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摘 要：目的：优化龙胆苦苷脂质体的处方。方法：以包封率为考察指标，采用逆向蒸發法，在单因素的实验基础之上采用星点效应面法对龙胆苦苷制备工艺进行优化。结果 确定龙胆苦苷脂质体处方为大豆卵磷脂与胆固醇用量比2.2：1，大豆卵磷脂与龙胆苦苷用量比19：1，磷酸缓冲液pH值为5.8。结论 在最优处方工艺条件下制备的龙胆苦苷脂质体包封率为63.78%，脂质体外观成规则的圆球形，平均粒径为178 nm，且粒径分布均匀。
关键词：龙胆苦苷；脂质体；包封率；星点效应面
中图分类号：R286.1 文献标识码：A 文章编号：1006-8937（2016）24-0179-02
龙胆苦苷是从龙胆、秦艽等龙胆科植物中提取的环烯醚萜苷类化合物，药理实验表明龙胆苦苷具有明显的保肝利胆[1]。一个比较罕见的天然具有镇痛抗炎作用的化合物。但龙胆苦苷在生物体内吸收快、消除快，在大鼠体内代谢的消除半衰期只有0.64 h[2]。脂质体具有类细胞结构，能够改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中蓄积，从而提高药物的治疗指数、减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性[3]，本文拟制备龙胆苦苷脂质体，目的在于提高药物疗效和生物利用度。
1 仪器和试药
1.1 仪 器
LC-20AT型高效液相色谱仪（含LC-20AT型泵、SPD-20A型紫外可见双波长检测器，日本岛津公司）；JEM-2000EX透射电子显微镜（日本电子公司）；HSE-D型循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限公司）；
RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；FY-200高压匀质机（上海仪器厂）；TGL-168GB离心机（上海安亭科学仪器有限公司）。
1.2 试 药
龙胆苦苷对照品（纯度≧99.9%，批号；100174-2014）；大豆卵磷脂、胆固醇、三氯甲烷（天津博迪化工有限公司）；色谱甲醇（Sigma公司，色谱醇）；其他辅助试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 龙胆苦苷制备方法
精密称取胆固醇100 mg ，磷脂200 mg，置于250 mL圆底烧瓶中，并加入三氯甲烷25 mL并溶解，再加入含龙胆苦苷
1 mg/mL的pH7.0磷酸盐缓冲液10 mL，超声处理15 min，40 ℃水浴减压蒸发，除去有机溶剂，即可得龙胆苦苷脂质体。
2.2 龙胆苦苷分析方法的建立
2.2.1 色谱条件
LC-20AT C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，粒径：5 μm）；柱温为25 ℃；流动相：甲醇-水（30/70，V/V）；体积流量为1.0 mL/min；进样量为10 μL；检测波长为270 nm。
2.2.2 对照品溶液
精密称取10.05 mg龙胆苦苷对照品，置于10 mL容量瓶内用甲醇溶液并定容，配制成质量浓度每1 mL含1.005 μg的对照品溶液。
2.2.3 供试品溶液
吸取脂质体溶液1 mL于100 mL容量瓶中，加适量甲醇后，超声15 min。用甲醇定容，既得供试品溶液。
2.2.4 空白对照品溶液
吸取空白脂质体混浊液1 mL于100 mL容量瓶内，加适量甲醇后，超声15 min。用甲醇定容。
2.2.5 标准曲线的绘制
分别精密吸取储备液制得质量浓度为5.025，10.05，20.10，
30.15，40.20μg/mL的系列标准溶液。分别取上述溶液10μg进样，回归结果显示，龙胆苦苷面积（A）与其质量浓度（C）在5.025至40.20μg/mL的范围线性良好，回归方程为：
A=9.137C+3.853，R=0.9992。
2.2.6 包封率的测定
精密量取1.0 mL龙胆苦苷脂质体样品液，在10 000 r·min-1转速的高速离心机中离心30 min之后，取其上清液用0.22 μm滤膜过滤， 按“2.2.1”项下色谱条件，进样测定药物游离浓度（C游）。再另外精密量取1.0mL龙胆苦苷脂质体样品液，加甲醇破乳后用0.22 μm滤膜过滤取其样品液澄清，按“2.2.1”项下色谱条件测定，即得药物的总浓度（C总）。
按照下式求算包封率：EE%=（ 1-C游/ C总）×100%平行测定3次，求得平均值。
2.3 星点效应面设计
