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摘 要 以文心兰试管苗为材料，采用RT-PCR结合RACE法，克隆文心兰OnCOBRA基因的cDNA全长和DNA序列。结果表明：COBRA全长为1 601 bp，开放阅读框（ORF）为1 386 bp，共编码461个氨基酸；OnCOBRA的DNA序列共2 949 bp，且含有6个外显子和5个内含子。生物信息学结果表明，OnCOBRA属于不稳定的疏水蛋白，具有信号肽、跨膜结构和CCVS保守区域，亚细胞定位于细胞膜中；与无油樟、玉米、籼稻、拟南芥等具有较高的同源性。系统进化树分析结果表明，文心兰OnCOBRA蛋白与玉米（ZmCOBRA）、无油樟（AtCOBRA）、籼稻（OsCOBRA）处于统一分枝，推测OnCOBRA基因是COBRA基因家族的成员。qPCR结果表明，OnCORBA为组成型表达，在成苗期表达量最高，在文心兰类原球茎时期表达量最低。
关键词 文心兰；COBRA；克隆；生物信息学；qPCR
中图分类号 S682.31 文献标识码 A
Molecular Cloning and Expression Pattern
of OnCOBRA Gene in Oncidium
LI Ling， LAI Zhongxiong*， CHEN Yukun， LIAN Conglong， LIN Heyan
Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002 China
Abstract The RT-PCR combined with RACE method was used to clone the complete cDNA sequences and DNA sequences of OnCOBRA from Oncidium vitro plant. The complete cDNA sequence of OnCOBRA was 1 601 bp， encoding 461 amino acids， the DNA sequence of OnCOBRA was 2 949 bp which had 6 exons and 5 introns. The sequences of nucleotides of OnCOBRA and amino acids of OnCOBRA was high homologous with those of the known COBRA genes in other species. OnCOBRA located in plasma membrane， which had a signal peptide， transmembrane structure and CCVS protein domain. Phylogenetic tree of COBRA in plants indicated that OnCOBRA， ZmCOBRA， AtCOBRA， and OsCOBRA belonged to the same branch， and It putatively belonged to COBRA family. qPCR results indicated that OnCOBRA was constitutive expression and showed approximately a inverted“V”curve， it expressed at the highest levels in the seedings and the lowest levels in the PLB.
Key words Oncidium；COBRA；Clone；Bioinformatics；qPCR
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.018
文心兰属兰科文心兰属植物，植株轻巧、花茎轻盈下垂、花朵奇异可爱且色彩鲜艳，故又名跳舞兰、金碟兰、舞女兰等，是世界上重要的盆花和切花种类之一。
COBR基因首先是在分析拟南芥的根发育过程中发现，存在于细胞异常膨胀的突变体中[1]。COBRA基因编码一种糖磷脂酰肌醇（Glycosyl-phosphatidyl inositol-anchored protein，GPI）锚定蛋白，控制细胞壁纤维素微纤丝的正确定位和细胞的定向伸长[1-3]，同时伴随着纤维素含量的减少和纤维素不同方向的排列[4]。糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白由蛋白质、脂质和糖链三者共价结合的复杂的糖复合物，是一类细胞表面蛋白[5]。在动物细胞中这种脂质链接用来定位极性蛋白，且研究较为广[6]。在植物细胞中，最近十几年才开始研究，它作用于植物细胞膜外表面，通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）连接，能感知细胞壁相关信息并传导到细胞膜上。