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[摘要]目的探讨成纤维生长因子受体（hbroblast growth factor receptor，FGFR-1）及细胞周期蛋白D1（cyclinD1）在乳腺癌组织中的表达及其临床意义。方法应用原位杂交及免疫组织化学S-P法检测乳腺癌、乳腺纤维腺瘤和正常乳腺组织中FGFR-1、cyclinD1 mRNA及蛋白水平的表达。结果在乳腺癌中，FGFR-1蛋白和FGFR-1基因的阳性率分别为70.0%（21/30）、70.0%（21/30），cyclinD1蛋白和cyclinD1基因的阳性率分别为66.7%（20/30）、76.7%（23/30），明显高于纤维腺瘤与正常乳腺组织（P<0.05），FGFR-1表达与cyclinD1表达一致。结论FGFR-1的过表达在人类乳腺癌的发生、发展中起重要作用，其机制可能通过上调cyclinD1的表达发挥作用，FGFR-1、cyclinD1的过度表达可作为判断乳腺癌预后的重要指标。
[关键词]FGFR-1；cyclin D1；乳腺癌；免疫组化；原位杂交
[中图分类号]R737.9 [文献标识码]A [文章编号]1673-9701（2016）04-0001-04
成纤维细胞生长因子受体（FGFR）是由糖蛋白的胞外免疫球蛋白（Ig）样结构域、疏水跨膜区和含有酪氨酸激酶结构域的细胞质部分组成。研究发现FGFR-1、FGFR-2基因表达于许多肿瘤细胞，与患者的预后密切相关。在甲状腺癌、结直肠癌、胃癌等肿瘤中均可见FGFR-1的高表达。
细胞周期蛋白（cyclin）对细胞周期进行正调控，与细胞生长、发育及肿瘤的发生关系极其密切。研究发现：在原发陸乳腺肿瘤中，cyclinD1和FGFR-1的共同扩增与患者存活显著减少相关，表明这两种蛋白之间存在相互作用。然而目前FGFR-1在乳腺癌中的表达及其高表达是如何促进肿瘤细胞增殖、与cy-clinDl的关系如何，国内尚无报道。本文采用原位杂交及免疫组织化学技术，对30例乳腺癌组织中cy-clinD1和FGFR-1的mRNA及蛋白表达进行研究。现报道如下.
1资料与方法
1.1一般资料
收集我院2007年3月～2014年8月手术切除的乳腺纤维腺瘤患者15例、乳腺癌患者30例。所有标本术前均未进行放化疗，术后病理诊断为乳腺癌、纤维腺瘤。另取15例癌旁正常乳腺组织作对照。患者年龄35～63岁，平均（46.0±3.2）岁，乳腺癌组伴有淋巴结转移18例，无淋巴结转移者12例。30例乳腺癌标本中，获得满5年随访者24例，其中已死亡病例6例，尚生存病例18例。
1.2实验仪器和试剂
（1）主要仪器：莱卡DM-3000显微镜、莱卡切片机RM2235、莱卡脱水机ASP300S等。
（2）主要试剂：FGFR-1、cyclinD1免疫组化和mR-NA原位杂交试剂盒，均购自武汉博士德。
1.3方法
分别采用免疫组化和原位杂交法检测FGFR-1、cyclinD1蛋白和mRNA的表达，免疫组化及原位杂交染色具体操作方法参照文献并严格按照试剂盒说明进行。用已知阳性片作阳性对照，用磷酸盐缓冲液分别代替一抗作阴性对照。
1.4结果判断
FGFR-1、cyclinD1 mRNA阳性表达定位于细胞膜或细胞质，cyclinD1免疫组化阳性表达定位于细胞核，综合染色强度和阳性肿瘤细胞的百分比进行分级。将染色强度分为：无着色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。将阳性肿瘤细胞的百分比分为：<10%为0分，10%～50%为1分，51%～75%为2分，>75%为3分。两项相加后分阴性（-）和阳性（ ）：0～1分为（-），2分以上为（ ）。
1.5统计学分析
采用SPSS19.0统计学分析软件，计数资料采用x2检验法和Fisher确切概率法，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 cychn D1、FGFR-1 mRNA在各组中的表达
