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摘要：【目的】研究油棕果實发育过程中的内含物含量和抗氧化酶活性的变化规律，为油棕果实的生长发育调控提供理论依据。【方法】取不同发育时期（雌蕊及授粉1～5个月，记为0M，1M～5M）油棕雌蕊或果实，分别测定果重、果长、果宽，中果皮含油量、总糖含量、可溶性蛋白含量、过氧化氢（H2O2）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、苹果酸脱氢酶（MDH）、谷胱甘肽还原酶（GR）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性，分析各指标的变化规律和内含物与抗氧化酶活性的相关性。【结果】果实在授粉后2个月快速生长，至第5个月停止。木质素从授粉后1个月开始沉积，到果实成熟停止。中果皮含油量在果实发育前期缓慢上升，后期快速升高，含油量最后达46.02%;总糖含量在授粉后前期较高（92.69 mg/g），之后快速下降并维持不变;可溶性蛋白含量先上升后下降至雌花未授粉时的水平（0.18 g/L）;H2O2含量急剧下降后维持较低水平，0M的H2O2含量最多（1582.44 mmol/g prot）。SOD活性先下降后上升，0M的总SOD活性最强（589.43 U/mg prot）;MDH活性前期不变后期迅速增强，4M的MDH活性最高（4.71 U/mg prot）;GR活性先升高后降低，1M时GR活性达最高值（0.0051 U/g prot）;CAT活性呈波段变化，在4M时达最高值（59.72 U/mg prot）;POD活性先下降后上升，5M时POD活性达最高值（287.94 U/mg prot）。油棕中果皮总糖含量与H2O2含量呈极显著正相关（P<0.01，下同），可溶性蛋白含量与总SOD活性呈极显著负相关，果实重量与果实大小呈极显著正相关。【结论】油棕果实发育过程中，早期高含量的糖和蛋白质为后期油脂和木质素积累打下基础，其中MDH和GR活性可作为判断果实生长发育状况的指标之一。
关键词： 油棕;果实;内含物;抗氧化酶
中图分类号： S565.901 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）04-1050-08
Change pattern of fruit development， mesocarp inclusions contents and antioxidant enzyme activity in oil palm
SHI Peng， WANG Yong*， ZHANG Da-peng
（Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/National Tropical Palm Germplasm Nursery/Scientific Observing and Experimental Station of Tropical Oil Plants， Ministry of agriculture and Rural
Affairs/Hainan Key Laboratory of Tropical Oil Crops Biology， Wenchang， Hainan 571339， China）
Abstract：【Objective】In order to provide a theoretical basis for the regulation of fruit development in oil palm， the changes of inclusion contents and antioxidant activities during oil palm growth were studied. 【Method】Oil palm pistil or fruit at different developmental periods（pistil and pollination for 1-5 months，marked as 0M，1M-5M） were selected， fruit weight， fruit length， fruit width， oil content， sugar content， soluble protein content，activities of hydrogen peroxide（H2O2）， superoxide dismutase（SOD）， malic dehydrogenase（MDH）， glutathione reductase（GR）， catalase（CAT） and peroxidase（POD） in the mesocarp of oil palm were measured. The change rule of each index and the correlation between the inclusions contents and the activities of antioxidant enzymes were analyzed. 