植物的生长发育与细胞壁有着密切的关系，如植物的形态建成、器官组织的机械强度及果实成熟软化等[7]。最新研究结果发现，COBRA家族的某些基因与花粉管的伸长方向也有一定关系[8]。而COBRA的突变体则缺失相关功能，如拟南芥COB-5的突变体与COB-5野生型相比细胞伸长率下降[9]；水稻的bc-1突变体使得细胞壁的纤维素减少而木质素增加，从而控制单子叶植物组织的机械强度[10]；玉米的bk2-ref的突变体造成细胞次生壁不均匀增厚，而使玉米茎杆的机械强度降低[11]。由于COBRA基因具有高度的保守性，通过比较不同物种COBRA基因核苷酸或氨基酸序列的异同，可对物种进行分类和建立各物种之间的系统发育关系。迄今为止，从许多高等植物如拟南芥[1， 8]、番茄[7]、陆地棉[12]、水稻[4]、玉米[11]等克隆到了COBRA基因，但有关兰科植物的COBRA基因的功能研究尚未见报道。本研究利用文心兰试管苗分离克隆了OnCOBRA基因的cDNA全长和DNA序列，并通过qPCR法研究其在文心兰生长发育过程中的表达规律，探索OnCOBRA基因在文心兰试管苗生根过程中的分子机制，对有效提高文心兰移栽的成活率具有重要的经济意义。相关研究已报道了COBRA基因与果实成熟有密切关系，本研究将继续探讨与鲜花衰败是否有一定联系。 1 材料与方法
1.1 材料
“小樱桃”文心兰（Oncidium kutoo）由福建农林大学园艺植物生物工程研究所提供，以原球茎诱导的第一代试管苗为实验材料。
1.2 方法
1.2.1 文心兰试管苗总RNA的提取及基因组DNA的提取 参照TRIpure Reagent试剂盒说明书提取文心兰试管苗全株的总RNA，以CTAB法提取文心兰试管苗基因组DNA。
1.2.2 相关cDNA的获得 采用Fermentas公司的RevertAidTM First-Strand cDNA Synthesis Kit的试剂盒合成第一链，编号为cDNA-A，用于保守区、ORF和3′末端的扩增；参照Clontech的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒说明合成5′race cDNA，编号为cDNA-B，用于5′末端的扩增。
1.2.3 文心兰试管苗OnCOBRA相关引物设计与PCR扩增
（1）OnCOBRA相关基因保守区引物设计及PCR扩增：利用DNAMAN分析GenBank数据库中相关物种的基因，因目前兰科植物尚未克隆此基因，因此设计兼并引物，以反转录的第一条cDNA为模版进行PCR扩增。
（2）OnCOBRA相关基因3′-RACE引物设计及PCR扩增：根据已克隆得到的OnCOBRA基因的保守区的核甘酸序列，设计3′-RACE特异引物，用于扩增OnCOBRA cDNA的3′末端。以反转录的第一链cDNA为模板，以3′COB-1为上游引物，GeneRacerTM 3′Primer（3P）为下游引物，进行巢式第1轮PCR扩增；以第1轮PCR反应的产物为模板（进行适当稀释），以3′COB-2为上游引物，GeneRacerTM 3′Nested Primer（3NP）为下游引物，进行巢式第2轮PCR扩增。
（3）OnCOBRA相关基因5′-RACE引物设计及PCR扩增：根据已克隆得到的OnCOBRA基因的保守区的核甘酸序列，设计5′-RACE特异引物，用于扩OnCOBRA cDNA的5′末端。以反转录的5′cDNA为模板，以UPM为上游引物，5′COB-1为下游引物进行第1轮PCR扩增；以第1轮PCR反应的产物为模板（进行适当稀释），以UPM为上游引物，5′COB-2为下游引物进行第2轮PCR扩增。
（4）OnCOBRA相关基因ORF的验证：分别在OnCOBRA的5端和3端设计1对特异引物，以3′-RACE cDNA为模版进行PCR扩增。上述引物均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。具体设计的引物和通用引物序列及文心兰OnCOBRA基因PCR扩增反应和反应程序见表1。
（5）目的片段的回收、克隆和测序：1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增，并参照BIOMIGA公司的Gel/PCR Extraction Kit试剂盒方法回收特异目的产物。4 μL的目的片段与1 μL的PeasyTM-T5进行连接后转化至DH5α感受态细胞，挑单克隆进行菌液培养，PCR鉴定后送华大公司测序。
1.2.4 文心兰OnCOBRA的生物信息学分析 采用NCBI（National Center for Biotechnology Information）和DNAMAN 6.0软件对OnCOBRA基因及其编码氨基酸序列进行同源比对分析，并通过以下在线工具对OnCOBRA蛋白质进行其他生物信息预测。主要软件有：ExPASy Protparam（蛋白质基本理化性质）、SignalP 4.0 Server（蛋白质信号肽）、PSORT（亚细胞定位）、EMBnet Tmpred（蛋白质跨膜）、NetPhos 2.0（蛋白磷酸化位点）、InterProScan（蛋白质保守结构域）、MEGA5.02（氨基酸序列的分子系统进化树构建）。
