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摘要目的 探讨落新妇甙对心脏移植排斥反应中诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）表达的影响。方法 采用小鼠颈部心脏移植模型,随机分为3组：对照组，移植组， 落新妇甙组。于术后第5天取移植心脏，用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法观察iNOS 的表达情况。结果移植组iNOS 表达明显升高（与对照组相比，P<0.01）。落新妇甙组iNOS 表达明显降低（与移植组相比，P<0.01）。结论落新妇甙对心脏移植排斥反应的免疫抑制作用可能与其抑制iNOS 的表达有关。
关键词心脏移植 新妇甙 斥反应 NOS
文章编号1008-5807（2011）05-096-03
心脏移植已成为终末期心脏疾病的有效治疗手段，但急性移植排斥反应仍然是影响心脏移植手术能否成功及受体长期存活的关键。随着移植免疫的发展,对排斥反应认识的逐渐深入,目前认为一氧化氮(nitric oxide, NO)在心脏移植排斥反应中起重要作用。心脏移植急性排斥反应时,移植物周围浸润的活化T细胞大量表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS）并与急性排斥反应的严重程度呈正相关。落新妇甙是一种从传统中药土茯苓中提取的黄酮类化合物，能有效抑制心脏移植排斥反应并选择性诱导移植排斥反应中活化T细胞凋亡。落新妇甙使排斥反应中活化T细胞凋亡时，对iNOS的表达有无影响，目前尚未见报道。本研究拟通过小鼠颈部心脏移植模型, 探讨落新妇甙对心脏移植排斥反应中iNOS表达的影响。
一、材料与方法
（一）实验动物分组与模型
健康雄性BALB/C小鼠32只和C57小鼠64只，体重20～25g，2～3月龄，由同济医学院器官移植研究所提供。随机分为3组:(1) 对照组: 供、受体各16只，供、受体均为C57小鼠，行颈部心脏移植，移植后每天用生理盐水1ml 灌胃。(2)移植组: 供、受体各16只，供、受体分别为BALB/C、C57小鼠，行颈部心脏移植，移植后每天用生理盐水1ml 灌胃。 (3)落新妇甙组: 供、受体各16只，供、受体分别为BALB/C、C57小鼠，行颈部心脏移植，移植后每天用落新妇甙5mg/kg 灌胃。小鼠的颈部心脏移植模型是笔者根据Chen术式进行改进与简化，将供心主动脉与受者颈总动脉行端侧连续吻合,吻合完成后,接着进行供心主肺动脉与受者颈外静脉行端端连续吻合。
（二）指标检测
于移植术后第5天处死小鼠,取移植心脏，切取左室壁组织，置于液氮中冻存，逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR） 法检测iNOS mRNA水平变化。iNOS引物由上海生物工程公司合成，引物序列及扩增片段如下：iNOS 正义链 5’TGCATCAATAACCTGAACCGAGCA 3’, 反义链 5’GCACCTTCGAATTTGCCCATTGATC 3’, 扩增片段 638bp.€%[-Actin 正义链 5’GCCATCCTGCGTCTGGACCTG 3’，反义链 5’CATTTGCGGTGCACGATGGAG 3’，扩增片段 815bp. 以€%[-Actin 为内参照。 反应完成后取PCR产物在2% 琼脂糖凝胶中电泳，电泳完毕后在紫外灯下照片。图像输入仪摄取产物DNA 和内参照DNA电泳条带图像，全自动图像分析系统转化为灰度值，产物DNA 和内参照DNA电泳条带图像灰度值比例即为样品mRNA相对含量。
（三）统计学处理
SPSS10.0统计分析软件包对数据进行处理。以Ｐ<0.05作为判断显著性差异的标准。
二、结果
PCR产物电泳及条带密度扫描显示，与对照组相比，移植组iNOS mRNA表达明显升高, (1.59€?.18 vs 0.31€?.08，P<0.01)；与移植组相比，落新妇甙组iNOSmRNA表达明显降低 (0.33€?.04 vs1.59€?.18, P<0.01)。（图1）。
三、讨论
本研究结果显示，心脏移植急性排斥反应时，iNOS 的表达明显升高，这与国内外报道基本一致。我们的研究还发现落新妇甙能显著抑制心脏移植排斥反应中iNOS 的表达，提示落新妇甙通过降低一氧化氮的合成，预防了一氧化氮的细胞毒性作用，从而保护了移植心脏。
