【摘 要】
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目的 克隆小鼠Foxp3(MFoxp3)基因,构建含该基因的原核表达载体,并表达、纯化出小鼠的Foxp3融合蛋白.方法 RT-PCR方法从小鼠淋巴细胞扩增出小鼠Foxp3基因,连入TEasyVector进行
【机 构】
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上海交通大学医学院,上海市免疫学研究所,上海,200025;第二军医大学国际合作肿瘤研究所,上海,200433
【基金项目】
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上海交通大学医学院211工程项目;上海市科委创新团队项目;上海市重点学科建设项目;国家自然科学基金;上海市科学技术委员会专项基金重点项目
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目的 克隆小鼠Foxp3(MFoxp3)基因,构建含该基因的原核表达载体,并表达、纯化出小鼠的Foxp3融合蛋白.方法 RT-PCR方法从小鼠淋巴细胞扩增出小鼠Foxp3基因,连入TEasyVector进行测序,然后将序列正确的小鼠Foxp3基因用酶切的方法从Teasyvector切下,并将其连接到用相同酶切,含有硫氧还蛋白(含6个组氨酸“标签”)的pET32a(+)原核表达载体中构建pET 32a(+)-MFoxp3表达载体.用IPTG诱导转化pET 32a(+)-MFoxp3表达载体的大肠杆菌BL21(DE3),并以镍螯合层析法纯化MFoxp3融合蛋白.结果 经RT-PCR成功地克隆了1,290 bp的小鼠Foxp3基因,测序正确后转化大肠杆菌原核表达载体pET 32a(+),重组质粒在BL21(DE3)中成功表达出分子质量约为63 kD的融合蛋白,运用Ni-NTA方法纯化出目的蛋白,纯化后的蛋白纯度达80%,并用Western Blotting检测蛋白的灵敏度和特异性.结论 构建了小鼠Foxp3的融合蛋白原核表达载体并成功表达与纯化出小鼠Foxp3的融合蛋白.
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