1.2.5 OnCOBRA基因荧光定量表达分析 本研究以18S rRNA为内参基因，利用SYBR Green Ⅱ荧光染料发的实时荧光定量PCR检测OnCOBRA基因在不同阶段材料的相对表达量。利用TRIpure Reagent试剂盒提取文心兰4个阶段的总RNA，再将RNA反转录合成cDNA-C，进一步进行qPCR分析。内参基因的上下游引物分别为18S rRNA-F和18S rRNA-R[13]，OnCOBRA基因荧光定量PCR的上下游引物分别为QCOB-F和QCOB-R。PCR扩增反应体系为20 μL，其中2×SYBR 10 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各0.8 μL，ddH2O 7.4 μL，反应于罗氏LightCycler 480仪器中进行。反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，61 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，40个循环；50 ℃冷却30 s。反应结束后进行扩增曲线和溶解曲线等分析，检测引物的特异性，各不同发育阶段的cDNA模板混合样以不同梯度稀释（5×、25×、125×、625×），制作标准曲线，获得扩增效率等相关参数，以上qPCR反应均重复3次。
2 结果与分析
2.1 文心兰OnCOBRA基因全长序列的克隆
以文心兰试管苗的cDNA第一链为模板，利用设计的保守区引物进行PCR反应扩增，结果获得了397 bp的目的条带，与预期结果相符。在NCBI数据库上比对，结果发现为目的条带，利用OnCOBRA保守区分别设计3′端和5′端引物，分别经过2轮巢式PCR反应，且测序结果表明，3′端第2轮得到1 169 bp的目的条带，5′端第2轮得到604 bp的目的条带，利用DNAMAN将上述3个基因片段进行拼接，得到文心兰基因的全长为1 601 bp，并设计OnCOBRA基因的ORF验证引物，经PCR反应得到一条长度为1 449 bp的序列。经过DNAMAN分析，结果发现OnCOBRA基因的ORF长度为1 386 bp，5′UTR长度为55 bp，3′UTR的长度为139 bp，终止密码子为TAG，ploy（A）尾巴为21 bp，无典型的polyA加尾信号（图1）。 将此转录本的核苷酸序列在NCBI的GenBank数据库中进行在线Blast，文心兰OnCOBRA基因与葡萄（Vitis vinifer）、玉米（Zea mays）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）的相似性分别为77%、75%、74%，结果说明所得片段为文心兰的OnCOBRA基因（GenBank检索号为：KF739400.1）。
利用OnCOBRA基因的ORF引物，以文心兰的基因组DNA为模版进行PCR反应，得到1条2 949 bp左右的条带，经测序，并利用DNAMAN分析，发现OnCOBRA基因组DNA含有6个外显子和5个内含子，6个外显子的长度分别为114、81、457、160、281、293 bp（图2），GenBank检索号为：KF861576。
2.2 文心兰OnCOBRA基因编码蛋白质基本理化性质及结构特征分析
文心兰OnCOBRA基因编码了461个氨基酸，采用ExPASy Protparam工具对文心兰OnCOBRA 蛋白的序列进行理化性质分析，结果表明，OnCOBRA 蛋白的分子量为51.688 4 ku，理论等电点为8.63，原子组成为C2339H3543N607O656S32，总原子量为7 177，不稳定系数是33.11，脂肪系数为75.68，总平均亲水性为-0.075。说明该蛋白属疏水的、稳定的碱性蛋白质。
利用SignalP 4.0 Server和PSORT软件对OnCOBRA蛋白进行信号肽和亚细胞定位情况预测，结果显示，OnCOBRA 蛋白含锚定信号，不属于分泌蛋白（图3）；亚细胞定位于质膜的可能性最大，在上述分析的基础之上，使用EMBnet开发的程序Tmpred预测OnCOBRA的跨膜区，结果显示，该蛋白含有2个跨膜螺旋，一个是由内到外的跨膜结构，位于第16～35个残基之间，长度为20个氨基酸，分值为1 830；另一个是由外到内的跨膜结构，位于443～461个残基之间，长度为19个氨基酸，分值为2 266；推测文心兰OnCOBRA蛋白主要存在于质膜上，可能与蛋白质的锚定有关。
2.3 文心兰OnCOBRA蛋白保守结构域预测与分析
