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建立了同时测定牛奶中粘杆菌素和多粘菌素B素残留量的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的方法。样品通过5%高氯酸溶液沉淀蛋白，经乙醚除脂，Strata-X固相萃取柱净化，浓缩后经LC-MS/MS电喷雾正离子多反应检测模式(ESI+MRM)检测。结果显示，粘杆菌素和多粘菌素B在25~1000 ng/mL范围内均具有良好的线性关系，相关系数不低于0.9972，加标回收率为71.5%~98.1%，相对标准偏差为3.8%~9.5%。试验证明该方法前处理简单，快速，稳定性好，适用于大量样品中粘菌素和多粘菌素B残留的同时检测。