一氧化氮是体内多种组织或细胞产生的免疫调节分子,目前研究发现其与移植器官排斥反应关系密切,在排斥反应过程中, 一氧化氮的合成与释放发生了改变,并影响着器官移植的成功。一氧化氮作为人体内一种生物学活性分子,有两种来源。一种是非酶生(non-enzymistigense),来自体表或摄入的无机氮的化学降解或转化，此来源只占极少部分；另一种是酶生(enzymistigense),由一氧化氮合酶(NOS)所催化生成，此来源只占绝大部分。作为一氧化氮生成过程中关键酶的NOS以三种形式存在：内皮型NOS（eNOS）、诱导型NOS（ iNOS）和神经元型NOS（ nNOS）。正常心脏中内皮细胞和心肌细胞主要以eNOS形式存在，nNOS极为稀少。nNOS基因定位于第12对常染色体,主要存在于脑和神经细胞的细胞质内,故又称为脑型或神经型(nNOS)。eNOS基因定位于第7对常染色体上,主要存在于血管内皮细胞的细胞膜上,故称为内皮型(eNOS)，两者统称为构成型(constitutive NOS, cNOS),其活性为钙和钙调蛋白依赖的,其合成的一氧化氮寿命极短(几秒到几分钟)。而iNOS基因定位于第17对常染色体上,存在于各种类型的细胞中,包括巨噬细胞、软骨细脑、中性粒细胞,为非钙依赖性的,只在细胞受到刺激被激活后才表达,生成的一氧化氮能持续相对较长时间(几小时到几天) 。
生理情况下内皮细胞通过eNOS短暂合成少量NO，具有重要作用：NO弥散于平滑肌细胞通过cGMP 途径松弛血管；进入血流抑制血小板及白细胞的活化、粘附、聚集；通过直接抑制中性粒细胞的呼吸爆发减少氧自由基的产生，从而对心肌起保护作用。但当外界条件如Th1型炎性细胞因子TNF-€%Z、IFN-€%等刺激移植物浸润T淋巴细胞时，缓慢持久产生大量的具有细胞毒性的NO，并且与氧反应生成新的氧自由基，最终导致心肌细胞坏死以及心室功能衰竭。
越来越多的研究表明, iNOS在器官移植排斥反应中发挥重要作用，多种免疫细胞包括巨噬细胞、活化的T淋巴细胞等都能表达iNOS。器官移植排斥反应中产生的一些细胞因子如白细胞介素-1€%[(IL-1€%[),肿瘤坏死因子€%Z(TNF-€%Z),白细胞介素-2(IL-2)等激活T淋巴细胞等免疫细胞,表达大量iNOS ,进而催化L-精氨酸(L-Arg)生成大量的NO。其中TNF-€%Z是诱导iNOS 合成的重要因子, TNF-€%Z开始表达多出现在移植后第3天,与iNOS 在多在移植后第4天表达相一致。
最近有研究报道在器官移植后的不同时间NO的生成量和作用并不相同。NO一般在移植后第4天出现,在第8天开始下降。NOS表达下调原因还不清楚,可能与急性排斥反应的晚期凝血及巨噬细胞浸润下降有关。在移植后的较短时间内, NO主要由eNOS合成，量较少，表达短暂，对移植物起到积极的保护作用。其机制可能包括:抑制平滑肌细胞的增殖,迁移；抑制血小板、白细胞等粘附分子表达,保持内皮完整性；通过cGMP途径抑制血小板粘附聚集；抑制白细胞的粘附和趋化反应,阻断炎症的级联反应；保持血管的基础张力,减少痉挛,维护血管舒张状态,这对于保持血管通畅很重要；阻止细胞因子和脂多糖所引起的细胞凋亡,保护内皮细胞。但在移植后第4～5天，iNOS开始表达，缓慢持久生成大量的NO，此时则通过作用于巰基、金属基团,干扰能量代谢和DNA合成,抑制多种蛋白质功能,使超氧化物岐化酶失活和直接损伤DNA等途径,对移植物造成明显的损害。
落新妇甙是一种从传统中药土茯苓中提取的黄酮类化合物，能选择性地杀伤活化的T细胞,其途经可能是促进活化的T细胞凋亡。我们最近的研究发现落新妇甙能有效抑制心脏移植排斥反应，诱导心脏移植排斥反应中活化的T细胞凋亡，其机制可能与落新妇甙上调同种反应性T细胞Bax、Fas、FasL 和caspase-3 的表达，降低Bcl-2表达等有关。本研究还发现落新妇甙能显著抑制心脏移植排斥反应中iNOS的表达，说明落新妇甙在诱导心脏移植排斥反应中活化T细胞凋亡时，还可通过抑制iNOS的表达，防止NO的大量产生，减少NO的细胞毒作用，从而对移植心脏起保护作用。关于落新妇甙抑制心脏移植排斥反应中iNOS表达的具体机制有待进一步研究。
参考文献：
