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摘要 [目的]通过检测丁香酚对鲤鱼脑中环磷酸腺苷(cAMP)浓度变化的影响,探讨cAMP在麻醉机制中的作用。[方法]采用酶联免疫吸附试验(ELISA)间接法测定鲤鱼被丁香酚麻醉后不同脑区在诱导期、麻醉期和复苏期的cAMP浓度。[结果]与对照组相比,诱导期组鲤鱼各脑中cAMP浓度极显著地升高(P<0.01)。[结论]丁香酚麻醉鲤鱼的作用可能与提高脑内cAMP浓度、调节cAMP信号转导系统有关。
关键词 鲤鱼;丁香酚;脑;cAMP;麻醉作用
中图分类号 S948 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2017)10-0232-01
Abstract [Objective]To explore the anesthetic mechanism of eugenol on carp,the concentration change of cyclic adenosine monophosphate(cAMP)in carp brain was detected.[Method]Using the test method of enzyme linked immunosorbent assay (ELISA),the cAMP concentration in different brain regions of carp in the period of anesthesia induction,anesthesia and recovery were determined.[Results]Compared with the control group,the cAMP concentration of the brain in anesthesia group was increased significantly(P<0.01).[Conclusion]There might be a relationship between the anesthetic effect of eugenol to carp to raise the concentrations of cAMP and regulate the cAMP signal transmission system in carp brains.
Key words carp;eugenol;brain;cAMP;anesthetic effect
麻醉劑能够使鱼体安静,降低应激反应,减少人为操作和运输过程中对鱼体的伤害,从而提高成活率[1],增加经济效益。丁香酚广泛存在于丁香油、樟脑油、肉豆蔻油等芳香油中[2-3],是一种毒副作用小、无残留的天然、理想的鱼类麻醉剂[4-5],但其麻醉作用机理还不明确。本研究从中枢环磷酸腺苷(cAMP)含量的角度考察丁香酚对鲤鱼不同脑区cAMP浓度的影响,以探讨丁香酚对鲤鱼不同脑区cAMP的影响机理,为丁香酚麻醉鲤鱼可能的机制提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 药品与试剂。丁香酚(Xiya Reagen):纯度 99.0%;吐温80(Solarbio):纯度99.5%;司班80(Xiya Reagen):纯度 99.9%;cAMP测定试剂盒:南京建成生物有限公司。
1.1.2 主要仪器。TG16—W微量高速离心机:长沙湘仪离心机仪器有限公司生产;FA2004型电子天平:上海良平仪器仪表有限公司生产;酶标仪:北京普天新桥技术有限公司生产。
1.1.3 试验动物。鲤鱼体重900~1 000 g,体长40~45 cm,试验前喂养于20~22 ℃水中1周,试验前均停食1 d。
1.2 试验方法
1.2.1 丁香酚乳液的配制。按吐温80∶司盘80∶无水乙醇∶丁香酚=4∶2∶1∶2的比例配制乳液[6],充分搅拌均匀,最后缓慢加入水,静置10 min后备用。
1.2.2 分组处理与脑组织样品采集。取试验用鱼36条,随机分为对照组(9条)和丁香酚处理组(27条),将丁香酚处理组鲤鱼置于含40 mg/L丁香酚乳液的水中麻醉,当鲤鱼分别处于诱导期、麻醉期和麻醉后恢复期时各取9条;解剖鱼头部,在冰面上迅速分离端脑、中脑、小脑、间脑、延脑和脊髓,置于液氮中冷冻保存。麻醉各期判定标准参照张福林[7]的研究成果。
1.2.3 cAMP样品的制备与测定。将待测的脑组织从液氮罐中取出,用预冷的生理盐水按组织(g)∶生理盐水(mL)=1∶9的比例加入玻璃匀浆器中,于4 ℃的环境中充分研磨。将所得匀浆液移至离心管中,离心10 min(3 000 r/min),取上清液,参照cAMP测定试剂盒操作方法测定各脑和脊髓中cAMP的含量。数据以均数±标准差(SD)表示,应用SPSS 17.0 for Windows数据统计分析软件分析。