根据相关文献资料及预实验结果确定影响包封率三种主要因素，既大豆卵磷脂与胆固醇用量比（A）、大豆卵磷脂与龙胆苦苷用量比（B）、磷酸缓冲液pH（C）。三个主要因素进行星点设计，大豆卵磷脂与胆固醇用量比（A）分别为1：1、2：1、3：1；大豆卵磷脂与龙胆苦苷用量比（B）分别为25：1、20：1、10：1；磷酸缓冲液pH（C）分别为5.8、7.0、7.8。星点设计及结果，见表1。
采用Design-Expert8.05软件绘制影响因素与和指标之间的三位效应面结果，如图1所示。
以大豆卵磷脂与胆固醇用量比（A）、大豆卵磷脂与龙胆苦苷用量比（B）、磷酸缓冲液pH（C）为自变量，包封率（Y）为因变量进行回归分析。由方差分析可以得出自变量一次项A、B，C、二次项A2、B2显著（P<0.05）。
选用二次模型，得到多元二次回归模型为Y=65.37+2.14X1+2.56X2-3.26X3+1.75X1X2-1.68 X1X3+0.68 X2X3-13..85X12-3.45X22+0.99X32（R2=0.9562）；由图2和Design-Expert 8.05b软件数据分析得知大豆卵磷脂与胆固醇用量比2.2：1、大豆卵磷脂与龙胆苦苷用量比（B）19：1、磷酸缓冲液pH（C）5.8。
2.4 验证试验
确定处方和工艺的条件下制备了3批龙胆苦苷脂质体（批号分别是150401，150402，150403）进行试验验证研究，最优处方下的实际包封率为（63.8±2.48）%、（64.5± 1.37）%、（63.1±1.95）%
2.5 理化性质考查
2.5.1 电 镜
在电镜下脂质体，脂质体呈规整球形，大多数为单囊结构，形态良好。
2.5.2 粒径大小及分布
将制的脂质体置于透射电镜下，观察粒子形状及测定粒子大小。结果脂质体粒径主要分布在于112～450 nm，平均粒径
178 nm。
3 讨 论
龙胆苦苷为水溶性药物，为了提高亲水性其脂溶性，本文采用将龙胆苦苷制备成脂质体的方法，进而提高其生物利用度。脂质体的包封率通常是考察脂质体的重要指标，因此本实验以包封率为考察指标选择大豆卵磷脂与胆固醇用量比、大豆卵磷脂与龙胆苦苷用量比、磷酸缓冲液pH为考察因素。
采用星点效应面法得到的最优处方为：大豆卵磷脂与胆固醇用量比2.2：1；大豆卵磷脂与龙胆苦苷用量比19：1；磷酸缓冲液pH值为5.8，超声10 min，温度40 ℃。
参考文献：
[1] 江蔚新，薛宝玉.龙胆对小鼠急性肝损伤保护作用的研究[J].中国中药 杂志2005，30（14）： 1105- 1107.
[2] 姜少灏，康丽娟，蒋晔，等.龙胆及其复方中龙胆苦苷在大鼠体内的药动 学研究[J].中国药学杂志，2005，40（3）：212-215.
[3] 陆彬.药物新剂型与新技术[M].北京：人民卫生出版社，1998：14.
关键词：龙胆苦苷；脂质体；包封率；星点效应面
中图分类号：R286.1 文献标识码：A 文章编号：1006-8937（2016）24-0179-02
龙胆苦苷是从龙胆、秦艽等龙胆科植物中提取的环烯醚萜苷类化合物，药理实验表明龙胆苦苷具有明显的保肝利胆[1]。一个比较罕见的天然具有镇痛抗炎作用的化合物。但龙胆苦苷在生物体内吸收快、消除快，在大鼠体内代谢的消除半衰期只有0.64 h[2]。脂质体具有类细胞结构，能够改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中蓄积，从而提高药物的治疗指数、减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性[3]，本文拟制备龙胆苦苷脂质体，目的在于提高药物疗效和生物利用度。
1 仪器和试药
1.1 仪 器
LC-20AT型高效液相色谱仪（含LC-20AT型泵、SPD-20A型紫外可见双波长检测器，日本岛津公司）；JEM-2000EX透射电子显微镜（日本电子公司）；HSE-D型循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限公司）；
RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；FY-200高压匀质机（上海仪器厂）；TGL-168GB离心机（上海安亭科学仪器有限公司）。
1.2 试 药
龙胆苦苷对照品（纯度≧99.9%，批号；100174-2014）；大豆卵磷脂、胆固醇、三氯甲烷（天津博迪化工有限公司）；色谱甲醇（Sigma公司，色谱醇）；其他辅助试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 龙胆苦苷制备方法
精密称取胆固醇100 mg ，磷脂200 mg，置于250 mL圆底烧瓶中，并加入三氯甲烷25 mL并溶解，再加入含龙胆苦苷
1 mg/mL的pH7.0磷酸盐缓冲液10 mL，超声处理15 min，40 ℃水浴减压蒸发，除去有机溶剂，即可得龙胆苦苷脂质体。