【Result】The fruit grew rapidly 2 months after pollination and stopped at the 5th month. The lignin began to deposit one month after pollination and stopped at fruit ripening. The oil content of fruit increased slowly in the early stages of fruit development， but increased rapidly in the la-ter stages， and oil content reached 46.02% finally; the total sugar content was higher（92.69 mg/g） in the early stage after pollination， and then decreased rapidly and remained unchanged. The protein concentration increased first and then decreased to the level（0.18 g/L） when the female flower was not pollinated; the hydrogen peroxide content decreased sharply and then maintained a lower level， reached the highest level（1582.44 mmol/g prot） at 0M stage. SOD activity firstly decreased and then increased， reached the highest level（589.43 U/mg prot） at 0M stage; MDH activity firstly remained unchanged and then increased sharply， reached the highest level（4.71 U/mg prot） at 4M stage; GR activity first increased and then decreased， reached the highest level（0.0051 U/g prot） at 1M stage; CAT activity showed wave band change， reached the highest level（59.72 U/mg prot） at 4M stage; POD activity first decreased and then increased， reached the highest level（287.94 U/mg prot） at 5M stage. There was extremely significant positive correlation between total sugar content and H2O2 content（P<0.01， the same below）， there was extremely significant negative correlation between soluble protein content and total SOD activity， and extremely significant positive correlation between fruit weight and fruit size. 【Conclusion】During oil palm fruit development， high sugar and protein content in the early stage may contribute to the accumulation of oil and lignin in the later stage，the activities of MDH and GR can be used as one of the indexes to judge the fruit growth and development. Key words： oil palm; fruit; inclusions; antioxidant enzyme
Foundation item： Youth Project of Hainan Natural Science Foundation（319QN323）;Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund for Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences（17CXTD-13）; Open Project of Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops，Ministry of Agriculture and Rural Affairs（KF2019 007）;International Exchanges and Cooperation Project of Ministry of Agriculture and Rural Affairs（BARTP-06-WFY）
0 引言
【研究意义】油棕（Elaeis guineensis）屬棕榈科多年生乔木，是热带地区重要的木本油料作物（石鹏等，2017）。油棕平均每公顷产油量高达3.5 t，有世界油王的称号（Barcelos et al.，2015）。然而，不同品种、不同地区及不同季节油棕产量存在差异（刘世红等，2020）。果实是油棕的唯一产油器官，其生长发育情况直接影响棕榈油产量。相关研究表明，抗氧化酶可维持植物细胞内活性氧（ROS）的动态平衡，保护植物正常的生长发育（王小玲等，2019），而油棕果实中抗氧化酶活性与果实油脂、糖、蛋白质等内含物含量的关系尚不清楚。因此，开展油棕果实生长发育过程中内含物与抗氧化酶关系研究，对于理解油棕果实发育过程具有重要意义。【前人研究进展】果实发育过程中伴随内含物的积累和转换，有些林木果实前期积累糖和淀粉，后期大多转化为脂肪和蛋白质（刘倩倩等，2011;齐昆等，2011）。