2.1.1 Cyclin D1在各组中的表达cyclin D1 mRNA在30例乳腺癌中有23例呈阳性表达（图1），正常对照组、纤维腺瘤组、乳腺癌组逐步增高，阳性率分别为20.0%（3/15）、33.3%（5/15）、76.7%（23/30），纤维腺瘤组与对照组差异无统计学意义（P>0.05）；乳腺癌组与纤维腺瘤组及对照组之间，差异均有统计学意义（P<0.05）（表1）。
2.1.2 FGFR-1 mRNA在各组中的表达FGFR-1 mR-NA在30例乳腺癌中有21例呈阳性表达（图2），正常对照组、纤维腺瘤组、乳腺癌组逐步增高，阳性率分别为13.3%（2/15）、20.0%（3/15）、70.0%（21/30），纤维腺瘤组与对照组差异无统计学意义（P>0.05）；乳腺癌组与纤维腺瘤组及对照组之间，差异均有统计学意义（P<0.05）（表1）。
2.2 cyclin D1、FGFR-1蛋白在各组中的表达
2.2.1 cyclin D1蛋白在各组中的表达cyclin D1蛋白在30例乳腺癌中有20例呈阳性表达（图3），正常对照组、纤维腺瘤组、乳腺癌组逐步增高，阳性率分别为26.7%（4/15）、33.3%（5/15）、66.7%（20/30），纤维腺瘤组与对照组差异无统计学意义（P>0.05）；乳腺癌组与纤维腺瘤组及对照组之间，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。
2.2.2 FGFR-1蛋白在各组中的表达FGFR-1蛋白在30例乳腺癌中有21例呈阳性表达（图4），正常对照组、纤维腺瘤组、乳腺癌组逐步增高，阳性率分别为6.7%（1/15）、26.7%（4/15）、70.0%（21/30），纤维腺瘤组与对照组差异无统计学意义（P>0.05）；乳腺癌组与纤维腺瘤组及对照组之间，差异有统计学意义（P<0.05）（见表2）。 3讨论
乳腺癌在染色体8p11-8p12和11q12-11q14的共扩增时常发生，表明在肿瘤形成过程中这些区域的基因之间可能存在合作。FGFR-1所在的染色体区域8p11.2，在肾癌、肺癌、前列腺癌中均扩增。多项研究已经证实FGFR-1在乳腺癌中扩增（8p11.2～p12扩增），FGFR-1和FGFR-2均为受体型酪氨酸激酶，主要分布于细胞膜表面。在细胞表面酪氨酸激酶受体呈单二聚体形式，在受体内的蛋白具有酪氨酸激酶活性。当FGFR与特异的酪氨酸激酶受体结合后，会导致形成稳定的二聚体，随后其下游信号通路的受体自身磷酸化和活化，导致细胞增殖调节发生紊乱，激活细胞内多种信号通路，从而导致癌的发生，与本研究一致，乳腺癌组织中FGFR-1蛋白的表达明显增高，显著高于正常乳腺组织和良性乳腺腺瘤组织，差异具有统计学意义（P<0.05）。
cyclinD1又名CCND1，定位于11q13区，即原癌基因，根据大量研究结果显示：多种人类肿瘤存在11q13区扩增现象，而cyclinD1位于该区中间部位。cyclin D1转基因鼠引起乳腺增生和乳腺上皮肿瘤，乳腺癌组织中cyclin D1的高表达将使肿瘤细胞增殖，从而使得肿瘤持续生长。本研究发现乳腺癌组织中cyclin D1蛋白的表达明显增高，显著高于正常乳腺组织和良性乳腺腺瘤组织，差异具有统计学意义（P<0.05）。Etsu等体外实验研究中发现：FGFR-1表达增加通过cyclin D1过表达激活pRB/E2F通路而参与乳腺癌的发生，首次提出cyclin D1/pRB/E2F通路参与调节成纤维生长因子受体的表达。有学者指出cyclin D/cdk4复合物可使FGFR的795号丝氨酸pRB激活磷酸化，使用FGFR抑制剂后，位于795号染色体的丝氨酸pRB磷酸化减弱.cyclin D/cdk4复合物活性被抑制。异位cyclin D1表达能够拮抗FGFR-1抑制剂的抗增殖作用，与本实验结果一致，因此本实验指出：FGFR-1介导的信号可能通过细胞周期蛋白D的调节连接于细胞周期，调控pRB磷酸化参与肿瘤发生、发展。为了增加实验的科学性和严谨性，本实验还采用原位杂交方法，检测各组cyclin D、FGFR-1的mRNA表达水平，结果显示两种因子表达呈一致性，进一步说明FGFR-1在转录和翻译水平对cyclinD1进行调节。我们的研究结果提供证据表明：FGFR-1扩增是高度增生乳腺癌的驱动力之一，为乳腺癌新的治疗靶点提供了理论依据，FGFR-1抑制剂可能是有效的治疗药，不仅能抑制血管的生成，而且还抑制乳腺癌的生长。
