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【摘 要】目的：研究跳骨片不同极性部位对软骨细胞活性的影响。方法：用跳骨片的水提物、醇提物、多糖以及醇提物的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物及残留的水相共8个组分干预体外培养的软骨细胞，采用MTT法检测不同极性部位作用48 h后软骨细胞的活性。 结果：在一定剂量范围内，跳骨片的水提物、多糖，醇提物的乙酸乙酯萃取部位和水相干预组软骨细胞的活性增强，醇提物以及醇提物的石油醚、氯仿和正丁醇萃取部位干预组软骨细胞的活性降低。 结论：跳骨片的水提物、多糖和醇提物的乙酸乙酯萃取及残留的水相部位能够促进软骨细胞的增殖，为跳骨片的有效部位。
【关键词】 软骨细胞；跳骨片；极性部位
关节的正常自由活动由关节软骨的完整性维持，软骨细胞作为存在于关节软骨的惟一细胞，在维持关节软骨基本组成物细胞外基质的合成和分解代谢平衡上起着中心调控的作用，因而，软骨细胞的功能稳定性对于关节的正常活动有着重要的作用，通过促进软骨细胞的增殖加强软骨细胞的功能是临床上治疗骨科相关疾病的一种手段[1，2]。跳骨片由福州屏山制药厂生产，是由黄芪、骨碎补、血蝎、土鳖虫等20味中药制成的糖衣片，具有消肿定痛、活血舒筋、促进骨痂生长的功效，主要用于骨折、脱臼和新久伤痛的治疗，且临床疗效较好。目前，有关跳骨片的报道多集中在质量控制上[3，4]，关于其药理活性及相关作用机制的研究甚少，本文对跳骨片不同极性部位对软骨细胞活性的影响进行了初步研究，旨在为跳骨片的进一步开发利用提供前期实验基础。
1 材料和仪器
1.1 主要试剂和仪器 胎牛血清（FBS）、DMEM/LOW培养基、PBS缓冲液、胰蛋白酶（美国Hyclone公司），MTT、Ⅱ型胶酶（美国Sigma公司），二甲基亚枫（DMSO）（Biosharp公司），二氧化碳培养箱（HF212UV， Heal Force），超净工作台（SW-CJ-1D， 苏州净化），倒置式系统显微镜（1X70， OLYMPUS公司），酶标仪（ECX-800， BIO-tek）。
1.2实验动物 体重75～90 g的4周龄清洁级雄性SD大鼠4只，由福建医科大学动物中心提供。
2 实验方法
2.1 软骨细胞的培养及鉴定
2.1.1 软骨细胞的分离和原代培养 SD大鼠脱颈处死，剥离双膝并剪断，与75%的酒精中浸泡消毒15 min后，在超净台内打开关节腔，分离关节面并切取软骨，PBS洗3次后将其切成1 mm3的小块儿，PBS冲洗3次后转移至盛有5 ml 0.2 %Ⅱ型胶酶的培养皿中，在37 ℃，5% CO2的培养条件下消化，每1.5 h取上清离心收集细胞，将细胞重悬于10 % FBS完全培养，按一定密度接种于培养瓶，于培养箱内培养，重复4次至组织块近消化完全，每2天换液1次。
2.1.2 软骨细胞的传代培养 倒置显微镜观察 培养瓶中细胞铺满瓶底80%～90%时，弃去培养基，PBS洗去残留的培养基后，加入胰酶0.5 ml，于培养箱内作用2 min后镜下观察，细胞变圆，个别细胞开始浮游，立即加入新的培养基，小心吹打混匀，接种于新的培养瓶培养。
2.1.3 软骨细胞的免疫组化鉴定 第2代软骨细胞爬48 h后，PBS 冲洗，4%多聚甲醛固定30 min， PBS 洗后0.3 % TRIX-100 破膜15 min， PBS 洗后3% H2O2作用20 min后，按照免疫组化试剂盒说明书操作，阴性对照组不加Collagen Ⅱ 抗体，封片，镜下观察。
2.2 跳骨片不同极性部位的制备
2.2.1 水提物的制备 跳骨片去糖衣，称取研碎后的粉末10.4 g，加20倍体积的蒸馏水，100 ℃下回流提取3次，每次3 h，抽滤，合并滤液并减压浓缩至100 ml，取50 ml水浴蒸干成浸膏备用。