随着果实发育，油棕果实油脂不断积累，同时糖逐渐减少（梁远学等，2012;殷振华等，2016），且内含物变化与椰枣差异巨大，油棕光合作用将二氧化碳主要合成为油脂，而椰枣则主要合成为糖（Bourgis et al.，2011），说明油棕果实有其独特的内含物积累特征。另外，油棕果实中含有约15.68%的坚硬种壳（Shi et al.，2019）和木质纤维，木质素沉积可通过染色法观察（史梦雅等，2013;孟泽等，2016），木质素由光合作用产物合成而来（张旭等，2019），而木质素及其相关酶活性与植物的生长发育、抗逆性密切相关（李朝英等，2019），也可能会影响其他内含物含量。目前，关于油棕叶片内含物和抗氧化酶活性的报道，倪书邦等（2012）研究了西双版纳引进的油棕新品种的抗寒性及抗氧化系统，表明低温胁迫下可诱导引发保护酶活性，以消除部分低温下产生的超氧阴离子自由基，从而减轻低温对膜的损伤。刘艳菊等（2015）研究表明低温对油棕幼苗有明显的氧化损伤，但一定程度上可能会增加可溶性蛋白质和可溶性糖等内含物含量以及过氧化氢（H2O2）含量和苹果酸脱氢酶（MDH）活性。【本研究切入点】前人报道了油棕果实内含物积累规律及低温胁迫对抗氧化酶系统的影响等，但尚未见关于油棕果实内含物积累与抗氧化酶间关系的研究报道。【拟解决的关键问题】在油棕果实不同发育时期观察木质素沉积和油脂积累情况，分析超氧化物歧化酶（SOD）、MDH、谷胱甘肽还原酶（GR）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性及H2O2含量变化规律，探究上述内含物和抗氧化酶活性间关系及抗氧化酶对果实生长发育的保护等，为油棕果实生长发育调控提供依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
试验材料为9年生薄壳种油棕树，于2019年8月取自中国热带农业科学院椰子研究所的国家热带棕榈种质资源圃（油棕分区）。在油棕雌花授粉后，分别选雌蕊（0M）及授粉1～5个月后（1M、2M、3M、4M、5M）的油棕果实为材料。
主要试剂：正己烷（西陇化工，分析纯），间苯三酚（上海源叶JP340005-10 g），苏丹Ⅲ（索莱宝S8460-5 g），油红O-异丙醇饱和液（上海源叶R20641-100 mL），包埋剂（樱花OCT）。试剂盒：蛋白定量测定试剂盒（南京建成100T/96样），总糖含量测定试剂盒（南京建成50T/48样），总超氧化物歧化酶（T-SOD）测定试剂盒（南京建成100T/96样），POD测定试剂盒（南京建成100T/48样），CAT测定试剂盒（南京建成100T/96样），MDH测定试剂盒（南京建成50T/48样），H2O2测定试剂盒（南京建成50T/48样）。其他常用化学试剂均为试剂纯。仪器设备：数显游标卡尺（桂林广陆SF2000），粗脂肪测定仪（上海精科JK-CFD-6F），电子天平（上海民桥SL502），台式高速冷冻离心机（上海天美CT18RT），紫外可见光光度计（上海精科752N），冷冻切片机（Leica CM1900），普通光学显微镜（Leica DM2500），体视显微镜（Leica M50）。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 果实发育指标测量 随机选取4个雌蕊或果实，分别用电子天平称重、游标卡尺测量果实长度和宽度。
1. 2. 2 中果皮内含物含量和抗氧化酶活性测定
含油量参照石鹏等（2017）的方法测定;可溶性蛋白含量及SOD、POD和GR活性参照李东霞等（2019）的方法测定;测定总糖含量的操作步骤按照总糖含量检测试剂盒说明书进行;CAT、MDH、H2O2活性或含量分别按照试剂盒说明书的步骤进行测定。测定此部分生理指标时，每个样品均3次重复。 1. 2. 3 果实木质素沉积和油脂积累观察 间苯三酚染液配制：称取0.1 g间苯三酚，加入100 mL的14%盐酸乙醇溶液中;苏丹Ⅲ染液配制：称取0.1 g苏丹Ⅲ，加20 mL的95%乙醇。剪开雌蕊或果实，用间苯三酚染液染色2 h后在体视显微镜下观察，粉红色或深红色表示有木质素沉积。设置箱体内温度 -24 ℃，速冻台温度-20 ℃，标本头-11 ℃，用冷冻切片机切取10 μm切片（张大鹏等，2018），苏丹Ⅲ染液染色20 min后，用ddH2O冲洗后在显微镜下观察，橘黄色表示有油脂积累。冷冻切片使用油红O染液染色后2 min，ddH2O冲洗后在显微镜下观察，红色表示有油脂积累。
1. 3 统计分析
试验数据用Excel 2007进行整理及制图;使用OriginPro 2018进行相关性、方差分析和多重比较分析，采用Fisher LSD比较均值，采用Levene进行方差齐性检验。
2 结果与分析
2. 1 油棕果实生长发育过程中果重和大小的变化情况
在油棕果实生长发育过程中，油棕的果长、果宽和果重随着果实的发育程度逐渐增长（图1和图2）。0M～2M时期，油棕果长和果宽增长缓慢，2M～4M时期，果实大小迅速增长，月均果长和果宽增长量分别高达7.50和5.94 mm。果实快要成熟前（4M～5M）基本停止增长，果实宽度增加较少。油棕果重的增长趋势与果长和果宽类似，0M～2M时果重增长速度缓慢，2M～5M油棕果实重量迅速增长，月均增长量高达3.99 g。由此可知，油棕果实快速生长期主要集中在2M～4M时期。
2. 2 油棕果实木质素沉积和油脂变化规律
如图3所示，木质素随着油棕果实生长发育不断增多，0M时期雌蕊少见木质素，1M～5M时期在中果皮可见木质素，从2M时期开始在果实中部内果皮部位可见木质素环，5M时期内果皮发育成黑色的种壳，大量木质素密集分布在种壳周围。
如图4和图5所示，分别用苏丹Ⅲ和油红O对中果皮和胚乳染色，均发现中果皮在0M～4M时期少有油脂积累，5M时期油脂积累明显增多，说明4M～5M时期是油脂快速积累的时期。胚乳在4M早期以前主要以液态形式存在，液体胚乳无法切片观察，4M～5M时期油脂积累明显增多。另外，中果皮细胞大多呈椭圆形或长条形，胚乳细胞大多呈长方形且排列整齐。