[关键词]FGFR-1；cyclin D1；乳腺癌；免疫组化；原位杂交
[中图分类号]R737.9 [文献标识码]A [文章编号]1673-9701（2016）04-0001-04
成纤维细胞生长因子受体（FGFR）是由糖蛋白的胞外免疫球蛋白（Ig）样结构域、疏水跨膜区和含有酪氨酸激酶结构域的细胞质部分组成。研究发现FGFR-1、FGFR-2基因表达于许多肿瘤细胞，与患者的预后密切相关。在甲状腺癌、结直肠癌、胃癌等肿瘤中均可见FGFR-1的高表达。
细胞周期蛋白（cyclin）对细胞周期进行正调控，与细胞生长、发育及肿瘤的发生关系极其密切。研究发现：在原发陸乳腺肿瘤中，cyclinD1和FGFR-1的共同扩增与患者存活显著减少相关，表明这两种蛋白之间存在相互作用。然而目前FGFR-1在乳腺癌中的表达及其高表达是如何促进肿瘤细胞增殖、与cy-clinDl的关系如何，国内尚无报道。本文采用原位杂交及免疫组织化学技术，对30例乳腺癌组织中cy-clinD1和FGFR-1的mRNA及蛋白表达进行研究。现报道如下.
1资料与方法
1.1一般资料
收集我院2007年3月～2014年8月手术切除的乳腺纤维腺瘤患者15例、乳腺癌患者30例。所有标本术前均未进行放化疗，术后病理诊断为乳腺癌、纤维腺瘤。另取15例癌旁正常乳腺组织作对照。患者年龄35～63岁，平均（46.0±3.2）岁，乳腺癌组伴有淋巴结转移18例，无淋巴结转移者12例。30例乳腺癌标本中，获得满5年随访者24例，其中已死亡病例6例，尚生存病例18例。
1.2实验仪器和试剂
（1）主要仪器：莱卡DM-3000显微镜、莱卡切片机RM2235、莱卡脱水机ASP300S等。
（2）主要试剂：FGFR-1、cyclinD1免疫组化和mR-NA原位杂交试剂盒，均购自武汉博士德。
1.3方法
分别采用免疫组化和原位杂交法检测FGFR-1、cyclinD1蛋白和mRNA的表达，免疫组化及原位杂交染色具体操作方法参照文献并严格按照试剂盒说明进行。用已知阳性片作阳性对照，用磷酸盐缓冲液分别代替一抗作阴性对照。
1.4结果判断
FGFR-1、cyclinD1 mRNA阳性表达定位于细胞膜或细胞质，cyclinD1免疫组化阳性表达定位于细胞核，综合染色强度和阳性肿瘤细胞的百分比进行分级。将染色强度分为：无着色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。将阳性肿瘤细胞的百分比分为：<10%为0分，10%～50%为1分，51%～75%为2分，>75%为3分。两项相加后分阴性（-）和阳性（ ）：0～1分为（-），2分以上为（ ）。
1.5统计学分析
采用SPSS19.0统计学分析软件，计数资料采用x2检验法和Fisher确切概率法，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 cychn D1、FGFR-1 mRNA在各组中的表达
2.1.1 Cyclin D1在各组中的表达cyclin D1 mRNA在30例乳腺癌中有23例呈阳性表达（图1），正常对照组、纤维腺瘤组、乳腺癌组逐步增高，阳性率分别为20.0%（3/15）、33.3%（5/15）、76.7%（23/30），纤维腺瘤组与对照组差异无统计学意义（P>0.05）；乳腺癌组与纤维腺瘤组及对照组之间，差异均有统计学意义（P<0.05）（表1）。
