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摘要
为监测2016-2017年种植的果蔗脱毒种苗脱毒效果，分别采集广州市南沙区和增城区、湛江市麻章区及华南农业大学甘蔗育种基地共83份果蔗脱毒种苗样本，进行甘蔗花叶病毒（SCMV）、高粱花叶病毒（SrMV）和甘蔗黄叶病毒（SCYLV）RTPCR检测。结果表明SCMV的阳性样本数为3个，阳性检出率3.61%；SrMV的阳性样本数为0；SCYLV的阳性样本数为78个，阳性检出率93.98%。采用常规PCR和巢式PCR技术对采集于广州市增城区和华南农业大学甘蔗育种基地的30份果蔗脱毒种苗样本进行宿根矮化病菌（Lxx）检测，常规PCR检测阳性样本数为0，巢式PCR检测疑似阳性样本数为8，疑似阳性检出率26.67%。本研究采用茎尖组织培养脱毒技术培育的果蔗脱毒种苗能有效脱除果蔗种苗内的SCMV、SrMV和Lxx，但SCYLV的脱除效果有待进一步研究。
关键词
果蔗脱毒种苗； 甘蔗花叶病； 甘蔗黄叶病； 甘蔗宿根矮化病； 分子检测
中图分类号：
S 435.661
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2017321
Molecular detection of sugarcane mosaic disease， sugarcane yellow leaf
disease and ratoon stunting disease in virusfree seedlings of fruit cane
WANG Kaili， DENG Quanqing， DOU Zhimin， GU Xiaohan， WANG Mingqiang， SHEN Wankuan
（College of Agriculture， South China Agricultural University， Scientific Observing and Experimental
Station of Crop Cultivation in South China， Ministry of Agriculture， Guangzhou 510642， China）
Abstract
To survey the virus elimination effect of virusfree fruit cane seedlings， we collected 83 samples of virusfree seedling from Nansha District and Zengcheng District of Guangzhou， Mazhang District of Zhanjiang and sugarcane breeding base of South China Agricultural University （SCAU） to detect Sugarcane mosaic virus （SCMV）， Sorghum mosaic virus （SrMV） and Sugarcane yellow leaf virus （SCYLV） by RTPCR in 2016-2017. The results showed that three positive samples of SCMV was found， with the positive detection rate of 3.61%. The positive sample of SrMV was not found. The number of positive samples of SCYLV was 78， and its positive detection rate was 93.98%. We also collected 30 samples of virusfree seedling from Zengcheng District of Guangzhou and sugarcane breeding base of SCAU to detect the pathogen （Lxx） caused ratoon stunting disease （RSD） based on nested PCR or conventional PCR. The results showed that conventional PCR failed to detect the positive samples， but nested PCR found 8 suspected positive samples， with the suspected positive detection rate of 26.67%. In this study， the virusfree seedlings developed by techniques of shoot apical meristem culture can effectively remove SCMV， SrMV and Lxx in the fruit cane seedlings， but the removal effect of SCYLV needs further study.
