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【摘要】 低氧可以诱发肺动脉高压,低氧环境下血管平滑肌增生和肥大导致的血管重塑是肺动脉高压的重要因素。因此研究血管平滑肌增生和肥大发生的原因、进程、以及如何抑制平滑肌的增生对低氧性肺动脉高压的预防和治疗具有重要的意义。本研究以NF-κB为研究目标,采用药物干预及基因敲除策略证明了NF-κB在低氧性肺动脉高压中被活化,而且NF-κB的抑制剂-穿心莲内酯具有延缓肺动脉高压进程的作用。
【关键词】 穿心莲内酯; 肺动脉高压;核因子-κB 组织因子
The experimental study of andrographolide attenuating hypoxia-induced pulmonary hypertension in a mouse model
WANG Yu-jiu,WANG Jing,LI Wei,et al.
Department of Cardiac Surgery,Affliated Hospital of Binzhou Medical College,Shandong,Binzhou 256603, China
【Abstract】Chronic hypoxia induces pulmonary arterial hypertension (PAH). Smooth muscle cell (SMC) proliferation and hypertrophy are important contributors to the remodeling that occursin chronic hypoxic pulmonary vasculature. The NF-κB transcription factors modulate the expression of tissue factor (TF), E-selectin (CD62E) and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), which are essential for the arterialremodeling. andrographolide (Andro) covalently modifies the reduced cysteine62 of p50-am ajor subunit of NF-κB transcription factors, thus blocking the binding of NF-κB transcription factors to the promoters of their target genes, preventing NF-κB activation and inhibiting inflammation in vitro and in vivo. Here we report that Andro, but not its inactive structural analog 4H-Andro, significantly suppressed hypoxia-induced pulmonary hypertensionin a murine model. Consistently, p50-/- mice manifested attenuated the same results.Our data thus indicate that, by the inhibition of the NF-κB that are important in thrombosis and inflammation,specific inhibitors of p50, such as Andro, may be therapeutically valuable for preventing and treating hypoxia-induced pulmonary hypertension.
【Key words】 NF-κB transcription factors;andrographolide;Hypoxia-induced pulmonary hypertension;Tissue factor
NF-κB参与多种炎性反应和免疫反应有关[1-4]。文献报道,NF-κB信号通路在慢性缺氧过程中被激活,并且抑制该通路可以延缓肺动脉高压的进程。因此,研究NF-κB活化后如何促进肺动脉高压的发生和发展,筛选NF-κB抑制剂用于治疗缺氧性肺动脉高压有着重要的理论意义和应用价值。研究证明,穿心莲内酯有抑制NF-κB活化的作用[5]。因此,设想穿心莲内酯可以抑制肺动脉高压的进程,并就穿心莲内酯减缓肺动脉高压的分子机制做了初步探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物及分组 NF-κB 基因敲除鼠 (B6; 129P2-Nfκb1tm1Bal/J, p50 KO mice) 及其野生型对照鼠(B6129PF2/J) 均自Jackson实验室引进,所用实验鼠均为7周龄雄鼠。 7周龄C57 雄鼠(C57BL/6J)购自中国科学院上海动物中心。