2. 3 中果皮内含物含量变化规律
如图6所示，随着油棕果实的发育，油棕中果皮的含油量逐渐增加，总糖含量逐渐降低，可溶性蛋白含量表现出先升高后降低的变化趋势。油棕雌花授粉后几乎没有含油量，果实发育到1M时期果皮才有油脂积累;4M～5M时期是中果皮油脂快速积累时期，5M时期果皮含油量达最高值，为46.02%，与其他发育时期中果皮含油量差异极显著（P<0.01，下同）。雌花授粉后油棕中果皮的总糖含量最多，为92.69 mg/g，与其他发育时期总糖含量差异极显著;1M～3M时期总糖含量差异不显著（P>0.05，下同）;总糖含量在4M时期最低，为26.21 mg/g，5M时期又开始上升。在0M～1M时期，油棕中果皮的可溶性蛋白含量迅速增加，而1M时期之后可溶性蛋白含量又逐渐降低;各发育时期的可溶性蛋白含量变化差异较大，1M～3M时期油棕中果皮的可溶性蛋白含量相对较高，其中1M时期的可溶性蛋白含量最高，为0.66 g/L，5M时期的可溶性蛋白含量较低，仅0.18 g/L。
2. 4 中果皮抗氧化酶活性变化规律
2. 4. 1 中果皮H2O2含量变化规律 如图7-A所示，油棕中果皮发育过程中，H2O2含量除0M时期外均保持较低水平。0M时期油棕中果皮的H2O2含量最多，为1582.44 mmol/g prot，与其他果实发育时期果肉中H2O2含量存在极显著差异;而在1M～5M时期，油棕中果皮的H2O2含量变化差异不显著，其变化呈先上升后下降的变化趋势，其中，1M时期的H2O2含量最少，仅85.70 mmol/g prot。
2. 4. 2 中果皮SOD活性变化规律 如图7-B所示，中果皮总SOD活性呈先下降后上升的变化趋势。0M时期油棕中果皮的总SOD活性最强，为589.43 U/mg prot，与1M～3M时期总SOD活性变化差异极显著;1M时，总SOD活性下降至最低值（163.91 U/mg prot），2M时期有所提高，而后到3M时期又下降;4M和5M果实成熟时总SOD活性回升至494.27和572.15 U/mg prot，与0M的总SOD活性变化差异不显著。
2. 4. 3 中果皮MDH活性变化规律 如图7-C所示，中果皮MDH活性呈先上升后下降的变化趋势。4M时期油棕中果皮的MDH活性最高，为4.71 U/mg prot，与其他发育时期的MDH活性变化差异显著（P<0.05，下同）;0M时期的MDH活性最低，为0.19 U/mg prot，1M～3M时期MDH活性有所增长，4M时期达最高值，5M时期MDH活性又降至3.47 U/mg prot。
2. 4. 4 中果皮GR活性变化规律 如图7-D所示，中果皮GR活性也呈先上升后下降的变化趋势。从0M～1M时期，油棕中果皮的GR活性从0.0033 U/g prot上升至0.0051 U/g prot，1M時期GR活性达最高值，与其他发育时期的GR活性变化差异显著;1M后GR活性开始下降，5M时期GR活性达最低值，仅为0.0004 U/g prot。
2. 4. 5 中果皮CAT活性变化规律 如图7-E所示，中果皮CAT活性处于波动变化状态。油棕中果皮的CAT活性在4M时期达最高值，为59.72 U/mg prot，与其他发育时期CAT活性变化差异显著;0M时期CAT活性最低，为7.70 U/mg prot，之后CAT活性上升至2M时期的39.00 U/mg prot;3M时期的CAT活性又有所下降，而3M过后CAT活性急剧上升，到4M时期CAT活性上升至最高，然而5M后又下降至18.57 U/mg prot。 2. 4. 6 中果皮POD活性变化规律 如图7-F所示，中果皮POD活性呈先下降后上升的变化趋势。0M时期油棕中果皮的POD活性为199.70 U/mg prot，0M～1M时期POD活性开始下降到1M时POD活性达到最低，为93.14 U/mg prot，1M后POD活性逐渐增加，到5M时POD活性达最高，为287.94 U/mg prot，与其他发育时期的POD活性变化差异极显著。
2. 5 油棕中果皮内含物、抗氧化酶活性及果实性状相关分析
油棕果实生长发育与中果皮内含物含量和抗氧化酶活性之间存在相关性，内含物含量和抗氧化酶活性随果实生长发育变化。由表1可知，油棕中果皮总糖含量与H2O2含量呈极显著正相关，可溶性蛋白含量与SOD活性呈极显著负相关，果实重量与果实大小（即果长和果宽）呈极显著正相关。油棕中果皮可溶性蛋白含量与POD活性呈显著负相关，POD活性与含油量和SOD活性均呈显著正相关。油棕中果皮含油量与果实重量呈显著正相关，油棕果宽与果长呈极显著正相关，油棕果皮MDH活性和GR活性分别与果实重量和大小呈显著正相关和负相关。
3 讨论
果实发育前期（0M～3M）油棕中果皮的总糖和蛋白质含量较多，含油量很少，而果实成熟时期（4M～5M）则相反，含油量多，总糖和蛋白质含量少，与Bourgis等（2011）的研究结果一致。其原因可能是在油棕果实生长发育初期代谢旺盛，果实的生长发育所需的能量主要由糖类提供，蛋白质催化油棕果实生长发育的代谢反应。当果实成熟时，果实中的糖类和蛋白质可能转化为油脂或木质素。胚乳中的油脂主要储存能量，供种子下一步萌发用，而中果皮的油脂用来吸引动物吃油棕果实，从而帮助传播油棕种子，增大种子传播的范围。果皮中的木质素则用于保护种子，免受外部恶劣环境破坏。油棕果实木质素从1M～5M逐渐增加，与此时期的POD和SOD活性变化趋势一致，POD和SOD可能与木质素含量增加有关（邱志浩等，2019）