2 结果与分析
由表1可见,在丁香酚乳剂麻醉过程中,随着麻醉的加深,鲤鱼端脑、中脑、小脑、间脑、延脑和脊髓内cAMP 浓度都不同程度地增高。诱导期组中脑内cAMP浓度极显著高于对照组(P<0.01),小脑内cAMP浓度显著高于对照组(P<0.05)。麻醉期组各脑组织和脊髓中cAMP浓度极显著高于对照组(P<0.01)。恢复期组与麻醉期组相比较,除间脑外,各脑组织与脊髓中cAMP 浓度极显著地下降(P<0.01),而与对照组差异不明显。鲤鱼各个脑区cAMP浓度变化趋势与鲤鱼行为学变化呈一定规律,即丁香酚乳剂麻醉之后,随着鲤鱼意识、反射、躯体行动及运动等受抑制程度的加深,cAMP浓度相应增强,之后鲤鱼从麻醉中逐渐恢复后cAMP浓度也相应下降。因此,丁香酚对鲤鱼的麻醉可能与中枢中cAMP通路有关。
3 结论与讨论
环磷酸腺苷(cAMP)是机体内的重要物质,被称为细胞第二信使[8]。广泛存在于各种细胞中,是细胞内cAMP信号转导系统的重要成分,在神经兴奋性、突触传递及细胞功能代谢等方面具有重要作用。cAMP信号转导系统通过PKA使钠通道蛋白质磷酸化,减少钠离子内流,减弱神经元之间的兴奋传递[9]。cAMP还可通过PKA调节与麻醉有关的受体和通道,影响突触的兴奋传递,从而达到麻醉作用。 在中枢神经系统中,cAMP在某些神经递质引起的膜电位变化中起中介作用,并对某些神经递质起调制作用[10]。钠通道是一种跨膜糖蛋白,是可兴奋细胞动作电位产生和传播的关键因素。许多麻醉药可作用于钠离子通道。Tibbs等[11]证实PKA通过cAMP依赖性蛋白激酶锚定蛋白(AKAP)相互作用连接于脑内钠通道。cAMP信号转导系统与钠离子有密切的联系。cAMP信使系统通过PKA使钠通道蛋白质磷酸化,减少钠离子内流,减弱神经元之间的兴奋传递。研究表明,cAMP在麻醉药的作用机理中发挥重要作用[12-14]。此外,还有研究表明,cAMP的含量与肿瘤的治疗呈正相关[15]。
本试验结果显示,在丁香酚乳剂麻醉过程中,随着麻醉的加深,鯉鱼端脑、中脑、小脑、间脑、延脑和脊髓内cAMP浓度都不同程度增高,而恢复期各脑组织和脊髓内cAMP浓度显著下降,鲤鱼脑内cAMP浓度变化与鱼体麻醉后的行为变化基本一致。提示丁香酚可能是通过提高脑内cAMP浓度、调节cAMP信号转导系统而发挥麻醉作用。
4 参考文献
[1] 刘长琳,何力,陈四清,等.鱼类麻醉研究综述[J].渔业现代化,2007,34(5):21-25.
[2] 赵艳丽,杨先乐,黄艳平,等.丁香酚对大黄鱼麻醉效果的研究[J].水产科技情报,2002,29(4):163-165.
[3] GUENETTE,SARAH ANNIE ROSS,ANDREANNE,et al.Pharmacokin-etics of eugenol in rainbow trout[J].European journal of pharmacology,2007,562:60-67.
[4] 孔晓军,刘希望,李剑勇,等.丁香酚的药理学作用研究进展[J].湖北农业科学,2013,52(3):508-511.
[5] 匡刚桥,李萍,郑曙明,等.丁香酚对斑点叉尾鮰幼鱼的麻醉效果[J].四川动物,2010,29(5):584-587.
[6] 吕世明,蔡洪能,谭艾娟,等.丁香酚乳液和醇溶液对鲤鱼麻醉作用的对比研究[J].天津农业科学,2009,15(3):1-3.
[7] 张福林.丁香酚对鲤鱼麻醉作用的研究[J].江西水产科技,2007(4):15-18.
[8] 党立,王希敏,韩利文,等.环磷酸腺苷的临床应用进展[J].山东科学,2007,20(3):61.
[9] 张志龙,费剑春.cAMP信使系统和全麻机制[J].国外医学麻醉学与复苏分册,2001,22(5):260-262.
[10] 刘景生.细胞信息与调控[M].北京:北京医科大学中国协和医科大学联社,1998.
[11] TIBBS V C,GRAY P C,CATTERALL W A,et al.AKAP15 anchors cAMP-dependent protein kinase to brain sodium channels[J].Biol Chem,1998,273:25783-25788.
[12] 张志龙,曾因明,王均,等.氯胺酮对大鼠脑内cAMP信使系统的影响[J].中华麻醉学杂志,2001(21):379.
[13] 丁海雷,段世明,曾因明,等.依托眯酯对大鼠脑cANP信号转导系统的影响[J].中国药理学通报,2001(17):718-719.