实验动物共分为7组,20只C57鼠在常压氧状态下培养在SPF动物房,做为正常对照组;20只C57鼠只进行低氧条件下的培养做为模型组;20只C57鼠在进行低氧条件下培养的同时给予穿心莲内酯治疗作为药物实验组(Andro组);15只C57鼠进行低氧条件下培养的同时给予二甲基亚砜(DMSO)治疗做为阴性对照组(DMSO组)。另外两组为8只p50敲除鼠(p50 KO组)及9只B6野生鼠(B6组),该两组动物只进行低氧条件下的培养而不给予任何药物;10只B6野生对照鼠在常压氧状态下培养在SPF动物房,作为正常对照组。
1.1.2 主要药物及试剂 穿心莲内酯(Andro)购自Aldrich公司,以5 mg/ml(15 mm)的浓度溶解在二甲基亚砜(DMSO,购自Sigma公司)中作为贮存液,-20℃分装保存。Rabbit anti-von Willebrand factor (vWF) polyclonalAb 购自Sigma公司;实验所涉及的其余试剂均为中国科学院上海生化细胞所常备试剂。
1.2 方法
1.2.1 缺氧性肺动脉高压模型的建立 简言之,将大鼠置于常压低氧舱内,向舱内充入氮气,调控舱内氧浓度为(10±0.15)%,每天缺氧8 h,连续5周。同一基因背景的小鼠置于同一实验舱内,均自由饮水和摄食。从第1天开始,每次缺氧前穿心莲内酯及二甲基亚砜治疗组分别给与穿心莲内酯及二甲基亚砜腹腔注射,剂量为5g/d,持续5周。
1.2.2 右心室肥厚指数及肺动脉压力的测定 5周后麻醉大鼠,腹腔注射复合麻醉剂(剂量为氯胺酮125 mg/kg、甲基噻嗪12.5 mg/kg、阿托品0.025 mg/kg)后。先进行气管插管,而后接小动物呼吸机(Havard),开腹后,经右侧膈肌穿刺右心室测量右心室压力作为肺动脉压力。测定肺动脉压力后,在解剖显微镜下剖胸取出心脏,剪去心房组织,沿室间隔边缘分离右心室,并分别称量右心室(RV)、左心室(LV)加室间隔(S),以RV/(LV+S)比值反映右心室肥厚情况。
1.2.3 组织标本的制备 将肺组织从小鼠尸体上剪下以后,首先以4%多聚甲醛溶液小鼠的肺组织,然后将肺组织固定于4%多聚甲醛溶液中,固定72 h后进行石蜡包埋。切片时延沿左肺门横断取材,切片厚度为5 μm,供HE染色及免疫组化染色所用。
1.2.4 免疫组化 免疫组化实验中的步骤染色如前所述[6,7]。切片梯次水化入双蒸水,之后用柠檬酸溶液修复抗原5 min。于37℃历30 min用3%过氧化氢甲醇溶液中封闭内源性过氧化物酶。10%BSA封闭1 h后加一抗,抗体rabbit anti-mouseTF Ab 的浓度为1 μg/ml ,阴性对照为Rabbit IgG,浓度亦为1 μg/ml 。Rabbit anti-von Willebrand factor (vWF) polyclonalAb以1:500稀释,阴性对照为Rabbit IgG。加一抗后4℃过夜。二抗(anti Rabbit IgG, HRP)工作浓度为1:100。DAB显色,最后用苏木精复染。
1.2.5 免疫荧光共定位 脱水程序同常规免疫组化,入双蒸水中,不修复抗原。然后将组织切片放入甲醇+0.3%的H2O2溶液中,37℃,30 min;TBS洗3次,每次10 min;将玻片上的溶液擦干,加上10%的BSA,放置于封闭盒中,盒中放入适量双蒸水,37℃,30 min;将10%的BSA直接吸掉,加上一抗,4℃,过夜;TBS洗六次,每次5 min;擦干,加上荧光标记的二抗,37℃,1 h;TBS洗六次,每次5 min,擦干,滴上封片剂,盖上盖玻片,避光保存,自然风干。然后用激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)进行扫描拍照,了解有无共定位。Tissue factor和а-actin 的免疫共定位的一抗的浓度分别为1 μg/ml 和10 μg/ml。阴性对照为:兔IgG+ Mouse IgG2а isotype control,二抗为:anti-mouse IgG-FITC(1:1000)+ Anti-rabbitIgG-CY3(1∶100)。用DAPI染色细胞核。
1.2.6 图像分析
用SPOT COOL CCD 进行图像采集, IMAGE2PROplus 4.1软件进行图像分析,每只小鼠选1 张HE或免疫组化染色切片, 每张切片随机选取200x视野10个,统计直径40～60 μm 肺小动脉的vWF和actin染色阳性的血管数目,然后计算actin/vWF比值(%)作为actin表达的阳性率。
1.2.7 数据分析 所有数据均用均数±标准差(x±s)表示。形态学和免疫组化的阳性率分析用NIH image (version 1.6)软件包进行。统计分析用SPSS软件包中one-way ONOVA或(和)student t test进行,P<0.05认为具有统计学差异。