油棕果实发育0M时，H2O2的含量最多，与油棕果实其他发育时期的H2O2含量变化存在极显著差异。可能是因为雌花授粉后，形成受精卵要发育成果实的过程中，细胞有氧呼吸和代谢旺盛，因此所产生的有氧代谢产物H2O2含量高（张炜，2016）。油棕果实发育初期GR活性强，而成熟期活性弱。其原因是GR主要存在于植物叶绿体基质中，油棕果实发育初期果实呈黑色，细胞中含有的叶绿体多，而成熟后的油棕果实呈橙红色，细胞中含有的叶绿体减少。果实发育初期，由于细胞代谢旺盛，产生的有氧代谢产物H2O2含量多（李静等，2020），因此抗氧化酶如SOD和POD活性也相应地增强。而在果实成熟期，MDH、CAT、POD和SOD抗氧化酶活性也增强的原因可能是为了减少细胞代谢，从而延缓细胞衰老（石瑞婷，2006）。内含物含量和抗氧化酶活性与果实生长发育指标之间存在一定的相关性，MDH活性与果实大小和重量呈显著正相关，而GR活性与果实大小和重量呈显著负相关，可作为判断果实生长发育的指标之一。另外，抗氧化酶活性的动态变化调控油棕果实生长发育，保护果实细胞膜系统免受过量ROS的破坏（王小玲等，2019）。
4 结论
油棕果实发育过程中，早期高含量的糖和蛋白质为后期油脂和木质素积累打下基础，其中MDH和GR活性可作为判断果实生长发育状况的指标之一。
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（责任编辑 邓慧灵）
关键词： 油棕;果实;内含物;抗氧化酶
中图分类号： S565.901 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）04-1050-08
Change pattern of fruit development， mesocarp inclusions contents and antioxidant enzyme activity in oil palm
SHI Peng， WANG Yong*， ZHANG Da-peng
（Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/National Tropical Palm Germplasm Nursery/Scientific Observing and Experimental Station of Tropical Oil Plants， Ministry of agriculture and Rural
Affairs/Hainan Key Laboratory of Tropical Oil Crops Biology， Wenchang， Hainan 571339， China）
Abstract：【Objective】In order to provide a theoretical basis for the regulation of fruit development in oil palm， the changes of inclusion contents and antioxidant activities during oil palm growth were studied. 【Method】Oil palm pistil or fruit at different developmental periods（pistil and pollination for 1-5 months，marked as 0M，1M-5M） were selected， fruit weight， fruit length， fruit width， oil content， sugar content， soluble protein content，activities of hydrogen peroxide（H2O2）， superoxide dismutase（SOD）， malic dehydrogenase（MDH）， glutathione reductase（GR）， catalase（CAT） and peroxidase（POD） in the mesocarp of oil palm were measured. The change rule of each index and the correlation between the inclusions contents and the activities of antioxidant enzymes were analyzed. 【Result】The fruit grew rapidly 2 months after pollination and stopped at the 5th month. The lignin began to deposit one month after pollination and stopped at fruit ripening. The oil content of fruit increased slowly in the early stages of fruit development， but increased rapidly in the la-ter stages， and oil content reached 46.02% finally; the total sugar content was higher（92.69 mg/g） in the early stage after pollination， and then decreased rapidly and remained unchanged. The protein concentration increased first and then decreased to the level（0.18 g/L） when the female flower was not pollinated; the hydrogen peroxide content decreased sharply and then maintained a lower level， reached the highest level（1582.44 mmol/g prot） at 0M