[14] 冯昌栋,戴体俊,张慧娟,等.异氟醚对大鼠脑内cAMP含量的影响[J].苏州大学学报(医学版),2005,25(4):577-579.
[15] 胡晨旭,张晶蓉,黄丽华,等.环磷酸腺苷在肿瘤临床治疗中的应用研究进展[J].天津药学,2013,25(6):49-52.
关键词 鲤鱼;丁香酚;脑;cAMP;麻醉作用
中图分类号 S948 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2017)10-0232-01
Abstract [Objective]To explore the anesthetic mechanism of eugenol on carp,the concentration change of cyclic adenosine monophosphate(cAMP)in carp brain was detected.[Method]Using the test method of enzyme linked immunosorbent assay (ELISA),the cAMP concentration in different brain regions of carp in the period of anesthesia induction,anesthesia and recovery were determined.[Results]Compared with the control group,the cAMP concentration of the brain in anesthesia group was increased significantly(P<0.01).[Conclusion]There might be a relationship between the anesthetic effect of eugenol to carp to raise the concentrations of cAMP and regulate the cAMP signal transmission system in carp brains.
Key words carp;eugenol;brain;cAMP;anesthetic effect
麻醉劑能够使鱼体安静,降低应激反应,减少人为操作和运输过程中对鱼体的伤害,从而提高成活率[1],增加经济效益。丁香酚广泛存在于丁香油、樟脑油、肉豆蔻油等芳香油中[2-3],是一种毒副作用小、无残留的天然、理想的鱼类麻醉剂[4-5],但其麻醉作用机理还不明确。本研究从中枢环磷酸腺苷(cAMP)含量的角度考察丁香酚对鲤鱼不同脑区cAMP浓度的影响,以探讨丁香酚对鲤鱼不同脑区cAMP的影响机理,为丁香酚麻醉鲤鱼可能的机制提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 药品与试剂。丁香酚(Xiya Reagen):纯度 99.0%;吐温80(Solarbio):纯度99.5%;司班80(Xiya Reagen):纯度 99.9%;cAMP测定试剂盒:南京建成生物有限公司。
1.1.2 主要仪器。TG16—W微量高速离心机:长沙湘仪离心机仪器有限公司生产;FA2004型电子天平:上海良平仪器仪表有限公司生产;酶标仪:北京普天新桥技术有限公司生产。
1.1.3 试验动物。鲤鱼体重900~1 000 g,体长40~45 cm,试验前喂养于20~22 ℃水中1周,试验前均停食1 d。
1.2 试验方法
1.2.1 丁香酚乳液的配制。按吐温80∶司盘80∶无水乙醇∶丁香酚=4∶2∶1∶2的比例配制乳液[6],充分搅拌均匀,最后缓慢加入水,静置10 min后备用。
1.2.2 分组处理与脑组织样品采集。取试验用鱼36条,随机分为对照组(9条)和丁香酚处理组(27条),将丁香酚处理组鲤鱼置于含40 mg/L丁香酚乳液的水中麻醉,当鲤鱼分别处于诱导期、麻醉期和麻醉后恢复期时各取9条;解剖鱼头部,在冰面上迅速分离端脑、中脑、小脑、间脑、延脑和脊髓,置于液氮中冷冻保存。麻醉各期判定标准参照张福林[7]的研究成果。
1.2.3 cAMP样品的制备与测定。将待测的脑组织从液氮罐中取出,用预冷的生理盐水按组织(g)∶生理盐水(mL)=1∶9的比例加入玻璃匀浆器中,于4 ℃的环境中充分研磨。将所得匀浆液移至离心管中,离心10 min(3 000 r/min),取上清液,参照cAMP测定试剂盒操作方法测定各脑和脊髓中cAMP的含量。数据以均数±标准差(SD)表示,应用SPSS 17.0 for Windows数据统计分析软件分析。
2 结果与分析