2 结果
2.1 穿心莲内酯治疗或p50敲除可以显著降低右心室肥厚指数和肺动脉压力 经过5周的低氧培养以后,与正常小鼠相比,C57模型组的右心室明显肥厚,主要表现在心电图的P波增高、右心室肥厚指数上升、肺动脉压力增高(见figure1A、B)。但是经过穿心莲内酯干预后,右心室肥厚指数、肺动脉压力升高受到显著抑制(P<0.01)。然而作为穿心莲内酯的非活化形式,氢化穿心莲内酯组的小鼠则没有明显的下降,这说明,在药物干预的过程中,其作用的是穿心莲内酯,而不是溶剂DMSO,氢化穿心莲内酯也无明显的作用。上述现象在B6模型组小鼠和p50敲除组表现的更加明显figure 1C、D),与B6模型组小鼠相比,p50敲除组小鼠的右心室肥厚指数和肺动脉压力的上升受到更加显著的抑制(P<0.01)。将肺组织的切片进行HE染色,肺小动脉的增厚情况也和上述指标相吻合(figure 1E)。
2.2 穿心莲内酯治疗或p50敲除可以显著降低肺小动脉平滑肌的增生 肺动脉压力升高的主要因素是肺小动脉的平滑肌增生,为了明确平滑肌在各组间的差异,笔者进行了肺组织的vWF和actin的免疫组化染色,前者是血管内膜的标记物,而后者可以明确标定血管平滑肌,结果表明穿心莲内酯治疗或p50敲除可以显著降低肺小动脉平滑肌的增生(figure 2),这主要表现在心莲内酯治疗或p50敲除后,actin/vWF的指数显著下降(P<0.05)。
2.3 NF-κB信号通路在缺氧性肺动脉高压模型中被活化 近来的研究表明, 低氧可激活核因子-κB(NF-κB)[1],提示NF-κB 在低氧性肺动脉高压的发病中可能发挥重要作用。为了验证上述观点,笔者进行了免疫荧光染色,实验结果表明在低氧环境下,p65及p50蛋白均有进核现象发生(figure 3),从而再一次证明了NF-κB信号通路可在低氧环境中被活化,因而靶向核因子-κB的抑制剂(如穿心莲内酯)可能会起到抑制肺动脉高压的作用。
2.4 在低氧性肺动脉高压模型中,组织因子和平滑肌存在共定位 NF-κB信号通路可被多种刺激激活,而且该信号通路被激活以后又可产生多种生物学效应。文献报道,其对组织因子具有调控作用,而组织因子对平滑肌增生的作用已被实验证明,笔者根据上述实验结果推测,在低氧性肺动脉高压模型中,组织因子和平滑肌存在共定位。实验结果表明,在非低氧情况下,组织因子在支气管上皮中有表达,而在平滑肌中无明显表达,但在低氧状况下,组织因子在平滑肌中的表达显著上调(figure 4)。组织因子在肺小动脉平滑肌中的表达上调之后和平滑肌的增生是否有必然的联系、又是怎样促进平滑肌增生的尚无确切的机制,这也是本研究下一步延伸的方向。
图1 穿心莲内酯治疗或p50基因敲除后肺动脉高压的进程明显受到抑制。(A)和 (B):经过5周的低氧后,C57模型组小鼠的肺动脉压力及右心室肥厚指数明显升高,而穿心莲内酯治疗后,上述指标明显受到抑制。(C)和(D):经过5周的低氧后,B6模型组小鼠的肺动脉压力及右心室肥厚指数明显升高,而p50基因敲除后后,上述指标受到更加明显的抑制。 (E):图示各组小鼠经过5周的低氧培养后,肺小动脉的增生差异。*P< 0.05 ;**P< 0.01。图中比例尺为30 μm
图2 (A)、(B):穿心莲内酯治疗或p50基因敲除后肺动脉平滑肌的增生明显受到抑制;(C):图示各组小鼠经过5周的低氧培养后,肺小动脉平滑肌的a-actin免疫染色差异。*P< 0.05 ;**P< 0.01。图中比例尺为30 μm
图3 免疫荧光实验证明,低氧环境下,p65和p50蛋白均有进核,从而说明NF-κB信号通路在低氧环境下得以活化。图中比例尺,左侧三图为50 μm,右侧三图为10 μm
图4 组织因子和肺动脉平滑肌存在免疫荧光共定位。图中比例尺为25 μm
3 讨论
低氧可以是多种疾病的一个共同病理环节,短暂低氧可以造成肺动脉压力一过性增高,而持续性低氧则会引起肺动脉压力持续增高,最终引起右心室肥厚,甚至右心衰竭。在上述过程中肺小动脉的血管重塑决定了肺动脉高压的发生和发展,因此研究低氧条件下血管重塑分子机制和研发延缓血管重塑生的药物一直是肺动脉高压研究领域的热点。
血管重塑涉及多种细胞及分子机制, 研究表明,NF-κB在这一过程中起着重要的作用[8-11]。转录因子NF-κB是Rel家族的成员,在炎症反应和宿主免疫过程中调控大量重要基因的表达。在哺乳动物细胞中NF-κB家族有五个主要蛋白分子,即NF- B1 (p105/p50)、NF-κB 2 (p100/p52)、RelA (p65)、RelB和c-Rel。NF-κB是Rel家族蛋白形成的二聚体,研究最广泛而且功能最重要的二聚体是p50/p65。当被某些刺激所活化时,IκB 激酶将IκB蛋白上特异的丝氨酸残基(S32,S36)磷酸化,并在两个赖氨酸残基上由E3泛素连接酶发生泛肽化作用,使它被26S蛋白酶小体识别,最终被迅速降解。失去了IκB抑制的NF-κB二聚体在核定位信号的作用下进入细胞核,发挥激活转录的功能[12]。因此研究NF-κB在低氧性肺动脉高压中的分子机制,筛选NF-κB拮抗剂干预血管重塑意义深远。