采用InterProScan对小樱桃文心兰的OnCOBRA蛋白进行蛋白质保守结构域分析，结果发现小樱桃文心兰COBRA蛋白含有2个保守结构域：1个登录号为IPR006918的COBRA，plant保守结构域，一个InterPro未登录的（unintegrated）保守结构域（图4）。
2.4 文心兰OnCOBRA氨基酸序列翻译后的磷酸化修饰预测
蛋白质磷酸化修饰是一种蛋白翻译后供价修饰方式，蛋白质的磷酸化和去磷酸化在基因转录、植物的发育和代谢调控中起着重要作用，可调控转录因子的转录激活或改变蛋白质的功能及其结合DNA的能力[14-15]。采用NetPhos 2.0软件结合PredictProtein工具对磷酸化和其他功能位点修饰进行预测，NetPhoS 2.0预测显示文心兰OnCOBRA基因编码蛋白存在23个潜在的磷酸化位点，它们匀分布于整条多肽链中（图5）。发生磷酸化位点数最多的是丝氨酸（Ser），其次为苏氨酸（Thr），最少的为酪氨酸（Tyr），它们的活性位点数分别为9、10和4个。上述分析结果表明，OnCOBRA蛋白存在丰富的磷酸化位点，说明磷酸化位点修饰对OnCOBRA蛋白的功能可能是必须的，也可能这些磷酸化参与OnCOBRA蛋白活性的调控。
2.5 文心兰OnCOBRA基因编码的蛋白质进化分析
采用MEGA 5.02软件对文心兰OnCOBRA及其他同源性序列进行系统进化树分析，不同植物COBRA系统进化树分析结果见图6。结果表明，文心兰OnCOBRA与单子叶植物玉米、籼稻的COBRA亲缘关系相对较近，与无油樟亲缘关系最近，与其他双子叶植物和低等植物亲缘关系较远。 2.6 文心兰OnCOBRA结构分析
通过DNAMAN 6.0及相关在线软件分析，结果表明文心兰OnCOBRA符合了植物COBRA-like蛋白的一些特征：（1）N-末端有一段疏水区域，它主要起信号肽的作用；（2）靠近N-末端有一个纤维素结合位点；（3）蛋白质中间部位均有一个CCVS区域；（4）在C末端含有GPI连接区，包括w位点（图7）。
2.7 文心兰OnCOBRA基因荧光定量的表达分析
qPCR结果经扩增曲线和溶解曲线分析，结果表明18SrRNA引物和OnCOBRA引物特异性好，标准曲线的线性范围较广，在检测的线性范围内，标准曲线符合试验要求。依次采用荧光定量PCR检测OnCOBRA基因在文心兰各生长阶段下的转录水平，以18S rRNA为内参基因，OnCOBRA基因的相对表达量见图8。以文心兰原球茎阶段的表达量为对照，发现文心兰在成苗期表达量更高，可能是因为OnCOBRA作为一种胞外GPI锚定蛋白，影响植物细胞壁中纤维素含量及细胞的定向伸长，成苗期文心兰处于生根阶段，所以OnCOBRA基因的表达量最高。
3 讨论与结论
3.1 文心兰OnCOBRA基因功能的预测
GPI锚定蛋白是一类通过其羧基末端的GPI结构锚定于真核细胞膜表面的蛋白[16]，COBRA-like则是GPI锚定蛋白的一种，经目前已发表的文献表明COBRA是一个超基因家族，拟南芥已获得12个COBRA基因，且对拟南芥AtCOBRA蛋白研究结果发现，拟南芥AtCOBRA蛋白具有以下几个结构特征：（1）N-末端有一段疏水区域，它主要起信号肽的作用，主要功能是将蛋白质定位于内质网上进行加工。（2）靠近N-末端有一个纤维素结合位点，芳香族氨基酸残含量较高。cob-3突变体就是因为一个Trp（W55）残基的突变造成了拟南芥根细胞的膨胀方向缺陷[3]。（3）蛋白质中间部位均有一个CCVS区域，其中有一个CCVS序列，富含Cys，参与二硫键的形成，使蛋白形成正确的二级结构，有植物螯合肽的功能，能螯台金属离子，对于蛋白发挥正常的功能有重要作用。CCVS区还含有一个保守的N-糖基化位点，N-糖基化通常是与GPl锚定蛋白合胞外蛋白的转录后修饰有关。（4）在C末端含有GPI连接区，包括w位点，w+2位点后紧接的一个由5～6个氨基酸组成的富含带电氨基酸或脯氨酸的间隔区，最后有一个疏水性的尾巴。当蛋白在内质网上加工时C-末端的疏水肽段被切除，产生w位点，组装好的GPI通过肽键连接到w位点上，在GPI的介导下，蛋白被锚定到细胞质膜的外层[17]。经过相关生物学信息学软件在线分析，结果发现研究克隆到的文心兰OnCOBRA基因和其他植物的COBRA是同源基因，表明文心兰OnCOBRA符合上述GPI 锚定蛋白的全部特征。 3.2 文心兰OnCOBRA基因在不同发育阶段的表达分析
COBRA基因参与细胞壁的形态建成及纤维素的定向伸长[10]，纤维素微纤丝相互交织而成的多糖网状结构是细胞壁的主体结构[18]，对植物器官的形态发生起重要作用，与植物的寿命、体积、高度、细胞壁的机械强度有关[17]，植物很多基因的表达受到激素和物理、化学等因子的影响，表达量因不同组织、时空和环境而不同。在本研究中，利用荧光定量PCR检测OnCOBRA基因的相对表达量，分析文心兰4个阶段的表达量，结果发现原球茎时期表达量最低，在成苗期表达量最高，可能是因为原球茎的机械强度较弱，细胞壁的纤维素含量较低，所以OnCOBRA表达量较低。在本实验中，发现兰科植物原球茎比较松散，且容易分离和切割，符合实验结果。而在成苗期OnCOBRA表达量最高，COBRA最初也是在分析拟南芥根发育过程中细胞异常膨胀的突变体中发现的[12]，而且COBRA对植物根的定向伸长起关键作用[1]，此时的文心兰属于生根阶段或根的继续伸长，因此OnCOBRA的表达量在成苗期最高是合理的。