2.2.2 多糖的制备 取2.2.1项下的水提浓缩液50 ml，加入无水乙醇至含醇量达80 %，静置离心分离沉淀，沉淀物加少量蒸馏水溶解后，重复操作2次，水浴蒸干即为粗多糖。
2.2.3 醇提物的制备 称取粉碎的去糖衣后的跳骨片15.3 g，加入10倍体积的60 %乙醇于60 ℃下回流提取2 h，提取3次，抽滤，合并滤液并减压浓缩至150 ml，取50 ml水浴蒸干备用。
2.2.4 醇提物不同极性部位的制备 取2.2.3项下剩余浓缩液100 ml，依次加入石油醚、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯进行萃取，萃取液及最后的水相减压浓缩蒸干得各萃取部位的浸膏。
2.2.5 不同极性部位溶液的配置 称取一定量的跳骨片醇提物和醇提取物的石油醚、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯萃取物浸膏适量，加入DMSO配成100 mg·ml-1的母液，水提物、多糖及水相用5 % FBS配成10 mg·ml-1 母液，所有的母液均用0.2 μm的微膜过滤，滤液4 ℃保存，使用时用5 % FBS稀释。
2.3 MTT法检测跳骨片不同极性部位作用后软骨细胞的细胞活性 将第2代软骨细胞按1×104·ml-1的密度加入96孔板，100 μl每孔，培养24 h后加入不同极性部位、不同含药浓度的5 % FBS培养基，以不加药物的5 % FBS培养基组为对照，每个浓度设置复孔9个，干预48 h后弃去培养基，每孔加入0.1 %的MTT100 μl，于培养箱内作用4 h后弃MTT，加入DMSO150 μl每孔，充分振荡10min，酶标仪 570 nm检测波长下测定各孔的吸光度，取其均值进行比较。
2.4 统计学分析 实验数据应用SPSS16.0软件包进行统计分析，数据均用表示，组间差异统计学意义比较采用单因素方差分析，以P<0.05为具有统计学意义。
3 结 果
3.1 软骨细胞的形态 刚分离的软骨细胞为小圆形，悬浮于细胞培养液中。培养24 h后，细胞逐渐贴壁，体积增大，少部分细胞伸长形成突起，见图1（1）。培养3天后，细胞开始呈长梭形或椭圆形积聚生长，轮廓清晰，见图1（2）。长至8天左右，细胞可铺满瓶底，见图1（3）。传代培养后，细胞的增殖速度明显快于原代，细胞多呈规则的椭圆形，一般3～4天就可融合铺满。 3.2 软骨细胞的鉴定 Ⅱ型胶原蛋白基质是软骨细胞的特异性蛋白，通常被作为软骨细胞鉴定的生物标记物。免疫组化结果显示，阴性对照组的软骨细胞没被染上任何颜色，而CollagenⅡ抗体孵育过的软骨细胞的胞浆呈现出黄棕色，见图1（4）。
3.3 跳骨片不同极性部位对软骨细胞活性的影响 MTT法检测显示，跳骨片水提物（Ⅰ）、多糖（Ⅱ）、石油醚萃取部位（Ⅶ）、水相（Ⅷ）在适宜的浓度范围内能够促进软骨细胞的增殖，且呈一定的剂量依赖性，最佳浓度P<0.05，醇提物（Ⅲ）、石油醚（Ⅳ）、氯仿（Ⅴ）、正丁醇（Ⅵ）萃取部位会不同程度抑制软骨细胞的活性，呈明显的剂量依赖性，且P<0.01，见表1。在最佳作用浓度下，各部位的促增殖效果水提物>乙酸乙酯萃取部位>多糖>水相，见图2。
4 讨 论
骨折是由骨或软骨的完整性或连续性遭到破坏而引起的骨关节损伤，因而在其愈合过程中，软骨细胞的增殖和分化对骨修复起着至关重要的作用[5]。中国传统医学在治疗骨折上有着悠久的历史，认为无论内服或外用药物均有活血化瘀、消肿止痛、续筋接骨的功效，临床上对骨折的治疗主要是早期用活血化瘀药去瘀生新，中期用接骨类药促进骨折的愈合，后期加用补益类中药增强肝肾功能，加速骨折愈合[6]。现代药理研究表明，中药及其有效成分可通过改善局部血液循环、促进血肿吸收、调节骨生长因子分泌、调节体内离子含量等多个方面促进骨折的愈合[7]。