[1]Pieper GM, Cooper M, Johnson CP, et al. Reduction of myocardial nitrosyl complex formation by a nitric oxide scavenger prolongs cardiac allograft survival. J Cardiovasc Pharmacol,2000,35(1):114-120.
[2]高思海，李 平，潘铁成等. 落新妇甙诱导小鼠心脏移植排斥反应活化T细胞凋亡中华实验外科杂志 2004,21(4):502.
[3]高思海, 李 平, 潘铁成等. 小鼠颈部异位心脏移植模型的改进第四军医大学学报2004，25（5）：397.
[4]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 分子克隆学 金冬雁 译北京：科学出版社，1998.343-407.
[5]Joshi MS, Lancaster JR Jr, et al. In situ measurement of nitric oxide production in cardiac isografts and rejecting allografts by an electrochemical method. Nitric Oxide ,2001 ,5(6):561-565.
[6]Inuzuka S, Koga S, Nishikido M, et al. Donor-specific blood transfusion prolongs cardiac allograft survival in rats by low nitric oxide production and elevated serum levels of prostaglandin E(2).Immunol Lett,2002 ,83(2):119-124.
[7]Pieper GM, Roza AM, Adams MB, et al. A ruthenium (III) polyaminocarboxylate complex, a novel nitric oxide scavenger, enhances graft survival and decreases nitrosylated heme protein in models of acute and delayed cardiac transplant rejection. J Cardiovasc Pharmacol, 2002 ,39(3):441-448.
[8]Wildhirt SM, Weis M, Schulze C, et al. Expression of endomyocardial nitric oxide synthase and coronary endothelial function in human cardiac allografts. Circulation 2001 ,104(12 Suppl 1):I 336-343.
[9]Wildhirt SM, Weis M, Schulze C, et al. Coronary flow reserve and nitric oxide synthases after cardiac transplantation in humans. Eur J Cardiothorac Surg, 2001 ,19(6):840-847.
[10]Wildhirt SM, Weis M, Schulze C, et al. An association between microvascular endothelial dysfunction, transcardiac nitric oxide production and pro-inflammatory cytokines after heart transplantation in humans. Transpl Int, 2000, 13 Suppl 1:S228-34.
[11]Qian Z, Gelzer-Bell R, Yang SX, et al. Inducible nitric oxide synthase inhibition of weibel-palade body release in cardiac transplant rejection. Circulation, 2001, 104(19):2369-2375.