我们的实验结果表明,与野生型对照鼠相比,在p50敲除鼠中,右心室肥厚指数、肺动脉压力升高均有显著的下降,p50基因敲除鼠可以显著的抑制肺小动脉血管平滑肌增生,这说明 NF-κB在低氧性血管重塑的过程中发挥重要的作用。在本研究中,利用免疫荧光实验证明NF-κB在低氧性肺动脉高压被激活,这进一步证明了NF-κB在低氧性血管重塑过程中的作用。
在本实验中,笔者首次将穿心莲内酯用于预防低氧性肺动脉高压的研究,结果证明,穿心莲内酯给药鼠的血管重塑进程明显被延缓。这不但说明穿心莲内酯对低氧性肺动脉高压的形成能起到延缓的作用,而且证明筛选NF-κB拮抗剂用于减缓低氧性肺动脉高压是完全可行的。
综上所述,本研究证实了NF-κB信号通路的活化参与了低氧性肺动脉高压的病理进程。NF-κB信号通路的抑制剂-穿心莲内酯可以有效地抑制肺小动脉平滑肌在低氧环境下的增生,从而奠定了靶向抑制低氧环境下肺小血管重塑研发穿心莲内酯及其衍生物的基础,为NF-κB信号通路的抑制剂防治缺氧性肺动脉高压展示了良好的应用前景。
参考文献
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[12] Moynagh PN. The NF-kappaB pathway. J Cell Sci,2005,118(Pt 20):4589-4592.
【关键词】 穿心莲内酯; 肺动脉高压;核因子-κB 组织因子
The experimental study of andrographolide attenuating hypoxia-induced pulmonary hypertension in a mouse model
WANG Yu-jiu,WANG Jing,LI Wei,et al.
Department of Cardiac Surgery,Affliated Hospital of Binzhou Medical College,Shandong,Binzhou 256603, China
【Abstract】Chronic hypoxia induces pulmonary arterial hypertension (PAH). Smooth muscle cell (SMC) proliferation and hypertrophy are important contributors to the remodeling that occursin chronic hypoxic pulmonary vasculature. The NF-κB transcription factors modulate the expression of tissue factor (TF), E-selectin (CD62E) and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), which are essential for the arterialremodeling. andrographolide (Andro) covalently modifies the reduced cysteine62 of p50-am ajor subunit of NF-κB transcription factors, thus blocking the binding of NF-κB transcription factors to the promoters of their target genes, preventing NF-κB activation and inhibiting inflammation in vitro and in vivo. Here we report that Andro, but not its inactive structural analog 4H-Andro, significantly suppressed hypoxia-induced pulmonary hypertensionin a murine model. Consistently, p50-/- mice manifested attenuated the same results.Our data thus indicate that, by the inhibition of the NF-κB that are important in thrombosis and inflammation,specific inhibitors of p50, such as Andro, may be therapeutically valuable for preventing and treating hypoxia-induced pulmonary hypertension.