Key words
virusfree seedling of fruit cane； sugarcane mosaic disease； sugarcane yellow leaf disease； ratoon stunting disease； molecular detection
果蔗是我國南方优势特色经济作物，广东是我国主要果蔗产区，生产基地主要分布在广州、湛江、江门、清远、韶关等地区。2012年广东省果蔗种植面积达1.99万hm2，总产量189.91万t，占全省当年甘蔗（含糖蔗）总种植面积的12.03%和总蔗茎产量的12.93%[1]。果蔗生产投入高于糖蔗，但平均单产也明显高于糖蔗，蔗茎产量可达到120～150 t/hm2，经济效益较好[2]。我国种植的果蔗品种主要以黑皮果蔗‘Badila’为主，蔗汁味道清甜可口，具有丰富的营养价值和药用价值，深受广大消费者喜爱。但由于果蔗品种单一，多年无性繁殖，易受甘蔗花叶病sugarcane mosaic disease （SMD）、甘蔗黄叶病sugarcane yellow leaf disease （SYLD）和宿根矮化病ratoon stunting disease （RSD）等种苗传播病害的危害[35]，造成植株变矮，品质变差，产量降低等严重问题。甘蔗花叶病主要由甘蔗花叶病毒Sugarcane mosaic virus （SCMV）和高粱花叶病毒Sorghum mosaic virus （SrMV）引起[6]。甘蔗黄叶病病原为甘蔗黄叶病毒Sugarcane yellow leaf virus （SCYLV）[7]。甘蔗宿根矮化病由木质部限制性病原菌Leifsonia xyli subsp. xyli（Lxx）引起，是甘蔗主要的细菌病害之一[8]。 近年来，甘蔗花叶病在广西、云南等果蔗产区普遍发生，其中主栽品种‘黑皮果蔗’发病率高达100%，产量下降12.3%～33.5%，糖分下降6%～14%[911]。甘蔗黄叶病于2003年首次在广西南宁的果蔗上发现[12]，之后李海明等[13]、周国辉等[14] 调查发现福建、广西、广东和海南等果蔗主产区普遍存在果蔗被SCYLV侵染的情况。本实验室于2016年对采集于广东蔗区的106份果蔗样本进行了SCMV、SrMV和SCYLV检测， 发现SCMV、SrMV和SCYLV的阳性检出率分别为98.1%、97.2%和95.3%。在我国果蔗生产区，甘蔗宿根矮化病的發生也十分严重。吴夏明等[15]对6个果蔗品种进行了Lxx检测，结果表明，‘广东黄皮’感染率为75%，‘云南红皮’、‘黔蔗08688’、‘黔糖3号’和‘Badila’检出率均为100%。杨湛端等[16]对广州番禺120个果蔗样本进行了调查，表明‘黑皮果蔗’的Lxx检出率为93%，‘广东黄皮’的Lxx检出率为95%。
脱毒种苗是防治上述种传病害的主要措施，李松等[17]报道甘蔗茎尖脱毒苗，甘蔗花叶病病原去除率为75%，甘蔗宿根矮化病菌去除率为70%。1991年我国台湾糖业研究所开始利用组织培养脱毒技术进行果蔗脱毒种苗的研究，但主要集中在脱毒种苗的培养及田间生长试验[18]，而对田间种植的果蔗脱毒种苗目的病害的跟踪检测却鲜有报道，因此，难以评估脱毒种苗对各种目标病害的脱除效果。近年来，本课题组利用茎尖组织培养技术（经检测原果蔗植株带有甘蔗花叶病、甘蔗黄叶病、宿根矮化病）培育了一批果蔗脱毒种苗，并在广东蔗区建立苗圃扩繁。为了监测这批果蔗脱毒种苗的脱毒效果，我们跟踪取样并对主要目标病害（花叶病、黄叶病、宿根矮化病）进行分子检测，为客观评价该批果蔗脱毒种苗的脱毒效果及脱毒技术提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 样品采集
2017年3月-6月分别在广东湛江假植苗圃、增城一级苗圃、南沙二级苗圃和广州华南农业大学甘蔗育种基地一级苗圃随机采集果蔗脱毒种苗新叶下第一片叶，共83份样本，放于-80℃储存，用于甘蔗花叶病和黄叶病检测。
2017年5月在广东增城一级苗圃和广州华南农业大学甘蔗育种基地一级苗圃随机选取10个月株龄果蔗脱毒种苗主茎30份样本，参照沈万宽等[19]的方法提取样品蔗汁放于-80℃储存，用于甘蔗宿根矮化病检测。
1.2 总RNA和DNA的提取
参照Xie等[20]的方法，用改进的CTAB法提取蔗叶总RNA。参照沈万宽等[19]的方法，用CTAB法提取蔗汁总DNA。
