ml离心管中并置于内含硅胶的玻璃干燥器中干燥30～60 d。用封口膜包好离心管管口，将干燥的菌株放在-80 ℃冰箱中保存待用。
1.4稻瘟病菌的形态观察将分离的稻瘟病菌统一接种到燕麦培养基上，培养7 d后用照相机拍照记录每个菌株的菌落形态。根据每个菌株的气生菌丝发达程度、菌体颜色、菌体边缘等特点，对菌株进行形态学上的初步分类。
1.5供试菌株DNA的分子标记扩增将菌株进行液体培养，收集菌丝提取基因组DNA[10]，运用RAPD、repPot2和REMAP分子标记进行PCR扩增检测[11-14]。使用NTSYS软件的UGMPA算法对扩增结果进行聚类分析[15]。
2结果与分析
2.1感病材料稻瘟病菌分离结果将不同年份间的材料按照编号和分离得到的单个菌落依次统计，从2011年的9个稻秆上成功分离得到29个菌株，编号为A1～A29（表1）。
2.2稻瘟病菌的分子多态性分析用筛选出的16条RAPD标记，3条ISSR标记，以及1对Pot2标记（表2）对分离的菌株DNA分别进行RAPD、REMAP、repPot2PCR扩增。电泳结果显示，多数菌株能扩增出3～8条带，扩增的片段大小为0.2～5.0 kb（图1）。所有供试菌群由上述引物通过PCR扩增共得到54条具有多态性的条带。把条带扩增情况转换成二进制数据，利用NTSYS软件对结果进行聚类分析（图2）。UPGMA聚类分析结果显示，该套分子标记可以将2011年所有供试材料进行有效区分和聚类。相似性水平在75%时，可将2011年供试菌株分为5个遗传宗谱。其中宗谱3包含7个菌株；宗谱4包含19个菌株，为优势宗谱；宗谱1、宗谱2和组宗谱5仅包含1个菌株，为稀有宗谱。（图2）。
3讨论
对稻瘟病的遗传结构和聚类分析多采用RAPD、REMAP或repPot2PCR等分子标记单独分型[16-18]。该研究将3种分子标记相结合，聚类分析结果显示，该方法可有效地将穗颈瘟进行区分和分类，从而建立了一套鉴定鄂西地区水稻穗颈瘟的分子标记体系。此后每年采集的穗颈瘟材料都可通过该套分子标记体系进行鉴定和聚类，从而有效研究该地区穗颈瘟的动态变化。
利用该套分子标记对2011年菌群的遗传结构进行了分析，体现了优势谱系和稀有谱系共存的特征。与2010年菌群结构[9]相比，2年间遗传结构没有发生明显变化。
由于2010和2011年采集的穗颈瘟病菌在宿主材料（水稻品种）上差异较大，可能会影响到其组成和结构。因此，下一步研究拟采用水稻稻瘟病抗性标准材料[19-20]，在孕穗期接种穗颈瘟病菌，进一步调查其毒性，分析该地区穗颈瘟的毒性与其动态变化的关系，从而为该地区水稻抗病品种的选育和布局提供依据和参考。
参考文献
[1] ZEIGLER R S，THOME J，NELSON R J，et al.Linking blast population analysis to rice breeding：a proposed strategy for durable resistance[M]//ZEIGLER R S，LEONG S，TENG P S，et al.Rice Blast Disease.Wallingford England：Commonwealth Agricultural Bureaux International，1994：267-292.
[2] 肖丹凤，张佩胜，王玲，等.中国稻瘟病菌种群分布及优势生理小种的研究进展[J].中国水稻科学，2013（3）：312-320.
[3] 吴双清，王林，卿明凤.水稻区试品种抗稻瘟病鉴定结果分析[J].中国稻米，2011，17（4）：53-55.
[4] 李求文，楊隆维，吴双清，等.武陵山区水稻抗稻瘟病品种的选育与利用[J].种子，2008，27（3）：95-97.
[5] 杨隆维，李继辉，王光建，等.武陵山区杂交水稻育种目标与策略初探[J].杂交水稻，2004，19（6）：13-17.
[6] 袁利群，杨隆维，向极钎，等.三交育种在三系杂交水稻抗瘟育种中的应用研究[J].杂交水稻，2003（6）：10-12.
[7] 谭艳平，王春台，刘兵，等.武陵山区抗稻瘟病新组合长优72的选育及应用[J].安徽农业科学，2013（1）：57-58.
[8] 吕泽文，李求文，秦光才，等.武陵山区国家水稻品种试验回顾和建议[J].中国种业，2013（8）：38-40.
[9] 龙子文，周杰，王春台，等.鄂西地区稻瘟病菌生理小种文库的构建及初步鉴定[J].安徽农业科学，2012（24）：12065-12067.
[10] 吴发红，黄东益，黄小龙，等.几种真菌DNA提取方法的比较[J].中国农学通报，2009（8）：62-64.
[11] GEOGRE M L C，NELSON R J，ZEIGLER R S，et al.Rapid population analysis of Magnaporthe grisea by using rep-PCR and endogenous repetitive DNA sequence[J].Phytopathology，1998，88（3）：223-228. [12] NGUEKO R B，SHEN Y，WANG H K，et al.Genetic diversity analysis of Magnaporthe grisea from some blast nurseries of Hunan province using random amplified polymorphic DNA[J].Journal of Zhejiang University（Agric.&Life Sci.），2004，30（4）：355-362.
[13] CHADHA S，GOPALAKRISHNA T.Comparative assessment of REMAP and ISSR marker assays for genetic polymorphism studies in Magnapothe grisea[J].Current Science，2007，93：5-10.
[14] SCHULMAN A H，FLAVELL A J，PAUX E，et al.The Application of LTR Retrotransposons as Molecular Markers in Plants[M].Methods in Molecular Biology，2012，859：115-150.
[15] ROHLF F J.NTSYSpc：Numerical Taxonomy System，ver.2.20[M].Setauket，NY： Exeter Publishing，Ltd.，2008.
[16] SILVA G B，PRABHU A S，FILIPPI M C C，et al.Genetic and phenotypic diversity of Exeter Publishing，Ltd.：Magnaporthe oryzae Exeter Publishing，Ltd.：from leaves and panicles of rice in commercial fields in the State of Goiás，Brazil[J].Tropical Plant Pathology，2009，34（2）：77-86.
[17] 汪尚，索娜娜，趙红燕，等.反转录转座子分子标记及其在植物研究中的应用[J].杭州师范大学学报：自然科学版，2012（5）：410-415，442.
[18] 曾凡松，杨小林，史文琦，等.湖北省恩施和远安稻区稻瘟病菌群体DNA的指纹分析及宗谱多样性检测[J].华中农业大学学报，2009（6）：669-674.
[19] 李进斌，李成云，张庆，等.22个垂抗稻瘟病基因在云南的利用价值评价[J].云南大学学报：自然科学版，2008（S1）：12-20.
[20] 朱小源，杨祁云，杨健源，等.抗稻瘟病单基因系对籼稻稻瘟病菌小种鉴别力分析[J].植物病理学报，2004（4）：361-368.