【摘 要】
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帕利亚姆病毒(PALV)是一种严重危害反刍动物的虫媒病毒,为建立PALV可视化反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法,本研究根据我国分离的PALV株Seg-7基因序列设计特异性引物,优化反应条件,初步建立PALV的RT-LAMP检测方法.该方法的最佳反应温度为60C～64℃,最佳扩增时间为45 min;引物的最佳浓度为0.2 μmol/L(外引物)、0.8 μmol/L(内引物)、0.6 μmol/L(环引物).利用该方法检测PALV,蓝舌病病毒、流行性出血病病毒、阿卡斑病毒、口蹄疫病毒及非洲马
【机 构】
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云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒重点实验室,云南昆明650224;云南农业大学动物医学院,云南昆明650201
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帕利亚姆病毒(PALV)是一种严重危害反刍动物的虫媒病毒,为建立PALV可视化反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法,本研究根据我国分离的PALV株Seg-7基因序列设计特异性引物,优化反应条件,初步建立PALV的RT-LAMP检测方法.该方法的最佳反应温度为60C～64℃,最佳扩增时间为45 min;引物的最佳浓度为0.2 μmol/L(外引物)、0.8 μmol/L(内引物)、0.6 μmol/L(环引物).利用该方法检测PALV,蓝舌病病毒、流行性出血病病毒、阿卡斑病毒、口蹄疫病毒及非洲马瘟病毒,结果显示除PALV是阳性扩增结果外,其他病毒均无扩增反应,表明该方法特异性较强;将PALV Seg-7 ssRNA 10倍倍比稀释后作为模板,分别进行RT-LAMP、RT-PCR与qRT-PCR检测,结果显示RT-LAMP及qRT-PCR的检测限均为23.7拷贝/μL,比一步法RT-PCR高10倍.利用该方法对我国分离的21株不同血清型PALV株和21份PALV阳性血液检测,结果均为阳性;取40份采自哨兵牛的血液样品分别进行PALV的RT-LAMP与qRT-PCR检测,结果显示两种方法均检测到8份PALV核酸阳性样品,符合率为100％.本研究首次建立了PALV RT-LAMP检测方法,其特异性强、敏感性高、反应时间短、结果可视化,为我国开展PALV现场快速检测及其流行病学研究提供了技术支持.
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