stage. SOD activity firstly decreased and then increased， reached the highest level（589.43 U/mg prot） at 0M stage; MDH activity firstly remained unchanged and then increased sharply， reached the highest level（4.71 U/mg prot） at 4M stage; GR activity first increased and then decreased， reached the highest level（0.0051 U/g prot） at 1M stage; CAT activity showed wave band change， reached the highest level（59.72 U/mg prot） at 4M stage; POD activity first decreased and then increased， reached the highest level（287.94 U/mg prot） at 5M stage. There was extremely significant positive correlation between total sugar content and H2O2 content（P<0.01， the same below）， there was extremely significant negative correlation between soluble protein content and total SOD activity， and extremely significant positive correlation between fruit weight and fruit size. 【Conclusion】During oil palm fruit development， high sugar and protein content in the early stage may contribute to the accumulation of oil and lignin in the later stage，the activities of MDH and GR can be used as one of the indexes to judge the fruit growth and development. Key words： oil palm; fruit; inclusions; antioxidant enzyme
Foundation item： Youth Project of Hainan Natural Science Foundation（319QN323）;Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund for Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences（17CXTD-13）; Open Project of Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops，Ministry of Agriculture and Rural Affairs（KF2019 007）;International Exchanges and Cooperation Project of Ministry of Agriculture and Rural Affairs（BARTP-06-WFY）
0 引言
【研究意义】油棕（Elaeis guineensis）屬棕榈科多年生乔木，是热带地区重要的木本油料作物（石鹏等，2017）。油棕平均每公顷产油量高达3.5 t，有世界油王的称号（Barcelos et al.，2015）。然而，不同品种、不同地区及不同季节油棕产量存在差异（刘世红等，2020）。果实是油棕的唯一产油器官，其生长发育情况直接影响棕榈油产量。相关研究表明，抗氧化酶可维持植物细胞内活性氧（ROS）的动态平衡，保护植物正常的生长发育（王小玲等，2019），而油棕果实中抗氧化酶活性与果实油脂、糖、蛋白质等内含物含量的关系尚不清楚。因此，开展油棕果实生长发育过程中内含物与抗氧化酶关系研究，对于理解油棕果实发育过程具有重要意义。【前人研究进展】果实发育过程中伴随内含物的积累和转换，有些林木果实前期积累糖和淀粉，后期大多转化为脂肪和蛋白质（刘倩倩等，2011;齐昆等，2011）。随着果实发育，油棕果实油脂不断积累，同时糖逐渐减少（梁远学等，2012;殷振华等，2016），且内含物变化与椰枣差异巨大，油棕光合作用将二氧化碳主要合成为油脂，而椰枣则主要合成为糖（Bourgis et al.，2011），说明油棕果实有其独特的内含物积累特征。另外，油棕果实中含有约15.68%的坚硬种壳（Shi et al.，2019）和木质纤维，木质素沉积可通过染色法观察（史梦雅等，2013;孟泽等，2016），木质素由光合作用产物合成而来（张旭等，2019），而木质素及其相关酶活性与植物的生长发育、抗逆性密切相关（李朝英等，2019），也可能会影响其他内含物含量。目前，关于油棕叶片内含物和抗氧化酶活性的报道，倪书邦等（2012）研究了西双版纳引进的油棕新品种的抗寒性及抗氧化系统，表明低温胁迫下可诱导引发保护酶活性，以消除部分低温下产生的超氧阴离子自由基，从而减轻低温对膜的损伤。刘艳菊等（2015）研究表明低温对油棕幼苗有明显的氧化损伤，但一定程度上可能会增加可溶性蛋白质和可溶性糖等内含物含量以及过氧化氢（H2O2）含量和苹果酸脱氢酶（MDH）活性。【本研究切入点】前人报道了油棕果实内含物积累规律及低温胁迫对抗氧化酶系统的影响等，但尚未见关于油棕果实内含物积累与抗氧化酶间关系的研究报道。【拟解决的关键问题】在油棕果实不同发育时期观察木质素沉积和油脂积累情况，分析超氧化物歧化酶（SOD）、MDH、谷胱甘肽还原酶（GR）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性及H2O2含量变化规律，探究上述内含物和抗氧化酶活性间关系及抗氧化酶对果实生长发育的保护等，为油棕果实生长发育调控提供依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