【Key words】 NF-κB transcription factors;andrographolide;Hypoxia-induced pulmonary hypertension;Tissue factor
NF-κB参与多种炎性反应和免疫反应有关[1-4]。文献报道,NF-κB信号通路在慢性缺氧过程中被激活,并且抑制该通路可以延缓肺动脉高压的进程。因此,研究NF-κB活化后如何促进肺动脉高压的发生和发展,筛选NF-κB抑制剂用于治疗缺氧性肺动脉高压有着重要的理论意义和应用价值。研究证明,穿心莲内酯有抑制NF-κB活化的作用[5]。因此,设想穿心莲内酯可以抑制肺动脉高压的进程,并就穿心莲内酯减缓肺动脉高压的分子机制做了初步探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物及分组 NF-κB 基因敲除鼠 (B6; 129P2-Nfκb1tm1Bal/J, p50 KO mice) 及其野生型对照鼠(B6129PF2/J) 均自Jackson实验室引进,所用实验鼠均为7周龄雄鼠。 7周龄C57 雄鼠(C57BL/6J)购自中国科学院上海动物中心。
实验动物共分为7组,20只C57鼠在常压氧状态下培养在SPF动物房,做为正常对照组;20只C57鼠只进行低氧条件下的培养做为模型组;20只C57鼠在进行低氧条件下培养的同时给予穿心莲内酯治疗作为药物实验组(Andro组);15只C57鼠进行低氧条件下培养的同时给予二甲基亚砜(DMSO)治疗做为阴性对照组(DMSO组)。另外两组为8只p50敲除鼠(p50 KO组)及9只B6野生鼠(B6组),该两组动物只进行低氧条件下的培养而不给予任何药物;10只B6野生对照鼠在常压氧状态下培养在SPF动物房,作为正常对照组。
1.1.2 主要药物及试剂 穿心莲内酯(Andro)购自Aldrich公司,以5 mg/ml(15 mm)的浓度溶解在二甲基亚砜(DMSO,购自Sigma公司)中作为贮存液,-20℃分装保存。Rabbit anti-von Willebrand factor (vWF) polyclonalAb 购自Sigma公司;实验所涉及的其余试剂均为中国科学院上海生化细胞所常备试剂。
1.2 方法
1.2.1 缺氧性肺动脉高压模型的建立 简言之,将大鼠置于常压低氧舱内,向舱内充入氮气,调控舱内氧浓度为(10±0.15)%,每天缺氧8 h,连续5周。同一基因背景的小鼠置于同一实验舱内,均自由饮水和摄食。从第1天开始,每次缺氧前穿心莲内酯及二甲基亚砜治疗组分别给与穿心莲内酯及二甲基亚砜腹腔注射,剂量为5g/d,持续5周。
1.2.2 右心室肥厚指数及肺动脉压力的测定 5周后麻醉大鼠,腹腔注射复合麻醉剂(剂量为氯胺酮125 mg/kg、甲基噻嗪12.5 mg/kg、阿托品0.025 mg/kg)后。先进行气管插管,而后接小动物呼吸机(Havard),开腹后,经右侧膈肌穿刺右心室测量右心室压力作为肺动脉压力。测定肺动脉压力后,在解剖显微镜下剖胸取出心脏,剪去心房组织,沿室间隔边缘分离右心室,并分别称量右心室(RV)、左心室(LV)加室间隔(S),以RV/(LV+S)比值反映右心室肥厚情况。
1.2.3 组织标本的制备 将肺组织从小鼠尸体上剪下以后,首先以4%多聚甲醛溶液小鼠的肺组织,然后将肺组织固定于4%多聚甲醛溶液中,固定72 h后进行石蜡包埋。切片时延沿左肺门横断取材,切片厚度为5 μm,供HE染色及免疫组化染色所用。
1.2.4 免疫组化 免疫组化实验中的步骤染色如前所述[6,7]。切片梯次水化入双蒸水,之后用柠檬酸溶液修复抗原5 min。于37℃历30 min用3%过氧化氢甲醇溶液中封闭内源性过氧化物酶。10%BSA封闭1 h后加一抗,抗体rabbit anti-mouseTF Ab 的浓度为1 μg/ml ,阴性对照为Rabbit IgG,浓度亦为1 μg/ml 。Rabbit anti-von Willebrand factor (vWF) polyclonalAb以1:500稀释,阴性对照为Rabbit IgG。加一抗后4℃过夜。二抗(anti Rabbit IgG, HRP)工作浓度为1:100。DAB显色,最后用苏木精复染。