1.3 甘蔗花叶病和黄叶病的RTPCR检测
采用Xu等[21]和许东林等[22]报道的SCMV、SrMV和SCYLV特异性引物（表1），委托上海生工生物工程有限公司合成。以提取的蔗叶总RNA为模板，使用南京Vazyme生物有限公司的HiScript Ⅱ One Step RTPCR Kit进行RTPCR扩增。扩增体系为25.0 μL：2×One Step Mix 12.5 μL，上下游引物（5 μmol/L）各1.0 μL，Enzyme Mix 1.0 μL，模板1.5 μL，加RNasefree ultra pure H2O至25.0 μL。扩增程序为：50℃反转录30 min；94℃预变性2 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸5 min。反应程序结束后，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在Tanon1600凝胶成像系统中观察结果并拍照保存。
1.4 甘蔗宿根矮化病菌的PCR检测
1.4.1 常规PCR检测
采用Pan等[23]报道的甘蔗宿根矮化病菌特异性引物Lxx1：5′CCGAAGTGAGCAGATTGACC3′和Lxx2：5′ACCCTGTGTTGTTTTCAACG3′进行PCR扩增。引物委托上海生工生物工程有限公司合成。预期扩增产物长度为438 bp。以蔗汁总DNA为模板进行PCR扩增，反应体系20.0 μL：模板1.0 μL，10×Buffer（含Mg2 ）2.0 μL，dNTPs （2.5 mmol/L）1.6 μL，引物Lxx1/Lxx2（5 μmol/L）各1.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，用超纯H2O补足至20.0 μL。扩增程序为：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸60 s，进行35个循环；最后72℃延伸5 min。PCR反应结束后，扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，在Tanon1600凝胶成像系统中观察结果并拍照保存。
1.4.2 巢式PCR检测
参照沈万宽等[24]的方法。第一轮扩增采用细菌ITS通用引物ITS1：5′AGTCGTAACAAGGTAGCCGT3′和ITS2：5′GTGCCAAGGCATCCACC3′进行PCR扩增。引物委托上海生工生物工程有限公司合成，反应体系及扩增程序同1.4.1，其中退火温度为56℃，循环30次。以第一轮扩增产物为模版，采用宿根矮化病菌特异性引物Lxx1/Lxx2进行第二轮PCR扩增，反应体系及扩增程序均同1.4.1。反应结束后，扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，在Tanon1600凝胶成像系统中观察结果并拍照保存。
1.5 序列测定与分析
RTPCR和PCR产物核苷酸序列委托上海生工生物工程有限公司测定，一致性比较在NCBI数据库中通过BLAST程序进行，应用DNAstar V 7.1软件进行序列分析。
2 结果与分析
2.1 甘蔗花叶病和甘蔗黄叶病RTPCR检测结果
采用SCMV、SrMV和SCYLV的特异引物对83份果蔗脱毒种苗样本进行SCMV、SrMV和SCYLV的RTPCR检测。结果表明，SCMV的阳性样本数为3个，阳性检出率为3.61%，且3个阳性样本均来自广州市南沙区的二级苗圃，其他苗圃均未检出阳性样本。SCYLV的阳性样本数为78个，阳性检出率为93.98%。本批样本中未检测出SrMV阳性样本（表2，图1）。 选取的代表性阳性样本经测序及比对，采自广州市南沙区的‘黑皮果蔗’2号样本的SCMV扩增产物核苷酸序列（MF957202）与GenBank中已报道的中国广东（EF419174）、云南（FM997890）和阿根廷（EU196448）的SCMV株系或分离物相应区域核苷酸序列一致性高达97%～99%，确认该产物为SCMV核苷酸片段。广州市南沙区的‘黑皮果蔗’1号样本扩增出的SCYLV核苷酸序列（MF957203）与GenBank中已报道的来自印度（KF680098）、哥伦比亚（AF369928）的SCYLV分离物相应区域核苷酸序列有99%的一致性，由此证实该产物为SCYLV核苷酸片段。