试验材料为9年生薄壳种油棕树，于2019年8月取自中国热带农业科学院椰子研究所的国家热带棕榈种质资源圃（油棕分区）。在油棕雌花授粉后，分别选雌蕊（0M）及授粉1～5个月后（1M、2M、3M、4M、5M）的油棕果实为材料。
主要试剂：正己烷（西陇化工，分析纯），间苯三酚（上海源叶JP340005-10 g），苏丹Ⅲ（索莱宝S8460-5 g），油红O-异丙醇饱和液（上海源叶R20641-100 mL），包埋剂（樱花OCT）。试剂盒：蛋白定量测定试剂盒（南京建成100T/96样），总糖含量测定试剂盒（南京建成50T/48样），总超氧化物歧化酶（T-SOD）测定试剂盒（南京建成100T/96样），POD测定试剂盒（南京建成100T/48样），CAT测定试剂盒（南京建成100T/96样），MDH测定试剂盒（南京建成50T/48样），H2O2测定试剂盒（南京建成50T/48样）。其他常用化学试剂均为试剂纯。仪器设备：数显游标卡尺（桂林广陆SF2000），粗脂肪测定仪（上海精科JK-CFD-6F），电子天平（上海民桥SL502），台式高速冷冻离心机（上海天美CT18RT），紫外可见光光度计（上海精科752N），冷冻切片机（Leica CM1900），普通光学显微镜（Leica DM2500），体视显微镜（Leica M50）。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 果实发育指标测量 随机选取4个雌蕊或果实，分别用电子天平称重、游标卡尺测量果实长度和宽度。
1. 2. 2 中果皮内含物含量和抗氧化酶活性测定
含油量参照石鹏等（2017）的方法测定;可溶性蛋白含量及SOD、POD和GR活性参照李东霞等（2019）的方法测定;测定总糖含量的操作步骤按照总糖含量检测试剂盒说明书进行;CAT、MDH、H2O2活性或含量分别按照试剂盒说明书的步骤进行测定。测定此部分生理指标时，每个样品均3次重复。 1. 2. 3 果实木质素沉积和油脂积累观察 间苯三酚染液配制：称取0.1 g间苯三酚，加入100 mL的14%盐酸乙醇溶液中;苏丹Ⅲ染液配制：称取0.1 g苏丹Ⅲ，加20 mL的95%乙醇。剪开雌蕊或果实，用间苯三酚染液染色2 h后在体视显微镜下观察，粉红色或深红色表示有木质素沉积。设置箱体内温度 -24 ℃，速冻台温度-20 ℃，标本头-11 ℃，用冷冻切片机切取10 μm切片（张大鹏等，2018），苏丹Ⅲ染液染色20 min后，用ddH2O冲洗后在显微镜下观察，橘黄色表示有油脂积累。冷冻切片使用油红O染液染色后2 min，ddH2O冲洗后在显微镜下观察，红色表示有油脂积累。
1. 3 统计分析
试验数据用Excel 2007进行整理及制图;使用OriginPro 2018进行相关性、方差分析和多重比较分析，采用Fisher LSD比较均值，采用Levene进行方差齐性检验。
2 结果与分析
2. 1 油棕果实生长发育过程中果重和大小的变化情况
在油棕果实生长发育过程中，油棕的果长、果宽和果重随着果实的发育程度逐渐增长（图1和图2）。0M～2M时期，油棕果长和果宽增长缓慢，2M～4M时期，果实大小迅速增长，月均果长和果宽增长量分别高达7.50和5.94 mm。果实快要成熟前（4M～5M）基本停止增长，果实宽度增加较少。油棕果重的增长趋势与果长和果宽类似，0M～2M时果重增长速度缓慢，2M～5M油棕果实重量迅速增长，月均增长量高达3.99 g。由此可知，油棕果实快速生长期主要集中在2M～4M时期。
2. 2 油棕果实木质素沉积和油脂变化规律
如图3所示，木质素随着油棕果实生长发育不断增多，0M时期雌蕊少见木质素，1M～5M时期在中果皮可见木质素，从2M时期开始在果实中部内果皮部位可见木质素环，5M时期内果皮发育成黑色的种壳，大量木质素密集分布在种壳周围。
如图4和图5所示，分别用苏丹Ⅲ和油红O对中果皮和胚乳染色，均发现中果皮在0M～4M时期少有油脂积累，5M时期油脂积累明显增多，说明4M～5M时期是油脂快速积累的时期。胚乳在4M早期以前主要以液态形式存在，液体胚乳无法切片观察，4M～5M时期油脂积累明显增多。另外，中果皮细胞大多呈椭圆形或长条形，胚乳细胞大多呈长方形且排列整齐。
2. 3 中果皮内含物含量变化规律
如图6所示，随着油棕果实的发育，油棕中果皮的含油量逐渐增加，总糖含量逐渐降低，可溶性蛋白含量表现出先升高后降低的变化趋势。油棕雌花授粉后几乎没有含油量，果实发育到1M时期果皮才有油脂积累;4M～5M时期是中果皮油脂快速积累时期，5M时期果皮含油量达最高值，为46.02%，与其他发育时期中果皮含油量差异极显著（P<0.01，下同）。雌花授粉后油棕中果皮的总糖含量最多，为92.69 mg/g，与其他发育时期总糖含量差异极显著;1M～3M时期总糖含量差异不显著（P>0.05，下同）;总糖含量在4M时期最低，为26.21 mg/g，5M时期又开始上升。在0M～1M时期，油棕中果皮的可溶性蛋白含量迅速增加，而1M时期之后可溶性蛋白含量又逐渐降低;各发育时期的可溶性蛋白含量变化差异较大，1M～3M时期油棕中果皮的可溶性蛋白含量相对较高，其中1M时期的可溶性蛋白含量最高，为0.66 g/L，5M时期的可溶性蛋白含量较低，仅0.18 g/L。
