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摘要 [目的]通过检测丁香酚对鲤鱼脑中环磷酸腺苷（cAMP）浓度变化的影响，探讨cAMP在麻醉机制中的作用。[方法]采用酶联免疫吸附试验（ELISA）间接法测定鲤鱼被丁香酚麻醉后不同脑区在诱导期、麻醉期和复苏期的cAMP浓度。[结果]与对照组相比，诱导期组鲤鱼各脑中cAMP浓度极显著地升高（P<0.01）。[结论]丁香酚麻醉鲤鱼的作用可能与提高脑内cAMP浓度、调节cAMP信号转导系统有关。
关键词 鲤鱼；丁香酚；脑；cAMP；麻醉作用
中图分类号 S948 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）10-0232-01
Abstract [Objective]To explore the anesthetic mechanism of eugenol on carp，the concentration change of cyclic adenosine monophosphate（cAMP）in carp brain was detected.[Method]Using the test method of enzyme linked immunosorbent assay （ELISA），the cAMP concentration in different brain regions of carp in the period of anesthesia induction，anesthesia and recovery were determined.[Results]Compared with the control group，the cAMP concentration of the brain in anesthesia group was increased significantly（P<0.01）.[Conclusion]There might be a relationship between the anesthetic effect of eugenol to carp to raise the concentrations of cAMP and regulate the cAMP signal transmission system in carp brains.
Key words carp；eugenol；brain；cAMP；anesthetic effect
麻醉劑能够使鱼体安静，降低应激反应，减少人为操作和运输过程中对鱼体的伤害，从而提高成活率[1]，增加经济效益。丁香酚广泛存在于丁香油、樟脑油、肉豆蔻油等芳香油中[2-3]，是一种毒副作用小、无残留的天然、理想的鱼类麻醉剂[4-5]，但其麻醉作用机理还不明确。本研究从中枢环磷酸腺苷（cAMP）含量的角度考察丁香酚对鲤鱼不同脑区cAMP浓度的影响，以探讨丁香酚对鲤鱼不同脑区cAMP的影响机理，为丁香酚麻醉鲤鱼可能的机制提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 药品与试剂。丁香酚（Xiya Reagen）：纯度 99.0%；吐温80（Solarbio）：纯度99.5%；司班80（Xiya Reagen）：纯度 99.9%；cAMP测定试剂盒：南京建成生物有限公司。
1.1.2 主要仪器。TG16—W微量高速离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司生产；FA2004型电子天平：上海良平仪器仪表有限公司生产；酶标仪：北京普天新桥技术有限公司生产。
1.1.3 试验动物。鲤鱼体重900～1 000 g，体长40～45 cm，试验前喂养于20～22 ℃水中1周，试验前均停食1 d。
1.2 试验方法
1.2.1 丁香酚乳液的配制。按吐温80∶司盘80∶无水乙醇∶丁香酚=4∶2∶1∶2的比例配制乳液[6]，充分搅拌均匀，最后缓慢加入水，静置10 min后备用。
1.2.2 分组处理与脑组织样品采集。取试验用鱼36条，随机分为对照组（9条）和丁香酚处理组（27条），将丁香酚处理组鲤鱼置于含40 mg/L丁香酚乳液的水中麻醉，当鲤鱼分别处于诱导期、麻醉期和麻醉后恢复期时各取9条；解剖鱼头部，在冰面上迅速分离端脑、中脑、小脑、间脑、延脑和脊髓，置于液氮中冷冻保存。麻醉各期判定标准参照张福林[7]的研究成果。
1.2.3 cAMP样品的制备与测定。将待测的脑组织从液氮罐中取出，用预冷的生理盐水按组织（g）∶生理盐水（mL）=1∶9的比例加入玻璃匀浆器中，于4 ℃的环境中充分研磨。将所得匀浆液移至离心管中，离心10 min（3 000 r/min），取上清液，参照cAMP测定试剂盒操作方法测定各脑和脊髓中cAMP的含量。数据以均数±标准差（SD）表示，应用SPSS 17.0 for Windows数据统计分析软件分析。