2.2 甘蔗宿根矮化病PCR检测结果
采用引物Lxx1/Lxx2对30份果蔗脱毒种苗样本进行常规PCR检测，产物电泳未检测到目的条带。采用引物ITS1/ITS2和Lxx1/Lxx2对30份果蔗脱毒种苗进行巢式PCR检测，除了阳性对照外，有8个样本出现与预期目的片段大小一致的条带（条带极弱，约438 bp），且空白对照（无菌水）未出现条带（图2）。由于目的条带极弱，测序未成功，故将检测出的8个样本定为疑似宿根矮化病阳性样本，RSD疑似样本阳性检出率为26.67% （表3）。
3 讨论
世界上已报道的甘蔗花叶病病原有SCMV、SrMV、SCSMV（甘蔗线条花叶病毒）、MDMV（玉米矮花叶病毒）、JGMV（约翰逊草花叶病毒）和ZeMV（玉米花叶病毒）[25]，但引起我国蔗区甘蔗花叶病的病原主要为SCMV、SrMV和SCSMV，且引起糖蔗和果蔗的花叶病优势病原有所差异，糖蔗上花叶病的优势病毒为SrMV和SCSMV[6， 2628]，而果蔗上花叶病的优势病毒为SCMV[2930]，即糖蔗和果蔗进行花叶病病原脱除时目的病原不同。本研究对83份果蔗脱毒种苗进行SCMV、SrMV检测，SCMV阳性检出率为3.61%（3/83），SrMV未检出阳性样品，且3个SCMV阳性样本均采自广州市南沙区的二级苗圃，其他采样点均未检测出阳性样品。这3个阳性样本所携带的SCMV极有可能是外源病毒通过蔗刀或蚜虫传播至脱毒种苗，种苗自身携带SCMV的可能性较小。由此说明本批采用茎尖组织培养脱毒技术培育的果蔗脱毒种苗对果蔗种苗内的SCMV、SrMV的脱除是有效的。
本研究中，SCYLV阳性样本检出率高达93.98%（78/83），且假植苗圃、一级苗圃、二级苗圃阳性检出率均较高。相关研究表明，植物病毒基因能够整合入寄主植物基因组中，如Bennetzen[31]指出反转录功能蛋白可以把RNA反转录为DNA，从而使PRVs（植物拟逆转录病毒）整合入寄主植物基因组中。且当PRVs基因片段侵入含有反式激活蛋白转基因的植物，此病毒可以利用基因产物来完成侵染循环[32]。由于SCYLV与甘蔗杆状病毒Sugarcane bacilliform virus （SCBV）的寄主均为甘蔗，因此怀疑SCYLV是否同SCBV一样，能将SCYLV全部或部分基因组整合入甘蔗基因组内，和甘蔗基因组同步进行复制表达，并且利用这种方式进行侵染。如果推断成立，则SCYLV是无法应用植物组织培养技术脱除的。另外，Mishra等[33]研究表明，当以1.5 mm以下甘蔗茎尖分生组织作为外植体进行组织培养时，能有效脱除SCYLV，而当以超过1.5 mm茎尖分生组织作外植体时，所获得的甘蔗组培苗不能有效脱除SCYLV。本研究也有可能在进行甘蔗组织培养时，所取外植体茎尖分生組织过大，造成不能有效脱除SCYLV。建议今后进行果蔗组培脱毒时，所取外植体不超过1.5 mm。
甘蔗宿根矮化病菌Lxx寄生于甘蔗木质部维管束中，成熟蔗茎的木质部维管束发达，Lxx含量较高，而幼嫩的茎尖分生组织木质部尚未分化形成或极不发达，因此，Lxx不存在或含量极低[34]。选取较小的甘蔗茎尖分生组织作为外植体较易脱除甘蔗宿根矮化病菌（Lxx）。本研究采用常规PCP方法未检测出Lxx阳性样本，而应用较常规PCR检测灵敏度大幅度提高的巢式PCR技术[3536]，也仅检测出8个样本有疑似目的条带（测序未成功），假如这8个均为Lxx阳性样品，其携带的Lxx的含量也是极低的。可见本批采用茎尖组织培养脱毒技术培育的果蔗脱毒苗对种苗内的Lxx的脱除是有效的。
参考文献
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为监测2016-2017年种植的果蔗脱毒种苗脱毒效果，分别采集广州市南沙区和增城区、湛江市麻章区及华南农业大学甘蔗育种基地共83份果蔗脱毒种苗样本，进行甘蔗花叶病毒（SCMV）、高粱花叶病毒（SrMV）和甘蔗黄叶病毒（SCYLV）RTPCR检测。结果表明SCMV的阳性样本数为3个，阳性检出率3.61%；SrMV的阳性样本数为0；SCYLV的阳性样本数为78个，阳性检出率93.98%。采用常规PCR和巢式PCR技术对采集于广州市增城区和华南农业大学甘蔗育种基地的30份果蔗脱毒种苗样本进行宿根矮化病菌（Lxx）检测，常规PCR检测阳性样本数为0，巢式PCR检测疑似阳性样本数为8，疑似阳性检出率26.67%。本研究采用茎尖组织培养脱毒技术培育的果蔗脱毒种苗能有效脱除果蔗种苗内的SCMV、SrMV和Lxx，但SCYLV的脱除效果有待进一步研究。