跳骨片由血蝎、土鳖虫等活血药，骨碎补、自然铜等接骨药，黄芪、狗脊等补益药共20味组成，作为临床治疗骨折、脱臼和新久伤痛的常用药物，其活性成分和相关作用机制尚未见报道，本实验应用跳骨片不同极性部位对体外培养的软骨细胞进行干预，拟在探讨不同极性部位对软骨细胞的活性影响，以筛选出能够促进软骨细胞增殖的有效部位。结果显示，一定浓度的跳骨片水提物、多糖、醇提物的乙酸乙酯萃取部位和水相能够促进软骨细胞的增殖，且经统计学分析其增殖效应具有统计学意义，可能为跳骨片的活性部位，但是其具体活性成分及相关作用机制有待进一步探讨，这为跳骨片的深入研究提供了前期理论基础和新的研究方向。
5 参考文献
[1] Schroeppel JP， Crist JD， Anderson HC， et al. Molecular regulation of articular chondrocyte function and its significance in osteoarthritis [J]. Histology and Histopathology， 2011， 26（3）：377-394.
[2] Li XH， Ye HZ， Yu FR， et al. Millimeter wave treatment promotes chondrocytes proliferation via G1/S cell cycle transition [J]. Int J Mol Med， 2012，29（5）：823-831.
[3] 刘军铃.跳骨片质量标准的研究[J].安徽医药，2008，12（2）：125-126.
[4] 郑广东.RP-HPLC法测定跳骨片中橙皮苷的含量[J].海峡药学，2006，18 （2）：69-70.
[5] 李华，王凡，李瑞祥，等.二期骨折愈合中骨痂软骨细胞增殖变化的研究[J].四川大学学报，2003，34（2）：274-276.
[6] 刘兴坤，谷福顺.单味中药及其有效成分骨折愈合作用的研究进展[J].中医正骨，2012，24（5）：75-77.
[7] 施莱.中药加速骨折愈合机理的研究[J].长春中医药大学学报，2010，26（4）： 600-602.
【关键词】 软骨细胞；跳骨片；极性部位
关节的正常自由活动由关节软骨的完整性维持，软骨细胞作为存在于关节软骨的惟一细胞，在维持关节软骨基本组成物细胞外基质的合成和分解代谢平衡上起着中心调控的作用，因而，软骨细胞的功能稳定性对于关节的正常活动有着重要的作用，通过促进软骨细胞的增殖加强软骨细胞的功能是临床上治疗骨科相关疾病的一种手段[1，2]。跳骨片由福州屏山制药厂生产，是由黄芪、骨碎补、血蝎、土鳖虫等20味中药制成的糖衣片，具有消肿定痛、活血舒筋、促进骨痂生长的功效，主要用于骨折、脱臼和新久伤痛的治疗，且临床疗效较好。目前，有关跳骨片的报道多集中在质量控制上[3，4]，关于其药理活性及相关作用机制的研究甚少，本文对跳骨片不同极性部位对软骨细胞活性的影响进行了初步研究，旨在为跳骨片的进一步开发利用提供前期实验基础。
1 材料和仪器
1.1 主要试剂和仪器 胎牛血清（FBS）、DMEM/LOW培养基、PBS缓冲液、胰蛋白酶（美国Hyclone公司），MTT、Ⅱ型胶酶（美国Sigma公司），二甲基亚枫（DMSO）（Biosharp公司），二氧化碳培养箱（HF212UV， Heal Force），超净工作台（SW-CJ-1D， 苏州净化），倒置式系统显微镜（1X70， OLYMPUS公司），酶标仪（ECX-800， BIO-tek）。
1.2实验动物 体重75～90 g的4周龄清洁级雄性SD大鼠4只，由福建医科大学动物中心提供。
2 实验方法