2 结果与分析
由表1可见，在丁香酚乳剂麻醉过程中，随着麻醉的加深，鲤鱼端脑、中脑、小脑、间脑、延脑和脊髓内cAMP 浓度都不同程度地增高。诱导期组中脑内cAMP浓度极显著高于对照组（P<0.01），小脑内cAMP浓度显著高于对照组（P<0.05）。麻醉期组各脑组织和脊髓中cAMP浓度极显著高于对照组（P<0.01）。恢复期组与麻醉期组相比较，除间脑外，各脑组织与脊髓中cAMP 浓度极显著地下降（P<0.01），而与对照组差异不明显。鲤鱼各个脑区cAMP浓度变化趋势与鲤鱼行为学变化呈一定规律，即丁香酚乳剂麻醉之后，随着鲤鱼意识、反射、躯体行动及运动等受抑制程度的加深，cAMP浓度相应增强，之后鲤鱼从麻醉中逐渐恢复后cAMP浓度也相应下降。因此，丁香酚对鲤鱼的麻醉可能与中枢中cAMP通路有关。
3 结论与讨论
环磷酸腺苷（cAMP）是机体内的重要物质，被称为细胞第二信使[8]。广泛存在于各种细胞中，是细胞内cAMP信号转导系统的重要成分，在神经兴奋性、突触传递及细胞功能代谢等方面具有重要作用。cAMP信号转导系统通过PKA使钠通道蛋白质磷酸化，减少钠离子内流，减弱神经元之间的兴奋传递[9]。cAMP还可通过PKA调节与麻醉有关的受体和通道，影响突触的兴奋传递，从而达到麻醉作用。 在中枢神经系统中，cAMP在某些神经递质引起的膜电位变化中起中介作用，并对某些神经递质起调制作用[10]。钠通道是一种跨膜糖蛋白，是可兴奋细胞动作电位产生和传播的关键因素。许多麻醉药可作用于钠离子通道。Tibbs等[11]证实PKA通过cAMP依赖性蛋白激酶锚定蛋白（AKAP）相互作用连接于脑内钠通道。cAMP信号转导系统与钠离子有密切的联系。cAMP信使系统通过PKA使钠通道蛋白质磷酸化，减少钠离子内流，减弱神经元之间的兴奋传递。研究表明，cAMP在麻醉药的作用机理中发挥重要作用[12-14]。此外，还有研究表明，cAMP的含量与肿瘤的治疗呈正相关[15]。
本试验结果显示，在丁香酚乳剂麻醉过程中，随着麻醉的加深，鯉鱼端脑、中脑、小脑、间脑、延脑和脊髓内cAMP浓度都不同程度增高，而恢复期各脑组织和脊髓内cAMP浓度显著下降，鲤鱼脑内cAMP浓度变化与鱼体麻醉后的行为变化基本一致。提示丁香酚可能是通过提高脑内cAMP浓度、调节cAMP信号转导系统而发挥麻醉作用。
4 参考文献
[1] 刘长琳，何力，陈四清，等.鱼类麻醉研究综述[J].渔业现代化，2007，34（5）：21-25.
[2] 赵艳丽，杨先乐，黄艳平，等.丁香酚对大黄鱼麻醉效果的研究[J].水产科技情报，2002，29（4）：163-165.
[3] GUENETTE，SARAH ANNIE ROSS，ANDREANNE，et al.Pharmacokin-etics of eugenol in rainbow trout[J].European journal of pharmacology，2007，562：60-67.
[4] 孔晓军，刘希望，李剑勇，等.丁香酚的药理学作用研究进展[J].湖北农业科学，2013，52（3）：508-511.
[5] 匡刚桥，李萍，郑曙明，等.丁香酚对斑点叉尾鮰幼鱼的麻醉效果[J].四川动物，2010，29（5）：584-587.
[6] 吕世明，蔡洪能，谭艾娟，等.丁香酚乳液和醇溶液对鲤鱼麻醉作用的对比研究[J].天津农业科学，2009，15（3）：1-3.
[7] 张福林.丁香酚对鲤鱼麻醉作用的研究[J].江西水产科技，2007（4）：15-18.
[8] 党立，王希敏，韩利文，等.环磷酸腺苷的临床应用进展[J].山东科学，2007，20（3）：61.
[9] 张志龙，费剑春.cAMP信使系统和全麻机制[J].国外医学麻醉学与复苏分册，2001，22（5）：260-262.
[10] 刘景生.细胞信息与调控[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联社，1998.
[11] TIBBS V C，GRAY P C，CATTERALL W A，et al.AKAP15 anchors cAMP-dependent protein kinase to brain sodium channels[J].Biol Chem，1998，273：25783-25788.
[12] 张志龙，曾因明，王均，等.氯胺酮对大鼠脑内cAMP信使系统的影响[J].中华麻醉学杂志，2001（21）：379.
[13] 丁海雷，段世明，曾因明，等.依托眯酯对大鼠脑cANP信号转导系统的影响[J].中国药理学通报，2001（17）：718-719.