1.2.5 免疫荧光共定位 脱水程序同常规免疫组化,入双蒸水中,不修复抗原。然后将组织切片放入甲醇+0.3%的H2O2溶液中,37℃,30 min;TBS洗3次,每次10 min;将玻片上的溶液擦干,加上10%的BSA,放置于封闭盒中,盒中放入适量双蒸水,37℃,30 min;将10%的BSA直接吸掉,加上一抗,4℃,过夜;TBS洗六次,每次5 min;擦干,加上荧光标记的二抗,37℃,1 h;TBS洗六次,每次5 min,擦干,滴上封片剂,盖上盖玻片,避光保存,自然风干。然后用激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)进行扫描拍照,了解有无共定位。Tissue factor和а-actin 的免疫共定位的一抗的浓度分别为1 μg/ml 和10 μg/ml。阴性对照为:兔IgG+ Mouse IgG2а isotype control,二抗为:anti-mouse IgG-FITC(1:1000)+ Anti-rabbitIgG-CY3(1∶100)。用DAPI染色细胞核。
1.2.6 图像分析
用SPOT COOL CCD 进行图像采集, IMAGE2PROplus 4.1软件进行图像分析,每只小鼠选1 张HE或免疫组化染色切片, 每张切片随机选取200x视野10个,统计直径40～60 μm 肺小动脉的vWF和actin染色阳性的血管数目,然后计算actin/vWF比值(%)作为actin表达的阳性率。
1.2.7 数据分析 所有数据均用均数±标准差(x±s)表示。形态学和免疫组化的阳性率分析用NIH image (version 1.6)软件包进行。统计分析用SPSS软件包中one-way ONOVA或(和)student t test进行,P<0.05认为具有统计学差异。
2 结果
2.1 穿心莲内酯治疗或p50敲除可以显著降低右心室肥厚指数和肺动脉压力 经过5周的低氧培养以后,与正常小鼠相比,C57模型组的右心室明显肥厚,主要表现在心电图的P波增高、右心室肥厚指数上升、肺动脉压力增高(见figure1A、B)。但是经过穿心莲内酯干预后,右心室肥厚指数、肺动脉压力升高受到显著抑制(P<0.01)。然而作为穿心莲内酯的非活化形式,氢化穿心莲内酯组的小鼠则没有明显的下降,这说明,在药物干预的过程中,其作用的是穿心莲内酯,而不是溶剂DMSO,氢化穿心莲内酯也无明显的作用。上述现象在B6模型组小鼠和p50敲除组表现的更加明显figure 1C、D),与B6模型组小鼠相比,p50敲除组小鼠的右心室肥厚指数和肺动脉压力的上升受到更加显著的抑制(P<0.01)。将肺组织的切片进行HE染色,肺小动脉的增厚情况也和上述指标相吻合(figure 1E)。
2.2 穿心莲内酯治疗或p50敲除可以显著降低肺小动脉平滑肌的增生 肺动脉压力升高的主要因素是肺小动脉的平滑肌增生,为了明确平滑肌在各组间的差异,笔者进行了肺组织的vWF和actin的免疫组化染色,前者是血管内膜的标记物,而后者可以明确标定血管平滑肌,结果表明穿心莲内酯治疗或p50敲除可以显著降低肺小动脉平滑肌的增生(figure 2),这主要表现在心莲内酯治疗或p50敲除后,actin/vWF的指数显著下降(P<0.05)。
2.3 NF-κB信号通路在缺氧性肺动脉高压模型中被活化 近来的研究表明, 低氧可激活核因子-κB(NF-κB)[1],提示NF-κB 在低氧性肺动脉高压的发病中可能发挥重要作用。为了验证上述观点,笔者进行了免疫荧光染色,实验结果表明在低氧环境下,p65及p50蛋白均有进核现象发生(figure 3),从而再一次证明了NF-κB信号通路可在低氧环境中被活化,因而靶向核因子-κB的抑制剂(如穿心莲内酯)可能会起到抑制肺动脉高压的作用。