参考文献
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责任编辑：黄东杰
关键词 文心兰；COBRA；克隆；生物信息学；qPCR
中图分类号 S682.31 文献标识码 A
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of OnCOBRA Gene in Oncidium
LI Ling， LAI Zhongxiong*， CHEN Yukun， LIAN Conglong， LIN Heyan
Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002 China
Abstract The RT-PCR combined with RACE method was used to clone the complete cDNA sequences and DNA sequences of OnCOBRA from Oncidium vitro plant. The complete cDNA sequence of OnCOBRA was 1 601 bp， encoding 461 amino acids， the DNA sequence of OnCOBRA was 2 949 bp which had 6 exons and 5 introns. The sequences of nucleotides of OnCOBRA and amino acids of OnCOBRA was high homologous with those of the known COBRA genes in other species. OnCOBRA located in plasma membrane， which had a signal peptide， transmembrane structure and CCVS protein domain. Phylogenetic tree of COBRA in plants indicated that OnCOBRA， ZmCOBRA， AtCOBRA， and OsCOBRA belonged to the same branch， and It putatively belonged to COBRA family. qPCR results indicated that OnCOBRA was constitutive expression and showed approximately a inverted“V”curve， it expressed at the highest levels in the seedings and the lowest levels in the PLB.
Key words Oncidium；COBRA；Clone；Bioinformatics；qPCR
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.018
文心兰属兰科文心兰属植物，植株轻巧、花茎轻盈下垂、花朵奇异可爱且色彩鲜艳，故又名跳舞兰、金碟兰、舞女兰等，是世界上重要的盆花和切花种类之一。
COBR基因首先是在分析拟南芥的根发育过程中发现，存在于细胞异常膨胀的突变体中[1]。COBRA基因编码一种糖磷脂酰肌醇（Glycosyl-phosphatidyl inositol-anchored protein，GPI）锚定蛋白，控制细胞壁纤维素微纤丝的正确定位和细胞的定向伸长[1-3]，同时伴随着纤维素含量的减少和纤维素不同方向的排列[4]。糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白由蛋白质、脂质和糖链三者共价结合的复杂的糖复合物，是一类细胞表面蛋白[5]。在动物细胞中这种脂质链接用来定位极性蛋白，且研究较为广[6]。在植物细胞中，最近十几年才开始研究，它作用于植物细胞膜外表面，通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）连接，能感知细胞壁相关信息并传导到细胞膜上。植物的生长发育与细胞壁有着密切的关系，如植物的形态建成、器官组织的机械强度及果实成熟软化等[7]。最新研究结果发现，COBRA家族的某些基因与花粉管的伸长方向也有一定关系[8]。