关键词
果蔗脱毒种苗； 甘蔗花叶病； 甘蔗黄叶病； 甘蔗宿根矮化病； 分子检测
中图分类号：
S 435.661
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2017321
Molecular detection of sugarcane mosaic disease， sugarcane yellow leaf
disease and ratoon stunting disease in virusfree seedlings of fruit cane
WANG Kaili， DENG Quanqing， DOU Zhimin， GU Xiaohan， WANG Mingqiang， SHEN Wankuan
（College of Agriculture， South China Agricultural University， Scientific Observing and Experimental
Station of Crop Cultivation in South China， Ministry of Agriculture， Guangzhou 510642， China）
Abstract
To survey the virus elimination effect of virusfree fruit cane seedlings， we collected 83 samples of virusfree seedling from Nansha District and Zengcheng District of Guangzhou， Mazhang District of Zhanjiang and sugarcane breeding base of South China Agricultural University （SCAU） to detect Sugarcane mosaic virus （SCMV）， Sorghum mosaic virus （SrMV） and Sugarcane yellow leaf virus （SCYLV） by RTPCR in 2016-2017. The results showed that three positive samples of SCMV was found， with the positive detection rate of 3.61%. The positive sample of SrMV was not found. The number of positive samples of SCYLV was 78， and its positive detection rate was 93.98%. We also collected 30 samples of virusfree seedling from Zengcheng District of Guangzhou and sugarcane breeding base of SCAU to detect the pathogen （Lxx） caused ratoon stunting disease （RSD） based on nested PCR or conventional PCR. The results showed that conventional PCR failed to detect the positive samples， but nested PCR found 8 suspected positive samples， with the suspected positive detection rate of 26.67%. In this study， the virusfree seedlings developed by techniques of shoot apical meristem culture can effectively remove SCMV， SrMV and Lxx in the fruit cane seedlings， but the removal effect of SCYLV needs further study.