[14] 冯昌栋，戴体俊，张慧娟，等.异氟醚对大鼠脑内cAMP含量的影响[J].苏州大学学报（医学版），2005，25（4）：577-579.
[15] 胡晨旭，张晶蓉，黄丽华，等.环磷酸腺苷在肿瘤临床治疗中的应用研究进展[J].天津药学，2013，25（6）：49-52.
关键词 鲤鱼；丁香酚；脑；cAMP；麻醉作用
中图分类号 S948 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）10-0232-01
Abstract [Objective]To explore the anesthetic mechanism of eugenol on carp，the concentration change of cyclic adenosine monophosphate（cAMP）in carp brain was detected.[Method]Using the test method of enzyme linked immunosorbent assay （ELISA），the cAMP concentration in different brain regions of carp in the period of anesthesia induction，anesthesia and recovery were determined.[Results]Compared with the control group，the cAMP concentration of the brain in anesthesia group was increased significantly（P<0.01）.[Conclusion]There might be a relationship between the anesthetic effect of eugenol to carp to raise the concentrations of cAMP and regulate the cAMP signal transmission system in carp brains.
Key words carp；eugenol；brain；cAMP；anesthetic effect
麻醉劑能够使鱼体安静，降低应激反应，减少人为操作和运输过程中对鱼体的伤害，从而提高成活率[1]，增加经济效益。丁香酚广泛存在于丁香油、樟脑油、肉豆蔻油等芳香油中[2-3]，是一种毒副作用小、无残留的天然、理想的鱼类麻醉剂[4-5]，但其麻醉作用机理还不明确。本研究从中枢环磷酸腺苷（cAMP）含量的角度考察丁香酚对鲤鱼不同脑区cAMP浓度的影响，以探讨丁香酚对鲤鱼不同脑区cAMP的影响机理，为丁香酚麻醉鲤鱼可能的机制提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 药品与试剂。丁香酚（Xiya Reagen）：纯度 99.0%；吐温80（Solarbio）：纯度99.5%；司班80（Xiya Reagen）：纯度 99.9%；cAMP测定试剂盒：南京建成生物有限公司。
1.1.2 主要仪器。TG16—W微量高速离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司生产；FA2004型电子天平：上海良平仪器仪表有限公司生产；酶标仪：北京普天新桥技术有限公司生产。
1.1.3 试验动物。鲤鱼体重900～1 000 g，体长40～45 cm，试验前喂养于20～22 ℃水中1周，试验前均停食1 d。
1.2 试验方法
1.2.1 丁香酚乳液的配制。按吐温80∶司盘80∶无水乙醇∶丁香酚=4∶2∶1∶2的比例配制乳液[6]，充分搅拌均匀，最后缓慢加入水，静置10 min后备用。
1.2.2 分组处理与脑组织样品采集。取试验用鱼36条，随机分为对照组（9条）和丁香酚处理组（27条），将丁香酚处理组鲤鱼置于含40 mg/L丁香酚乳液的水中麻醉，当鲤鱼分别处于诱导期、麻醉期和麻醉后恢复期时各取9条；解剖鱼头部，在冰面上迅速分离端脑、中脑、小脑、间脑、延脑和脊髓，置于液氮中冷冻保存。麻醉各期判定标准参照张福林[7]的研究成果。
1.2.3 cAMP样品的制备与测定。将待测的脑组织从液氮罐中取出，用预冷的生理盐水按组织（g）∶生理盐水（mL）=1∶9的比例加入玻璃匀浆器中，于4 ℃的环境中充分研磨。将所得匀浆液移至离心管中，离心10 min（3 000 r/min），取上清液，参照cAMP测定试剂盒操作方法测定各脑和脊髓中cAMP的含量。数据以均数±标准差（SD）表示，应用SPSS 17.0 for Windows数据统计分析软件分析。
2 结果与分析