2.1 软骨细胞的培养及鉴定
2.1.1 软骨细胞的分离和原代培养 SD大鼠脱颈处死，剥离双膝并剪断，与75%的酒精中浸泡消毒15 min后，在超净台内打开关节腔，分离关节面并切取软骨，PBS洗3次后将其切成1 mm3的小块儿，PBS冲洗3次后转移至盛有5 ml 0.2 %Ⅱ型胶酶的培养皿中，在37 ℃，5% CO2的培养条件下消化，每1.5 h取上清离心收集细胞，将细胞重悬于10 % FBS完全培养，按一定密度接种于培养瓶，于培养箱内培养，重复4次至组织块近消化完全，每2天换液1次。
2.1.2 软骨细胞的传代培养 倒置显微镜观察 培养瓶中细胞铺满瓶底80%～90%时，弃去培养基，PBS洗去残留的培养基后，加入胰酶0.5 ml，于培养箱内作用2 min后镜下观察，细胞变圆，个别细胞开始浮游，立即加入新的培养基，小心吹打混匀，接种于新的培养瓶培养。
2.1.3 软骨细胞的免疫组化鉴定 第2代软骨细胞爬48 h后，PBS 冲洗，4%多聚甲醛固定30 min， PBS 洗后0.3 % TRIX-100 破膜15 min， PBS 洗后3% H2O2作用20 min后，按照免疫组化试剂盒说明书操作，阴性对照组不加Collagen Ⅱ 抗体，封片，镜下观察。
2.2 跳骨片不同极性部位的制备
2.2.1 水提物的制备 跳骨片去糖衣，称取研碎后的粉末10.4 g，加20倍体积的蒸馏水，100 ℃下回流提取3次，每次3 h，抽滤，合并滤液并减压浓缩至100 ml，取50 ml水浴蒸干成浸膏备用。
2.2.2 多糖的制备 取2.2.1项下的水提浓缩液50 ml，加入无水乙醇至含醇量达80 %，静置离心分离沉淀，沉淀物加少量蒸馏水溶解后，重复操作2次，水浴蒸干即为粗多糖。
2.2.3 醇提物的制备 称取粉碎的去糖衣后的跳骨片15.3 g，加入10倍体积的60 %乙醇于60 ℃下回流提取2 h，提取3次，抽滤，合并滤液并减压浓缩至150 ml，取50 ml水浴蒸干备用。
2.2.4 醇提物不同极性部位的制备 取2.2.3项下剩余浓缩液100 ml，依次加入石油醚、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯进行萃取，萃取液及最后的水相减压浓缩蒸干得各萃取部位的浸膏。
2.2.5 不同极性部位溶液的配置 称取一定量的跳骨片醇提物和醇提取物的石油醚、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯萃取物浸膏适量，加入DMSO配成100 mg·ml-1的母液，水提物、多糖及水相用5 % FBS配成10 mg·ml-1 母液，所有的母液均用0.2 μm的微膜过滤，滤液4 ℃保存，使用时用5 % FBS稀释。
2.3 MTT法检测跳骨片不同极性部位作用后软骨细胞的细胞活性 将第2代软骨细胞按1×104·ml-1的密度加入96孔板，100 μl每孔，培养24 h后加入不同极性部位、不同含药浓度的5 % FBS培养基，以不加药物的5 % FBS培养基组为对照，每个浓度设置复孔9个，干预48 h后弃去培养基，每孔加入0.1 %的MTT100 μl，于培养箱内作用4 h后弃MTT，加入DMSO150 μl每孔，充分振荡10min，酶标仪 570 nm检测波长下测定各孔的吸光度，取其均值进行比较。
2.4 统计学分析 实验数据应用SPSS16.0软件包进行统计分析，数据均用表示，组间差异统计学意义比较采用单因素方差分析，以P<0.05为具有统计学意义。
3 结 果