Key words
virusfree seedling of fruit cane； sugarcane mosaic disease； sugarcane yellow leaf disease； ratoon stunting disease； molecular detection
果蔗是我國南方优势特色经济作物，广东是我国主要果蔗产区，生产基地主要分布在广州、湛江、江门、清远、韶关等地区。2012年广东省果蔗种植面积达1.99万hm2，总产量189.91万t，占全省当年甘蔗（含糖蔗）总种植面积的12.03%和总蔗茎产量的12.93%[1]。果蔗生产投入高于糖蔗，但平均单产也明显高于糖蔗，蔗茎产量可达到120～150 t/hm2，经济效益较好[2]。我国种植的果蔗品种主要以黑皮果蔗‘Badila’为主，蔗汁味道清甜可口，具有丰富的营养价值和药用价值，深受广大消费者喜爱。但由于果蔗品种单一，多年无性繁殖，易受甘蔗花叶病sugarcane mosaic disease （SMD）、甘蔗黄叶病sugarcane yellow leaf disease （SYLD）和宿根矮化病ratoon stunting disease （RSD）等种苗传播病害的危害[35]，造成植株变矮，品质变差，产量降低等严重问题。甘蔗花叶病主要由甘蔗花叶病毒Sugarcane mosaic virus （SCMV）和高粱花叶病毒Sorghum mosaic virus （SrMV）引起[6]。甘蔗黄叶病病原为甘蔗黄叶病毒Sugarcane yellow leaf virus （SCYLV）[7]。甘蔗宿根矮化病由木质部限制性病原菌Leifsonia xyli subsp. xyli（Lxx）引起，是甘蔗主要的细菌病害之一[8]。 近年来，甘蔗花叶病在广西、云南等果蔗产区普遍发生，其中主栽品种‘黑皮果蔗’发病率高达100%，产量下降12.3%～33.5%，糖分下降6%～14%[911]。甘蔗黄叶病于2003年首次在广西南宁的果蔗上发现[12]，之后李海明等[13]、周国辉等[14] 调查发现福建、广西、广东和海南等果蔗主产区普遍存在果蔗被SCYLV侵染的情况。本实验室于2016年对采集于广东蔗区的106份果蔗样本进行了SCMV、SrMV和SCYLV检测， 发现SCMV、SrMV和SCYLV的阳性检出率分别为98.1%、97.2%和95.3%。在我国果蔗生产区，甘蔗宿根矮化病的發生也十分严重。吴夏明等[15]对6个果蔗品种进行了Lxx检测，结果表明，‘广东黄皮’感染率为75%，‘云南红皮’、‘黔蔗08688’、‘黔糖3号’和‘Badila’检出率均为100%。杨湛端等[16]对广州番禺120个果蔗样本进行了调查，表明‘黑皮果蔗’的Lxx检出率为93%，‘广东黄皮’的Lxx检出率为95%。
脱毒种苗是防治上述种传病害的主要措施，李松等[17]报道甘蔗茎尖脱毒苗，甘蔗花叶病病原去除率为75%，甘蔗宿根矮化病菌去除率为70%。1991年我国台湾糖业研究所开始利用组织培养脱毒技术进行果蔗脱毒种苗的研究，但主要集中在脱毒种苗的培养及田间生长试验[18]，而对田间种植的果蔗脱毒种苗目的病害的跟踪检测却鲜有报道，因此，难以评估脱毒种苗对各种目标病害的脱除效果。近年来，本课题组利用茎尖组织培养技术（经检测原果蔗植株带有甘蔗花叶病、甘蔗黄叶病、宿根矮化病）培育了一批果蔗脱毒种苗，并在广东蔗区建立苗圃扩繁。为了监测这批果蔗脱毒种苗的脱毒效果，我们跟踪取样并对主要目标病害（花叶病、黄叶病、宿根矮化病）进行分子检测，为客观评价该批果蔗脱毒种苗的脱毒效果及脱毒技术提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 样品采集
2017年3月-6月分别在广东湛江假植苗圃、增城一级苗圃、南沙二级苗圃和广州华南农业大学甘蔗育种基地一级苗圃随机采集果蔗脱毒种苗新叶下第一片叶，共83份样本，放于-80℃储存，用于甘蔗花叶病和黄叶病检测。
2017年5月在广东增城一级苗圃和广州华南农业大学甘蔗育种基地一级苗圃随机选取10个月株龄果蔗脱毒种苗主茎30份样本，参照沈万宽等[19]的方法提取样品蔗汁放于-80℃储存，用于甘蔗宿根矮化病检测。