2.2 龙胆苦苷分析方法的建立
2.2.1 色谱条件
LC-20AT C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，粒径：5 μm）；柱温为25 ℃；流动相：甲醇-水（30/70，V/V）；体积流量为1.0 mL/min；进样量为10 μL；检测波长为270 nm。
2.2.2 对照品溶液
精密称取10.05 mg龙胆苦苷对照品，置于10 mL容量瓶内用甲醇溶液并定容，配制成质量浓度每1 mL含1.005 μg的对照品溶液。
2.2.3 供试品溶液
吸取脂质体溶液1 mL于100 mL容量瓶中，加适量甲醇后，超声15 min。用甲醇定容，既得供试品溶液。
2.2.4 空白对照品溶液
吸取空白脂质体混浊液1 mL于100 mL容量瓶内，加适量甲醇后，超声15 min。用甲醇定容。
2.2.5 标准曲线的绘制
分别精密吸取储备液制得质量浓度为5.025，10.05，20.10，
30.15，40.20μg/mL的系列标准溶液。分别取上述溶液10μg进样，回归结果显示，龙胆苦苷面积（A）与其质量浓度（C）在5.025至40.20μg/mL的范围线性良好，回归方程为：
A=9.137C+3.853，R=0.9992。
2.2.6 包封率的测定
精密量取1.0 mL龙胆苦苷脂质体样品液，在10 000 r·min-1转速的高速离心机中离心30 min之后，取其上清液用0.22 μm滤膜过滤， 按“2.2.1”项下色谱条件，进样测定药物游离浓度（C游）。再另外精密量取1.0mL龙胆苦苷脂质体样品液，加甲醇破乳后用0.22 μm滤膜过滤取其样品液澄清，按“2.2.1”项下色谱条件测定，即得药物的总浓度（C总）。
按照下式求算包封率：EE%=（ 1-C游/ C总）×100%平行测定3次，求得平均值。
2.3 星点效应面设计
根据相关文献资料及预实验结果确定影响包封率三种主要因素，既大豆卵磷脂与胆固醇用量比（A）、大豆卵磷脂与龙胆苦苷用量比（B）、磷酸缓冲液pH（C）。三个主要因素进行星点设计，大豆卵磷脂与胆固醇用量比（A）分别为1：1、2：1、3：1；大豆卵磷脂与龙胆苦苷用量比（B）分别为25：1、20：1、10：1；磷酸缓冲液pH（C）分别为5.8、7.0、7.8。星点设计及结果，见表1。
采用Design-Expert8.05软件绘制影响因素与和指标之间的三位效应面结果，如图1所示。
以大豆卵磷脂与胆固醇用量比（A）、大豆卵磷脂与龙胆苦苷用量比（B）、磷酸缓冲液pH（C）为自变量，包封率（Y）为因变量进行回归分析。由方差分析可以得出自变量一次项A、B，C、二次项A2、B2显著（P<0.05）。
选用二次模型，得到多元二次回归模型为Y=65.37+2.14X1+2.56X2-3.26X3+1.75X1X2-1.68 X1X3+0.68 X2X3-13..85X12-3.45X22+0.99X32（R2=0.9562）；由图2和Design-Expert 8.05b软件数据分析得知大豆卵磷脂与胆固醇用量比2.2：1、大豆卵磷脂与龙胆苦苷用量比（B）19：1、磷酸缓冲液pH（C）5.8。
2.4 验证试验
确定处方和工艺的条件下制备了3批龙胆苦苷脂质体（批号分别是150401，150402，150403）进行试验验证研究，最优处方下的实际包封率为（63.8±2.48）%、（64.5± 1.37）%、（63.1±1.95）%
2.5 理化性质考查
2.5.1 电 镜
在电镜下脂质体，脂质体呈规整球形，大多数为单囊结构，形态良好。
2.5.2 粒径大小及分布
将制的脂质体置于透射电镜下，观察粒子形状及测定粒子大小。结果脂质体粒径主要分布在于112～450 nm，平均粒径
178 nm。
3 讨 论
龙胆苦苷为水溶性药物，为了提高亲水性其脂溶性，本文采用将龙胆苦苷制备成脂质体的方法，进而提高其生物利用度。脂质体的包封率通常是考察脂质体的重要指标，因此本实验以包封率为考察指标选择大豆卵磷脂与胆固醇用量比、大豆卵磷脂与龙胆苦苷用量比、磷酸缓冲液pH为考察因素。
采用星点效应面法得到的最优处方为：大豆卵磷脂与胆固醇用量比2.2：1；大豆卵磷脂与龙胆苦苷用量比19：1；磷酸缓冲液pH值为5.8，超声10 min，温度40 ℃。
参考文献：
[1] 江蔚新，薛宝玉.龙胆对小鼠急性肝损伤保护作用的研究[J].中国中药 杂志2005，30（14）： 1105- 1107.
[2] 姜少灏，康丽娟，蒋晔，等.龙胆及其复方中龙胆苦苷在大鼠体内的药动 学研究[J].中国药学杂志，2005，40（3）：212-215.
[3] 陆彬.药物新剂型与新技术[M].北京：人民卫生出版社，1998：14.