2. 4 中果皮抗氧化酶活性变化规律
2. 4. 1 中果皮H2O2含量变化规律 如图7-A所示，油棕中果皮发育过程中，H2O2含量除0M时期外均保持较低水平。0M时期油棕中果皮的H2O2含量最多，为1582.44 mmol/g prot，与其他果实发育时期果肉中H2O2含量存在极显著差异;而在1M～5M时期，油棕中果皮的H2O2含量变化差异不显著，其变化呈先上升后下降的变化趋势，其中，1M时期的H2O2含量最少，仅85.70 mmol/g prot。
2. 4. 2 中果皮SOD活性变化规律 如图7-B所示，中果皮总SOD活性呈先下降后上升的变化趋势。0M时期油棕中果皮的总SOD活性最强，为589.43 U/mg prot，与1M～3M时期总SOD活性变化差异极显著;1M时，总SOD活性下降至最低值（163.91 U/mg prot），2M时期有所提高，而后到3M时期又下降;4M和5M果实成熟时总SOD活性回升至494.27和572.15 U/mg prot，与0M的总SOD活性变化差异不显著。
2. 4. 3 中果皮MDH活性变化规律 如图7-C所示，中果皮MDH活性呈先上升后下降的变化趋势。4M时期油棕中果皮的MDH活性最高，为4.71 U/mg prot，与其他发育时期的MDH活性变化差异显著（P<0.05，下同）;0M时期的MDH活性最低，为0.19 U/mg prot，1M～3M时期MDH活性有所增长，4M时期达最高值，5M时期MDH活性又降至3.47 U/mg prot。
2. 4. 4 中果皮GR活性变化规律 如图7-D所示，中果皮GR活性也呈先上升后下降的变化趋势。从0M～1M时期，油棕中果皮的GR活性从0.0033 U/g prot上升至0.0051 U/g prot，1M時期GR活性达最高值，与其他发育时期的GR活性变化差异显著;1M后GR活性开始下降，5M时期GR活性达最低值，仅为0.0004 U/g prot。
2. 4. 5 中果皮CAT活性变化规律 如图7-E所示，中果皮CAT活性处于波动变化状态。油棕中果皮的CAT活性在4M时期达最高值，为59.72 U/mg prot，与其他发育时期CAT活性变化差异显著;0M时期CAT活性最低，为7.70 U/mg prot，之后CAT活性上升至2M时期的39.00 U/mg prot;3M时期的CAT活性又有所下降，而3M过后CAT活性急剧上升，到4M时期CAT活性上升至最高，然而5M后又下降至18.57 U/mg prot。 2. 4. 6 中果皮POD活性变化规律 如图7-F所示，中果皮POD活性呈先下降后上升的变化趋势。0M时期油棕中果皮的POD活性为199.70 U/mg prot，0M～1M时期POD活性开始下降到1M时POD活性达到最低，为93.14 U/mg prot，1M后POD活性逐渐增加，到5M时POD活性达最高，为287.94 U/mg prot，与其他发育时期的POD活性变化差异极显著。
2. 5 油棕中果皮内含物、抗氧化酶活性及果实性状相关分析
油棕果实生长发育与中果皮内含物含量和抗氧化酶活性之间存在相关性，内含物含量和抗氧化酶活性随果实生长发育变化。由表1可知，油棕中果皮总糖含量与H2O2含量呈极显著正相关，可溶性蛋白含量与SOD活性呈极显著负相关，果实重量与果实大小（即果长和果宽）呈极显著正相关。油棕中果皮可溶性蛋白含量与POD活性呈显著负相关，POD活性与含油量和SOD活性均呈显著正相关。油棕中果皮含油量与果实重量呈显著正相关，油棕果宽与果长呈极显著正相关，油棕果皮MDH活性和GR活性分别与果实重量和大小呈显著正相关和负相关。
3 讨论
果实发育前期（0M～3M）油棕中果皮的总糖和蛋白质含量较多，含油量很少，而果实成熟时期（4M～5M）则相反，含油量多，总糖和蛋白质含量少，与Bourgis等（2011）的研究结果一致。其原因可能是在油棕果实生长发育初期代谢旺盛，果实的生长发育所需的能量主要由糖类提供，蛋白质催化油棕果实生长发育的代谢反应。当果实成熟时，果实中的糖类和蛋白质可能转化为油脂或木质素。胚乳中的油脂主要储存能量，供种子下一步萌发用，而中果皮的油脂用来吸引动物吃油棕果实，从而帮助传播油棕种子，增大种子传播的范围。果皮中的木质素则用于保护种子，免受外部恶劣环境破坏。油棕果实木质素从1M～5M逐渐增加，与此时期的POD和SOD活性变化趋势一致，POD和SOD可能与木质素含量增加有关（邱志浩等，2019）
油棕果实发育0M时，H2O2的含量最多，与油棕果实其他发育时期的H2O2含量变化存在极显著差异。可能是因为雌花授粉后，形成受精卵要发育成果实的过程中，细胞有氧呼吸和代谢旺盛，因此所产生的有氧代谢产物H2O2含量高（张炜，2016）。油棕果实发育初期GR活性强，而成熟期活性弱。其原因是GR主要存在于植物叶绿体基质中，油棕果实发育初期果实呈黑色，细胞中含有的叶绿体多，而成熟后的油棕果实呈橙红色，细胞中含有的叶绿体减少。果实发育初期，由于细胞代谢旺盛，产生的有氧代谢产物H2O2含量多（李静等，2020），因此抗氧化酶如SOD和POD活性也相应地增强。而在果实成熟期，MDH、CAT、POD和SOD抗氧化酶活性也增强的原因可能是为了减少细胞代谢，从而延缓细胞衰老（石瑞婷，2006）。内含物含量和抗氧化酶活性与果实生长发育指标之间存在一定的相关性，MDH活性与果实大小和重量呈显著正相关，而GR活性与果实大小和重量呈显著负相关，可作为判断果实生长发育的指标之一。另外，抗氧化酶活性的动态变化调控油棕果实生长发育，保护果实细胞膜系统免受过量ROS的破坏（王小玲等，2019）。
4 结论
油棕果实发育过程中，早期高含量的糖和蛋白质为后期油脂和木质素积累打下基础，其中MDH和GR活性可作为判断果实生长发育状况的指标之一。
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（责任编辑 邓慧灵）