2.1.2 FGFR-1 mRNA在各组中的表达FGFR-1 mR-NA在30例乳腺癌中有21例呈阳性表达（图2），正常对照组、纤维腺瘤组、乳腺癌组逐步增高，阳性率分别为13.3%（2/15）、20.0%（3/15）、70.0%（21/30），纤维腺瘤组与对照组差异无统计学意义（P>0.05）；乳腺癌组与纤维腺瘤组及对照组之间，差异均有统计学意义（P<0.05）（表1）。
2.2 cyclin D1、FGFR-1蛋白在各组中的表达
2.2.1 cyclin D1蛋白在各组中的表达cyclin D1蛋白在30例乳腺癌中有20例呈阳性表达（图3），正常对照组、纤维腺瘤组、乳腺癌组逐步增高，阳性率分别为26.7%（4/15）、33.3%（5/15）、66.7%（20/30），纤维腺瘤组与对照组差异无统计学意义（P>0.05）；乳腺癌组与纤维腺瘤组及对照组之间，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。
2.2.2 FGFR-1蛋白在各组中的表达FGFR-1蛋白在30例乳腺癌中有21例呈阳性表达（图4），正常对照组、纤维腺瘤组、乳腺癌组逐步增高，阳性率分别为6.7%（1/15）、26.7%（4/15）、70.0%（21/30），纤维腺瘤组与对照组差异无统计学意义（P>0.05）；乳腺癌组与纤维腺瘤组及对照组之间，差异有统计学意义（P<0.05）（见表2）。 3讨论
乳腺癌在染色体8p11-8p12和11q12-11q14的共扩增时常发生，表明在肿瘤形成过程中这些区域的基因之间可能存在合作。FGFR-1所在的染色体区域8p11.2，在肾癌、肺癌、前列腺癌中均扩增。多项研究已经证实FGFR-1在乳腺癌中扩增（8p11.2～p12扩增），FGFR-1和FGFR-2均为受体型酪氨酸激酶，主要分布于细胞膜表面。在细胞表面酪氨酸激酶受体呈单二聚体形式，在受体内的蛋白具有酪氨酸激酶活性。当FGFR与特异的酪氨酸激酶受体结合后，会导致形成稳定的二聚体，随后其下游信号通路的受体自身磷酸化和活化，导致细胞增殖调节发生紊乱，激活细胞内多种信号通路，从而导致癌的发生，与本研究一致，乳腺癌组织中FGFR-1蛋白的表达明显增高，显著高于正常乳腺组织和良性乳腺腺瘤组织，差异具有统计学意义（P<0.05）。
cyclinD1又名CCND1，定位于11q13区，即原癌基因，根据大量研究结果显示：多种人类肿瘤存在11q13区扩增现象，而cyclinD1位于该区中间部位。cyclin D1转基因鼠引起乳腺增生和乳腺上皮肿瘤，乳腺癌组织中cyclin D1的高表达将使肿瘤细胞增殖，从而使得肿瘤持续生长。本研究发现乳腺癌组织中cyclin D1蛋白的表达明显增高，显著高于正常乳腺组织和良性乳腺腺瘤组织，差异具有统计学意义（P<0.05）。Etsu等体外实验研究中发现：FGFR-1表达增加通过cyclin D1过表达激活pRB/E2F通路而参与乳腺癌的发生，首次提出cyclin D1/pRB/E2F通路参与调节成纤维生长因子受体的表达。有学者指出cyclin D/cdk4复合物可使FGFR的795号丝氨酸pRB激活磷酸化，使用FGFR抑制剂后，位于795号染色体的丝氨酸pRB磷酸化减弱.cyclin D/cdk4复合物活性被抑制。异位cyclin D1表达能够拮抗FGFR-1抑制剂的抗增殖作用，与本实验结果一致，因此本实验指出：FGFR-1介导的信号可能通过细胞周期蛋白D的调节连接于细胞周期，调控pRB磷酸化参与肿瘤发生、发展。为了增加实验的科学性和严谨性，本实验还采用原位杂交方法，检测各组cyclin D、FGFR-1的mRNA表达水平，结果显示两种因子表达呈一致性，进一步说明FGFR-1在转录和翻译水平对cyclinD1进行调节。我们的研究结果提供证据表明：FGFR-1扩增是高度增生乳腺癌的驱动力之一，为乳腺癌新的治疗靶点提供了理论依据，FGFR-1抑制剂可能是有效的治疗药，不仅能抑制血管的生成，而且还抑制乳腺癌的生长。