1.2 总RNA和DNA的提取
参照Xie等[20]的方法，用改进的CTAB法提取蔗叶总RNA。参照沈万宽等[19]的方法，用CTAB法提取蔗汁总DNA。
1.3 甘蔗花叶病和黄叶病的RTPCR检测
采用Xu等[21]和许东林等[22]报道的SCMV、SrMV和SCYLV特异性引物（表1），委托上海生工生物工程有限公司合成。以提取的蔗叶总RNA为模板，使用南京Vazyme生物有限公司的HiScript Ⅱ One Step RTPCR Kit进行RTPCR扩增。扩增体系为25.0 μL：2×One Step Mix 12.5 μL，上下游引物（5 μmol/L）各1.0 μL，Enzyme Mix 1.0 μL，模板1.5 μL，加RNasefree ultra pure H2O至25.0 μL。扩增程序为：50℃反转录30 min；94℃预变性2 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸5 min。反应程序结束后，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在Tanon1600凝胶成像系统中观察结果并拍照保存。
1.4 甘蔗宿根矮化病菌的PCR检测
1.4.1 常规PCR检测
采用Pan等[23]报道的甘蔗宿根矮化病菌特异性引物Lxx1：5′CCGAAGTGAGCAGATTGACC3′和Lxx2：5′ACCCTGTGTTGTTTTCAACG3′进行PCR扩增。引物委托上海生工生物工程有限公司合成。预期扩增产物长度为438 bp。以蔗汁总DNA为模板进行PCR扩增，反应体系20.0 μL：模板1.0 μL，10×Buffer（含Mg2 ）2.0 μL，dNTPs （2.5 mmol/L）1.6 μL，引物Lxx1/Lxx2（5 μmol/L）各1.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，用超纯H2O补足至20.0 μL。扩增程序为：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸60 s，进行35个循环；最后72℃延伸5 min。PCR反应结束后，扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，在Tanon1600凝胶成像系统中观察结果并拍照保存。
1.4.2 巢式PCR检测
参照沈万宽等[24]的方法。第一轮扩增采用细菌ITS通用引物ITS1：5′AGTCGTAACAAGGTAGCCGT3′和ITS2：5′GTGCCAAGGCATCCACC3′进行PCR扩增。引物委托上海生工生物工程有限公司合成，反应体系及扩增程序同1.4.1，其中退火温度为56℃，循环30次。以第一轮扩增产物为模版，采用宿根矮化病菌特异性引物Lxx1/Lxx2进行第二轮PCR扩增，反应体系及扩增程序均同1.4.1。反应结束后，扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，在Tanon1600凝胶成像系统中观察结果并拍照保存。
1.5 序列测定与分析
RTPCR和PCR产物核苷酸序列委托上海生工生物工程有限公司测定，一致性比较在NCBI数据库中通过BLAST程序进行，应用DNAstar V 7.1软件进行序列分析。
2 结果与分析
2.1 甘蔗花叶病和甘蔗黄叶病RTPCR检测结果
采用SCMV、SrMV和SCYLV的特异引物对83份果蔗脱毒种苗样本进行SCMV、SrMV和SCYLV的RTPCR检测。结果表明，SCMV的阳性样本数为3个，阳性检出率为3.61%，且3个阳性样本均来自广州市南沙区的二级苗圃，其他苗圃均未检出阳性样本。SCYLV的阳性样本数为78个，阳性检出率为93.98%。本批样本中未检测出SrMV阳性样本（表2，图1）。 选取的代表性阳性样本经测序及比对，采自广州市南沙区的‘黑皮果蔗’2号样本的SCMV扩增产物核苷酸序列（MF957202）与GenBank中已报道的中国广东（EF419174）、云南（FM997890）和阿根廷（EU196448）的SCMV株系或分离物相应区域核苷酸序列一致性高达97%～99%，确认该产物为SCMV核苷酸片段。广州市南沙区的‘黑皮果蔗’1号样本扩增出的SCYLV核苷酸序列（MF957203）与GenBank中已报道的来自印度（KF680098）、哥伦比亚（AF369928）的SCYLV分离物相应区域核苷酸序列有99%的一致性，由此证实该产物为SCYLV核苷酸片段。