而COBRA的突变体则缺失相关功能，如拟南芥COB-5的突变体与COB-5野生型相比细胞伸长率下降[9]；水稻的bc-1突变体使得细胞壁的纤维素减少而木质素增加，从而控制单子叶植物组织的机械强度[10]；玉米的bk2-ref的突变体造成细胞次生壁不均匀增厚，而使玉米茎杆的机械强度降低[11]。由于COBRA基因具有高度的保守性，通过比较不同物种COBRA基因核苷酸或氨基酸序列的异同，可对物种进行分类和建立各物种之间的系统发育关系。迄今为止，从许多高等植物如拟南芥[1， 8]、番茄[7]、陆地棉[12]、水稻[4]、玉米[11]等克隆到了COBRA基因，但有关兰科植物的COBRA基因的功能研究尚未见报道。本研究利用文心兰试管苗分离克隆了OnCOBRA基因的cDNA全长和DNA序列，并通过qPCR法研究其在文心兰生长发育过程中的表达规律，探索OnCOBRA基因在文心兰试管苗生根过程中的分子机制，对有效提高文心兰移栽的成活率具有重要的经济意义。相关研究已报道了COBRA基因与果实成熟有密切关系，本研究将继续探讨与鲜花衰败是否有一定联系。 1 材料与方法
1.1 材料
“小樱桃”文心兰（Oncidium kutoo）由福建农林大学园艺植物生物工程研究所提供，以原球茎诱导的第一代试管苗为实验材料。
1.2 方法
1.2.1 文心兰试管苗总RNA的提取及基因组DNA的提取 参照TRIpure Reagent试剂盒说明书提取文心兰试管苗全株的总RNA，以CTAB法提取文心兰试管苗基因组DNA。
1.2.2 相关cDNA的获得 采用Fermentas公司的RevertAidTM First-Strand cDNA Synthesis Kit的试剂盒合成第一链，编号为cDNA-A，用于保守区、ORF和3′末端的扩增；参照Clontech的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒说明合成5′race cDNA，编号为cDNA-B，用于5′末端的扩增。
1.2.3 文心兰试管苗OnCOBRA相关引物设计与PCR扩增
（1）OnCOBRA相关基因保守区引物设计及PCR扩增：利用DNAMAN分析GenBank数据库中相关物种的基因，因目前兰科植物尚未克隆此基因，因此设计兼并引物，以反转录的第一条cDNA为模版进行PCR扩增。
（2）OnCOBRA相关基因3′-RACE引物设计及PCR扩增：根据已克隆得到的OnCOBRA基因的保守区的核甘酸序列，设计3′-RACE特异引物，用于扩增OnCOBRA cDNA的3′末端。以反转录的第一链cDNA为模板，以3′COB-1为上游引物，GeneRacerTM 3′Primer（3P）为下游引物，进行巢式第1轮PCR扩增；以第1轮PCR反应的产物为模板（进行适当稀释），以3′COB-2为上游引物，GeneRacerTM 3′Nested Primer（3NP）为下游引物，进行巢式第2轮PCR扩增。
（3）OnCOBRA相关基因5′-RACE引物设计及PCR扩增：根据已克隆得到的OnCOBRA基因的保守区的核甘酸序列，设计5′-RACE特异引物，用于扩OnCOBRA cDNA的5′末端。以反转录的5′cDNA为模板，以UPM为上游引物，5′COB-1为下游引物进行第1轮PCR扩增；以第1轮PCR反应的产物为模板（进行适当稀释），以UPM为上游引物，5′COB-2为下游引物进行第2轮PCR扩增。
（4）OnCOBRA相关基因ORF的验证：分别在OnCOBRA的5端和3端设计1对特异引物，以3′-RACE cDNA为模版进行PCR扩增。上述引物均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。具体设计的引物和通用引物序列及文心兰OnCOBRA基因PCR扩增反应和反应程序见表1。
（5）目的片段的回收、克隆和测序：1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增，并参照BIOMIGA公司的Gel/PCR Extraction Kit试剂盒方法回收特异目的产物。4 μL的目的片段与1 μL的PeasyTM-T5进行连接后转化至DH5α感受态细胞，挑单克隆进行菌液培养，PCR鉴定后送华大公司测序。
1.2.4 文心兰OnCOBRA的生物信息学分析 采用NCBI（National Center for Biotechnology Information）和DNAMAN 6.0软件对OnCOBRA基因及其编码氨基酸序列进行同源比对分析，并通过以下在线工具对OnCOBRA蛋白质进行其他生物信息预测。主要软件有：ExPASy Protparam（蛋白质基本理化性质）、SignalP 4.0 Server（蛋白质信号肽）、PSORT（亚细胞定位）、EMBnet Tmpred（蛋白质跨膜）、NetPhos 2.0（蛋白磷酸化位点）、InterProScan（蛋白质保守结构域）、MEGA5.02（氨基酸序列的分子系统进化树构建）。