2.4 在低氧性肺动脉高压模型中,组织因子和平滑肌存在共定位 NF-κB信号通路可被多种刺激激活,而且该信号通路被激活以后又可产生多种生物学效应。文献报道,其对组织因子具有调控作用,而组织因子对平滑肌增生的作用已被实验证明,笔者根据上述实验结果推测,在低氧性肺动脉高压模型中,组织因子和平滑肌存在共定位。实验结果表明,在非低氧情况下,组织因子在支气管上皮中有表达,而在平滑肌中无明显表达,但在低氧状况下,组织因子在平滑肌中的表达显著上调(figure 4)。组织因子在肺小动脉平滑肌中的表达上调之后和平滑肌的增生是否有必然的联系、又是怎样促进平滑肌增生的尚无确切的机制,这也是本研究下一步延伸的方向。
图1 穿心莲内酯治疗或p50基因敲除后肺动脉高压的进程明显受到抑制。(A)和 (B):经过5周的低氧后,C57模型组小鼠的肺动脉压力及右心室肥厚指数明显升高,而穿心莲内酯治疗后,上述指标明显受到抑制。(C)和(D):经过5周的低氧后,B6模型组小鼠的肺动脉压力及右心室肥厚指数明显升高,而p50基因敲除后后,上述指标受到更加明显的抑制。 (E):图示各组小鼠经过5周的低氧培养后,肺小动脉的增生差异。*P< 0.05 ;**P< 0.01。图中比例尺为30 μm
图2 (A)、(B):穿心莲内酯治疗或p50基因敲除后肺动脉平滑肌的增生明显受到抑制;(C):图示各组小鼠经过5周的低氧培养后,肺小动脉平滑肌的a-actin免疫染色差异。*P< 0.05 ;**P< 0.01。图中比例尺为30 μm
图3 免疫荧光实验证明,低氧环境下,p65和p50蛋白均有进核,从而说明NF-κB信号通路在低氧环境下得以活化。图中比例尺,左侧三图为50 μm,右侧三图为10 μm
图4 组织因子和肺动脉平滑肌存在免疫荧光共定位。图中比例尺为25 μm
3 讨论
低氧可以是多种疾病的一个共同病理环节,短暂低氧可以造成肺动脉压力一过性增高,而持续性低氧则会引起肺动脉压力持续增高,最终引起右心室肥厚,甚至右心衰竭。在上述过程中肺小动脉的血管重塑决定了肺动脉高压的发生和发展,因此研究低氧条件下血管重塑分子机制和研发延缓血管重塑生的药物一直是肺动脉高压研究领域的热点。
血管重塑涉及多种细胞及分子机制, 研究表明,NF-κB在这一过程中起着重要的作用[8-11]。转录因子NF-κB是Rel家族的成员,在炎症反应和宿主免疫过程中调控大量重要基因的表达。在哺乳动物细胞中NF-κB家族有五个主要蛋白分子,即NF- B1 (p105/p50)、NF-κB 2 (p100/p52)、RelA (p65)、RelB和c-Rel。NF-κB是Rel家族蛋白形成的二聚体,研究最广泛而且功能最重要的二聚体是p50/p65。当被某些刺激所活化时,IκB 激酶将IκB蛋白上特异的丝氨酸残基(S32,S36)磷酸化,并在两个赖氨酸残基上由E3泛素连接酶发生泛肽化作用,使它被26S蛋白酶小体识别,最终被迅速降解。失去了IκB抑制的NF-κB二聚体在核定位信号的作用下进入细胞核,发挥激活转录的功能[12]。因此研究NF-κB在低氧性肺动脉高压中的分子机制,筛选NF-κB拮抗剂干预血管重塑意义深远。
我们的实验结果表明,与野生型对照鼠相比,在p50敲除鼠中,右心室肥厚指数、肺动脉压力升高均有显著的下降,p50基因敲除鼠可以显著的抑制肺小动脉血管平滑肌增生,这说明 NF-κB在低氧性血管重塑的过程中发挥重要的作用。在本研究中,利用免疫荧光实验证明NF-κB在低氧性肺动脉高压被激活,这进一步证明了NF-κB在低氧性血管重塑过程中的作用。
在本实验中,笔者首次将穿心莲内酯用于预防低氧性肺动脉高压的研究,结果证明,穿心莲内酯给药鼠的血管重塑进程明显被延缓。这不但说明穿心莲内酯对低氧性肺动脉高压的形成能起到延缓的作用,而且证明筛选NF-κB拮抗剂用于减缓低氧性肺动脉高压是完全可行的。
综上所述,本研究证实了NF-κB信号通路的活化参与了低氧性肺动脉高压的病理进程。NF-κB信号通路的抑制剂-穿心莲内酯可以有效地抑制肺小动脉平滑肌在低氧环境下的增生,从而奠定了靶向抑制低氧环境下肺小血管重塑研发穿心莲内酯及其衍生物的基础,为NF-κB信号通路的抑制剂防治缺氧性肺动脉高压展示了良好的应用前景。
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