2.2 甘蔗宿根矮化病PCR检测结果
采用引物Lxx1/Lxx2对30份果蔗脱毒种苗样本进行常规PCR检测，产物电泳未检测到目的条带。采用引物ITS1/ITS2和Lxx1/Lxx2对30份果蔗脱毒种苗进行巢式PCR检测，除了阳性对照外，有8个样本出现与预期目的片段大小一致的条带（条带极弱，约438 bp），且空白对照（无菌水）未出现条带（图2）。由于目的条带极弱，测序未成功，故将检测出的8个样本定为疑似宿根矮化病阳性样本，RSD疑似样本阳性检出率为26.67% （表3）。
3 讨论
世界上已报道的甘蔗花叶病病原有SCMV、SrMV、SCSMV（甘蔗线条花叶病毒）、MDMV（玉米矮花叶病毒）、JGMV（约翰逊草花叶病毒）和ZeMV（玉米花叶病毒）[25]，但引起我国蔗区甘蔗花叶病的病原主要为SCMV、SrMV和SCSMV，且引起糖蔗和果蔗的花叶病优势病原有所差异，糖蔗上花叶病的优势病毒为SrMV和SCSMV[6， 2628]，而果蔗上花叶病的优势病毒为SCMV[2930]，即糖蔗和果蔗进行花叶病病原脱除时目的病原不同。本研究对83份果蔗脱毒种苗进行SCMV、SrMV检测，SCMV阳性检出率为3.61%（3/83），SrMV未检出阳性样品，且3个SCMV阳性样本均采自广州市南沙区的二级苗圃，其他采样点均未检测出阳性样品。这3个阳性样本所携带的SCMV极有可能是外源病毒通过蔗刀或蚜虫传播至脱毒种苗，种苗自身携带SCMV的可能性较小。由此说明本批采用茎尖组织培养脱毒技术培育的果蔗脱毒种苗对果蔗种苗内的SCMV、SrMV的脱除是有效的。
本研究中，SCYLV阳性样本检出率高达93.98%（78/83），且假植苗圃、一级苗圃、二级苗圃阳性检出率均较高。相关研究表明，植物病毒基因能够整合入寄主植物基因组中，如Bennetzen[31]指出反转录功能蛋白可以把RNA反转录为DNA，从而使PRVs（植物拟逆转录病毒）整合入寄主植物基因组中。且当PRVs基因片段侵入含有反式激活蛋白转基因的植物，此病毒可以利用基因产物来完成侵染循环[32]。由于SCYLV与甘蔗杆状病毒Sugarcane bacilliform virus （SCBV）的寄主均为甘蔗，因此怀疑SCYLV是否同SCBV一样，能将SCYLV全部或部分基因组整合入甘蔗基因组内，和甘蔗基因组同步进行复制表达，并且利用这种方式进行侵染。如果推断成立，则SCYLV是无法应用植物组织培养技术脱除的。另外，Mishra等[33]研究表明，当以1.5 mm以下甘蔗茎尖分生组织作为外植体进行组织培养时，能有效脱除SCYLV，而当以超过1.5 mm茎尖分生组织作外植体时，所获得的甘蔗组培苗不能有效脱除SCYLV。本研究也有可能在进行甘蔗组织培养时，所取外植体茎尖分生組织过大，造成不能有效脱除SCYLV。建议今后进行果蔗组培脱毒时，所取外植体不超过1.5 mm。
甘蔗宿根矮化病菌Lxx寄生于甘蔗木质部维管束中，成熟蔗茎的木质部维管束发达，Lxx含量较高，而幼嫩的茎尖分生组织木质部尚未分化形成或极不发达，因此，Lxx不存在或含量极低[34]。选取较小的甘蔗茎尖分生组织作为外植体较易脱除甘蔗宿根矮化病菌（Lxx）。本研究采用常规PCP方法未检测出Lxx阳性样本，而应用较常规PCR检测灵敏度大幅度提高的巢式PCR技术[3536]，也仅检测出8个样本有疑似目的条带（测序未成功），假如这8个均为Lxx阳性样品，其携带的Lxx的含量也是极低的。可见本批采用茎尖组织培养脱毒技术培育的果蔗脱毒苗对种苗内的Lxx的脱除是有效的。
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