1.2.5 OnCOBRA基因荧光定量表达分析 本研究以18S rRNA为内参基因，利用SYBR Green Ⅱ荧光染料发的实时荧光定量PCR检测OnCOBRA基因在不同阶段材料的相对表达量。利用TRIpure Reagent试剂盒提取文心兰4个阶段的总RNA，再将RNA反转录合成cDNA-C，进一步进行qPCR分析。内参基因的上下游引物分别为18S rRNA-F和18S rRNA-R[13]，OnCOBRA基因荧光定量PCR的上下游引物分别为QCOB-F和QCOB-R。PCR扩增反应体系为20 μL，其中2×SYBR 10 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各0.8 μL，ddH2O 7.4 μL，反应于罗氏LightCycler 480仪器中进行。反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，61 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，40个循环；50 ℃冷却30 s。反应结束后进行扩增曲线和溶解曲线等分析，检测引物的特异性，各不同发育阶段的cDNA模板混合样以不同梯度稀释（5×、25×、125×、625×），制作标准曲线，获得扩增效率等相关参数，以上qPCR反应均重复3次。
2 结果与分析
2.1 文心兰OnCOBRA基因全长序列的克隆
以文心兰试管苗的cDNA第一链为模板，利用设计的保守区引物进行PCR反应扩增，结果获得了397 bp的目的条带，与预期结果相符。在NCBI数据库上比对，结果发现为目的条带，利用OnCOBRA保守区分别设计3′端和5′端引物，分别经过2轮巢式PCR反应，且测序结果表明，3′端第2轮得到1 169 bp的目的条带，5′端第2轮得到604 bp的目的条带，利用DNAMAN将上述3个基因片段进行拼接，得到文心兰基因的全长为1 601 bp，并设计OnCOBRA基因的ORF验证引物，经PCR反应得到一条长度为1 449 bp的序列。经过DNAMAN分析，结果发现OnCOBRA基因的ORF长度为1 386 bp，5′UTR长度为55 bp，3′UTR的长度为139 bp，终止密码子为TAG，ploy（A）尾巴为21 bp，无典型的polyA加尾信号（图1）。 将此转录本的核苷酸序列在NCBI的GenBank数据库中进行在线Blast，文心兰OnCOBRA基因与葡萄（Vitis vinifer）、玉米（Zea mays）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）的相似性分别为77%、75%、74%，结果说明所得片段为文心兰的OnCOBRA基因（GenBank检索号为：KF739400.1）。
利用OnCOBRA基因的ORF引物，以文心兰的基因组DNA为模版进行PCR反应，得到1条2 949 bp左右的条带，经测序，并利用DNAMAN分析，发现OnCOBRA基因组DNA含有6个外显子和5个内含子，6个外显子的长度分别为114、81、457、160、281、293 bp（图2），GenBank检索号为：KF861576。
2.2 文心兰OnCOBRA基因编码蛋白质基本理化性质及结构特征分析
文心兰OnCOBRA基因编码了461个氨基酸，采用ExPASy Protparam工具对文心兰OnCOBRA 蛋白的序列进行理化性质分析，结果表明，OnCOBRA 蛋白的分子量为51.688 4 ku，理论等电点为8.63，原子组成为C2339H3543N607O656S32，总原子量为7 177，不稳定系数是33.11，脂肪系数为75.68，总平均亲水性为-0.075。说明该蛋白属疏水的、稳定的碱性蛋白质。
利用SignalP 4.0 Server和PSORT软件对OnCOBRA蛋白进行信号肽和亚细胞定位情况预测，结果显示，OnCOBRA 蛋白含锚定信号，不属于分泌蛋白（图3）；亚细胞定位于质膜的可能性最大，在上述分析的基础之上，使用EMBnet开发的程序Tmpred预测OnCOBRA的跨膜区，结果显示，该蛋白含有2个跨膜螺旋，一个是由内到外的跨膜结构，位于第16～35个残基之间，长度为20个氨基酸，分值为1 830；另一个是由外到内的跨膜结构，位于443～461个残基之间，长度为19个氨基酸，分值为2 266；推测文心兰OnCOBRA蛋白主要存在于质膜上，可能与蛋白质的锚定有关。
2.3 文心兰OnCOBRA蛋白保守结构域预测与分析
采用InterProScan对小樱桃文心兰的OnCOBRA蛋白进行蛋白质保守结构域分析，结果发现小樱桃文心兰COBRA蛋白含有2个保守结构域：1个登录号为IPR006918的COBRA，plant保守结构域，一个InterPro未登录的（unintegrated）保守结构域（图4）。
2.4 文心兰OnCOBRA氨基酸序列翻译后的磷酸化修饰预测