3.1 软骨细胞的形态 刚分离的软骨细胞为小圆形，悬浮于细胞培养液中。培养24 h后，细胞逐渐贴壁，体积增大，少部分细胞伸长形成突起，见图1（1）。培养3天后，细胞开始呈长梭形或椭圆形积聚生长，轮廓清晰，见图1（2）。长至8天左右，细胞可铺满瓶底，见图1（3）。传代培养后，细胞的增殖速度明显快于原代，细胞多呈规则的椭圆形，一般3～4天就可融合铺满。 3.2 软骨细胞的鉴定 Ⅱ型胶原蛋白基质是软骨细胞的特异性蛋白，通常被作为软骨细胞鉴定的生物标记物。免疫组化结果显示，阴性对照组的软骨细胞没被染上任何颜色，而CollagenⅡ抗体孵育过的软骨细胞的胞浆呈现出黄棕色，见图1（4）。
3.3 跳骨片不同极性部位对软骨细胞活性的影响 MTT法检测显示，跳骨片水提物（Ⅰ）、多糖（Ⅱ）、石油醚萃取部位（Ⅶ）、水相（Ⅷ）在适宜的浓度范围内能够促进软骨细胞的增殖，且呈一定的剂量依赖性，最佳浓度P<0.05，醇提物（Ⅲ）、石油醚（Ⅳ）、氯仿（Ⅴ）、正丁醇（Ⅵ）萃取部位会不同程度抑制软骨细胞的活性，呈明显的剂量依赖性，且P<0.01，见表1。在最佳作用浓度下，各部位的促增殖效果水提物>乙酸乙酯萃取部位>多糖>水相，见图2。
4 讨 论
骨折是由骨或软骨的完整性或连续性遭到破坏而引起的骨关节损伤，因而在其愈合过程中，软骨细胞的增殖和分化对骨修复起着至关重要的作用[5]。中国传统医学在治疗骨折上有着悠久的历史，认为无论内服或外用药物均有活血化瘀、消肿止痛、续筋接骨的功效，临床上对骨折的治疗主要是早期用活血化瘀药去瘀生新，中期用接骨类药促进骨折的愈合，后期加用补益类中药增强肝肾功能，加速骨折愈合[6]。现代药理研究表明，中药及其有效成分可通过改善局部血液循环、促进血肿吸收、调节骨生长因子分泌、调节体内离子含量等多个方面促进骨折的愈合[7]。
跳骨片由血蝎、土鳖虫等活血药，骨碎补、自然铜等接骨药，黄芪、狗脊等补益药共20味组成，作为临床治疗骨折、脱臼和新久伤痛的常用药物，其活性成分和相关作用机制尚未见报道，本实验应用跳骨片不同极性部位对体外培养的软骨细胞进行干预，拟在探讨不同极性部位对软骨细胞的活性影响，以筛选出能够促进软骨细胞增殖的有效部位。结果显示，一定浓度的跳骨片水提物、多糖、醇提物的乙酸乙酯萃取部位和水相能够促进软骨细胞的增殖，且经统计学分析其增殖效应具有统计学意义，可能为跳骨片的活性部位，但是其具体活性成分及相关作用机制有待进一步探讨，这为跳骨片的深入研究提供了前期理论基础和新的研究方向。
5 参考文献
[1] Schroeppel JP， Crist JD， Anderson HC， et al. Molecular regulation of articular chondrocyte function and its significance in osteoarthritis [J]. Histology and Histopathology， 2011， 26（3）：377-394.
[2] Li XH， Ye HZ， Yu FR， et al. Millimeter wave treatment promotes chondrocytes proliferation via G1/S cell cycle transition [J]. Int J Mol Med， 2012，29（5）：823-831.
[3] 刘军铃.跳骨片质量标准的研究[J].安徽医药，2008，12（2）：125-126.
[4] 郑广东.RP-HPLC法测定跳骨片中橙皮苷的含量[J].海峡药学，2006，18 （2）：69-70.
[5] 李华，王凡，李瑞祥，等.二期骨折愈合中骨痂软骨细胞增殖变化的研究[J].四川大学学报，2003，34（2）：274-276.
[6] 刘兴坤，谷福顺.单味中药及其有效成分骨折愈合作用的研究进展[J].中医正骨，2012，24（5）：75-77.
[7] 施莱.中药加速骨折愈合机理的研究[J].长春中医药大学学报，2010，26（4）： 600-602.