由表1可见,在丁香酚乳剂麻醉过程中,随着麻醉的加深,鲤鱼端脑、中脑、小脑、间脑、延脑和脊髓内cAMP 浓度都不同程度地增高。诱导期组中脑内cAMP浓度极显著高于对照组(P<0.01),小脑内cAMP浓度显著高于对照组(P<0.05)。麻醉期组各脑组织和脊髓中cAMP浓度极显著高于对照组(P<0.01)。恢复期组与麻醉期组相比较,除间脑外,各脑组织与脊髓中cAMP 浓度极显著地下降(P<0.01),而与对照组差异不明显。鲤鱼各个脑区cAMP浓度变化趋势与鲤鱼行为学变化呈一定规律,即丁香酚乳剂麻醉之后,随着鲤鱼意识、反射、躯体行动及运动等受抑制程度的加深,cAMP浓度相应增强,之后鲤鱼从麻醉中逐渐恢复后cAMP浓度也相应下降。因此,丁香酚对鲤鱼的麻醉可能与中枢中cAMP通路有关。
3 结论与讨论
环磷酸腺苷(cAMP)是机体内的重要物质,被称为细胞第二信使[8]。广泛存在于各种细胞中,是细胞内cAMP信号转导系统的重要成分,在神经兴奋性、突触传递及细胞功能代谢等方面具有重要作用。cAMP信号转导系统通过PKA使钠通道蛋白质磷酸化,减少钠离子内流,减弱神经元之间的兴奋传递[9]。cAMP还可通过PKA调节与麻醉有关的受体和通道,影响突触的兴奋传递,从而达到麻醉作用。 在中枢神经系统中,cAMP在某些神经递质引起的膜电位变化中起中介作用,并对某些神经递质起调制作用[10]。钠通道是一种跨膜糖蛋白,是可兴奋细胞动作电位产生和传播的关键因素。许多麻醉药可作用于钠离子通道。Tibbs等[11]证实PKA通过cAMP依赖性蛋白激酶锚定蛋白(AKAP)相互作用连接于脑内钠通道。cAMP信号转导系统与钠离子有密切的联系。cAMP信使系统通过PKA使钠通道蛋白质磷酸化,减少钠离子内流,减弱神经元之间的兴奋传递。研究表明,cAMP在麻醉药的作用机理中发挥重要作用[12-14]。此外,还有研究表明,cAMP的含量与肿瘤的治疗呈正相关[15]。
本试验结果显示,在丁香酚乳剂麻醉过程中,随着麻醉的加深,鯉鱼端脑、中脑、小脑、间脑、延脑和脊髓内cAMP浓度都不同程度增高,而恢复期各脑组织和脊髓内cAMP浓度显著下降,鲤鱼脑内cAMP浓度变化与鱼体麻醉后的行为变化基本一致。提示丁香酚可能是通过提高脑内cAMP浓度、调节cAMP信号转导系统而发挥麻醉作用。
4 参考文献
[1] 刘长琳,何力,陈四清,等.鱼类麻醉研究综述[J].渔业现代化,2007,34(5):21-25.
[2] 赵艳丽,杨先乐,黄艳平,等.丁香酚对大黄鱼麻醉效果的研究[J].水产科技情报,2002,29(4):163-165.
[3] GUENETTE,SARAH ANNIE ROSS,ANDREANNE,et al.Pharmacokin-etics of eugenol in rainbow trout[J].European journal of pharmacology,2007,562:60-67.
[4] 孔晓军,刘希望,李剑勇,等.丁香酚的药理学作用研究进展[J].湖北农业科学,2013,52(3):508-511.
[5] 匡刚桥,李萍,郑曙明,等.丁香酚对斑点叉尾鮰幼鱼的麻醉效果[J].四川动物,2010,29(5):584-587.
[6] 吕世明,蔡洪能,谭艾娟,等.丁香酚乳液和醇溶液对鲤鱼麻醉作用的对比研究[J].天津农业科学,2009,15(3):1-3.
[7] 张福林.丁香酚对鲤鱼麻醉作用的研究[J].江西水产科技,2007(4):15-18.
[8] 党立,王希敏,韩利文,等.环磷酸腺苷的临床应用进展[J].山东科学,2007,20(3):61.
[9] 张志龙,费剑春.cAMP信使系统和全麻机制[J].国外医学麻醉学与复苏分册,2001,22(5):260-262.
[10] 刘景生.细胞信息与调控[M].北京:北京医科大学中国协和医科大学联社,1998.
[11] TIBBS V C,GRAY P C,CATTERALL W A,et al.AKAP15 anchors cAMP-dependent protein kinase to brain sodium channels[J].Biol Chem,1998,273:25783-25788.
[12] 张志龙,曾因明,王均,等.氯胺酮对大鼠脑内cAMP信使系统的影响[J].中华麻醉学杂志,2001(21):379.
[13] 丁海雷,段世明,曾因明,等.依托眯酯对大鼠脑cANP信号转导系统的影响[J].中国药理学通报,2001(17):718-719.
[14] 冯昌栋,戴体俊,张慧娟,等.异氟醚对大鼠脑内cAMP含量的影响[J].苏州大学学报(医学版),2005,25(4):577-579.
[15] 胡晨旭,张晶蓉,黄丽华,等.环磷酸腺苷在肿瘤临床治疗中的应用研究进展[J].天津药学,2013,25(6):49-52.