蛋白质磷酸化修饰是一种蛋白翻译后供价修饰方式，蛋白质的磷酸化和去磷酸化在基因转录、植物的发育和代谢调控中起着重要作用，可调控转录因子的转录激活或改变蛋白质的功能及其结合DNA的能力[14-15]。采用NetPhos 2.0软件结合PredictProtein工具对磷酸化和其他功能位点修饰进行预测，NetPhoS 2.0预测显示文心兰OnCOBRA基因编码蛋白存在23个潜在的磷酸化位点，它们匀分布于整条多肽链中（图5）。发生磷酸化位点数最多的是丝氨酸（Ser），其次为苏氨酸（Thr），最少的为酪氨酸（Tyr），它们的活性位点数分别为9、10和4个。上述分析结果表明，OnCOBRA蛋白存在丰富的磷酸化位点，说明磷酸化位点修饰对OnCOBRA蛋白的功能可能是必须的，也可能这些磷酸化参与OnCOBRA蛋白活性的调控。
2.5 文心兰OnCOBRA基因编码的蛋白质进化分析
采用MEGA 5.02软件对文心兰OnCOBRA及其他同源性序列进行系统进化树分析，不同植物COBRA系统进化树分析结果见图6。结果表明，文心兰OnCOBRA与单子叶植物玉米、籼稻的COBRA亲缘关系相对较近，与无油樟亲缘关系最近，与其他双子叶植物和低等植物亲缘关系较远。 2.6 文心兰OnCOBRA结构分析
通过DNAMAN 6.0及相关在线软件分析，结果表明文心兰OnCOBRA符合了植物COBRA-like蛋白的一些特征：（1）N-末端有一段疏水区域，它主要起信号肽的作用；（2）靠近N-末端有一个纤维素结合位点；（3）蛋白质中间部位均有一个CCVS区域；（4）在C末端含有GPI连接区，包括w位点（图7）。
2.7 文心兰OnCOBRA基因荧光定量的表达分析
qPCR结果经扩增曲线和溶解曲线分析，结果表明18SrRNA引物和OnCOBRA引物特异性好，标准曲线的线性范围较广，在检测的线性范围内，标准曲线符合试验要求。依次采用荧光定量PCR检测OnCOBRA基因在文心兰各生长阶段下的转录水平，以18S rRNA为内参基因，OnCOBRA基因的相对表达量见图8。以文心兰原球茎阶段的表达量为对照，发现文心兰在成苗期表达量更高，可能是因为OnCOBRA作为一种胞外GPI锚定蛋白，影响植物细胞壁中纤维素含量及细胞的定向伸长，成苗期文心兰处于生根阶段，所以OnCOBRA基因的表达量最高。
3 讨论与结论
3.1 文心兰OnCOBRA基因功能的预测
GPI锚定蛋白是一类通过其羧基末端的GPI结构锚定于真核细胞膜表面的蛋白[16]，COBRA-like则是GPI锚定蛋白的一种，经目前已发表的文献表明COBRA是一个超基因家族，拟南芥已获得12个COBRA基因，且对拟南芥AtCOBRA蛋白研究结果发现，拟南芥AtCOBRA蛋白具有以下几个结构特征：（1）N-末端有一段疏水区域，它主要起信号肽的作用，主要功能是将蛋白质定位于内质网上进行加工。（2）靠近N-末端有一个纤维素结合位点，芳香族氨基酸残含量较高。cob-3突变体就是因为一个Trp（W55）残基的突变造成了拟南芥根细胞的膨胀方向缺陷[3]。（3）蛋白质中间部位均有一个CCVS区域，其中有一个CCVS序列，富含Cys，参与二硫键的形成，使蛋白形成正确的二级结构，有植物螯合肽的功能，能螯台金属离子，对于蛋白发挥正常的功能有重要作用。CCVS区还含有一个保守的N-糖基化位点，N-糖基化通常是与GPl锚定蛋白合胞外蛋白的转录后修饰有关。（4）在C末端含有GPI连接区，包括w位点，w+2位点后紧接的一个由5～6个氨基酸组成的富含带电氨基酸或脯氨酸的间隔区，最后有一个疏水性的尾巴。当蛋白在内质网上加工时C-末端的疏水肽段被切除，产生w位点，组装好的GPI通过肽键连接到w位点上，在GPI的介导下，蛋白被锚定到细胞质膜的外层[17]。经过相关生物学信息学软件在线分析，结果发现研究克隆到的文心兰OnCOBRA基因和其他植物的COBRA是同源基因，表明文心兰OnCOBRA符合上述GPI 锚定蛋白的全部特征。 3.2 文心兰OnCOBRA基因在不同发育阶段的表达分析
COBRA基因参与细胞壁的形态建成及纤维素的定向伸长[10]，纤维素微纤丝相互交织而成的多糖网状结构是细胞壁的主体结构[18]，对植物器官的形态发生起重要作用，与植物的寿命、体积、高度、细胞壁的机械强度有关[17]，植物很多基因的表达受到激素和物理、化学等因子的影响，表达量因不同组织、时空和环境而不同。在本研究中，利用荧光定量PCR检测OnCOBRA基因的相对表达量，分析文心兰4个阶段的表达量，结果发现原球茎时期表达量最低，在成苗期表达量最高，可能是因为原球茎的机械强度较弱，细胞壁的纤维素含量较低，所以OnCOBRA表达量较低。在本实验中，发现兰科植物原球茎比较松散，且容易分离和切割，符合实验结果。而在成苗期OnCOBRA表达量最高，COBRA最初也是在分析拟南芥根发育过程中细胞异常膨胀的突变体中发现的[12]，而且COBRA对植物根的定向伸长起关键作用[1]，此时的文心兰属于生根阶段或根的继续伸长，因此OnCOBRA的表达量在成苗期最高是合理的。
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责任编辑：黄东杰