由表1可见，在丁香酚乳剂麻醉过程中，随着麻醉的加深，鲤鱼端脑、中脑、小脑、间脑、延脑和脊髓内cAMP 浓度都不同程度地增高。诱导期组中脑内cAMP浓度极显著高于对照组（P<0.01），小脑内cAMP浓度显著高于对照组（P<0.05）。麻醉期组各脑组织和脊髓中cAMP浓度极显著高于对照组（P<0.01）。恢复期组与麻醉期组相比较，除间脑外，各脑组织与脊髓中cAMP 浓度极显著地下降（P<0.01），而与对照组差异不明显。鲤鱼各个脑区cAMP浓度变化趋势与鲤鱼行为学变化呈一定规律，即丁香酚乳剂麻醉之后，随着鲤鱼意识、反射、躯体行动及运动等受抑制程度的加深，cAMP浓度相应增强，之后鲤鱼从麻醉中逐渐恢复后cAMP浓度也相应下降。因此，丁香酚对鲤鱼的麻醉可能与中枢中cAMP通路有关。
3 结论与讨论
环磷酸腺苷（cAMP）是机体内的重要物质，被称为细胞第二信使[8]。广泛存在于各种细胞中，是细胞内cAMP信号转导系统的重要成分，在神经兴奋性、突触传递及细胞功能代谢等方面具有重要作用。cAMP信号转导系统通过PKA使钠通道蛋白质磷酸化，减少钠离子内流，减弱神经元之间的兴奋传递[9]。cAMP还可通过PKA调节与麻醉有关的受体和通道，影响突触的兴奋传递，从而达到麻醉作用。 在中枢神经系统中，cAMP在某些神经递质引起的膜电位变化中起中介作用，并对某些神经递质起调制作用[10]。钠通道是一种跨膜糖蛋白，是可兴奋细胞动作电位产生和传播的关键因素。许多麻醉药可作用于钠离子通道。Tibbs等[11]证实PKA通过cAMP依赖性蛋白激酶锚定蛋白（AKAP）相互作用连接于脑内钠通道。cAMP信号转导系统与钠离子有密切的联系。cAMP信使系统通过PKA使钠通道蛋白质磷酸化，减少钠离子内流，减弱神经元之间的兴奋传递。研究表明，cAMP在麻醉药的作用机理中发挥重要作用[12-14]。此外，还有研究表明，cAMP的含量与肿瘤的治疗呈正相关[15]。
本试验结果显示，在丁香酚乳剂麻醉过程中，随着麻醉的加深，鯉鱼端脑、中脑、小脑、间脑、延脑和脊髓内cAMP浓度都不同程度增高，而恢复期各脑组织和脊髓内cAMP浓度显著下降，鲤鱼脑内cAMP浓度变化与鱼体麻醉后的行为变化基本一致。提示丁香酚可能是通过提高脑内cAMP浓度、调节cAMP信号转导系统而发挥麻醉作用。
4 参考文献
[1] 刘长琳，何力，陈四清，等.鱼类麻醉研究综述[J].渔业现代化，2007，34（5）：21-25.
[2] 赵艳丽，杨先乐，黄艳平，等.丁香酚对大黄鱼麻醉效果的研究[J].水产科技情报，2002，29（4）：163-165.
[3] GUENETTE，SARAH ANNIE ROSS，ANDREANNE，et al.Pharmacokin-etics of eugenol in rainbow trout[J].European journal of pharmacology，2007，562：60-67.
[4] 孔晓军，刘希望，李剑勇，等.丁香酚的药理学作用研究进展[J].湖北农业科学，2013，52（3）：508-511.
[5] 匡刚桥，李萍，郑曙明，等.丁香酚对斑点叉尾鮰幼鱼的麻醉效果[J].四川动物，2010，29（5）：584-587.
[6] 吕世明，蔡洪能，谭艾娟，等.丁香酚乳液和醇溶液对鲤鱼麻醉作用的对比研究[J].天津农业科学，2009，15（3）：1-3.
[7] 张福林.丁香酚对鲤鱼麻醉作用的研究[J].江西水产科技，2007（4）：15-18.
[8] 党立，王希敏，韩利文，等.环磷酸腺苷的临床应用进展[J].山东科学，2007，20（3）：61.
[9] 张志龙，费剑春.cAMP信使系统和全麻机制[J].国外医学麻醉学与复苏分册，2001，22（5）：260-262.
[10] 刘景生.细胞信息与调控[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联社，1998.
[11] TIBBS V C，GRAY P C，CATTERALL W A，et al.AKAP15 anchors cAMP-dependent protein kinase to brain sodium channels[J].Biol Chem，1998，273：25783-25788.
[12] 张志龙，曾因明，王均，等.氯胺酮对大鼠脑内cAMP信使系统的影响[J].中华麻醉学杂志，2001（21）：379.
[13] 丁海雷，段世明，曾因明，等.依托眯酯对大鼠脑cANP信号转导系统的影响[J].中国药理学通报，2001（17）：718-719.
[14] 冯昌栋，戴体俊，张慧娟，等.异氟醚对大鼠脑内cAMP含量的影响[J].苏州大学学报（医学版），2005，25（4）：577-579.
[15] 胡晨旭，张晶蓉，黄丽华，等.环磷酸腺苷在肿瘤临床治疗中的应用研究进展[J].天津药学，2013，25（6）：49-52.