[12]Skarsgard PL, Wang X, McDonald P, et al. Profound inhibition of myogenic tone in rat cardiac allografts is due to eNOS- and iNOS-based nitric oxide and an intrinsic defect in vascular smooth muscle contraction. Circulation, 2000, 101(11):1303-1310.
[13]Akizuki E, Akaike T, Okamoto S,et al.Role of nitric oxide and superoxide in acute cardiac allograft rejection in rats. Proc Soc Exp Biol Med, 2000, 225(2):151-159.
[14]Yan R, Xu Q. Astilbin selectively facilitates the apoptosis of interleukin-2-dependent phytohemagglutinin-activated jurkat cells. Pharmacol Res 2001;44(2):135-9.
[15]高思海，陳涛, 潘铁成. 落新妇甙对同种反应性T细胞Bax,Bcl-2和 caspase-3表达的影响 中华实用中西医杂志 2003,3(16):2110-2111.
[16]高思海，李 平, 潘铁成.落新妇甙对同种反应性T细胞Fas, FasL和TNF-R1和TNF-R2基因表达的调控中华实用中西医杂志 2004,4（17）：217-218.
关键词心脏移植 新妇甙 斥反应 NOS
文章编号1008-5807（2011）05-096-03
心脏移植已成为终末期心脏疾病的有效治疗手段，但急性移植排斥反应仍然是影响心脏移植手术能否成功及受体长期存活的关键。随着移植免疫的发展,对排斥反应认识的逐渐深入,目前认为一氧化氮(nitric oxide, NO)在心脏移植排斥反应中起重要作用。心脏移植急性排斥反应时,移植物周围浸润的活化T细胞大量表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS）并与急性排斥反应的严重程度呈正相关。落新妇甙是一种从传统中药土茯苓中提取的黄酮类化合物，能有效抑制心脏移植排斥反应并选择性诱导移植排斥反应中活化T细胞凋亡。落新妇甙使排斥反应中活化T细胞凋亡时，对iNOS的表达有无影响，目前尚未见报道。本研究拟通过小鼠颈部心脏移植模型, 探讨落新妇甙对心脏移植排斥反应中iNOS表达的影响。
一、材料与方法
（一）实验动物分组与模型
健康雄性BALB/C小鼠32只和C57小鼠64只，体重20～25g，2～3月龄，由同济医学院器官移植研究所提供。随机分为3组:(1) 对照组: 供、受体各16只，供、受体均为C57小鼠，行颈部心脏移植，移植后每天用生理盐水1ml 灌胃。(2)移植组: 供、受体各16只，供、受体分别为BALB/C、C57小鼠，行颈部心脏移植，移植后每天用生理盐水1ml 灌胃。 (3)落新妇甙组: 供、受体各16只，供、受体分别为BALB/C、C57小鼠，行颈部心脏移植，移植后每天用落新妇甙5mg/kg 灌胃。小鼠的颈部心脏移植模型是笔者根据Chen术式进行改进与简化，将供心主动脉与受者颈总动脉行端侧连续吻合,吻合完成后,接着进行供心主肺动脉与受者颈外静脉行端端连续吻合。
（二）指标检测
于移植术后第5天处死小鼠,取移植心脏，切取左室壁组织，置于液氮中冻存，逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR） 法检测iNOS mRNA水平变化。iNOS引物由上海生物工程公司合成，引物序列及扩增片段如下：iNOS 正义链 5’TGCATCAATAACCTGAACCGAGCA 3’, 反义链 5’GCACCTTCGAATTTGCCCATTGATC 3’, 扩增片段 638bp.€%[-Actin 正义链 5’GCCATCCTGCGTCTGGACCTG 3’，反义链 5’CATTTGCGGTGCACGATGGAG 3’，扩增片段 815bp. 以€%[-Actin 为内参照。 反应完成后取PCR产物在2% 琼脂糖凝胶中电泳，电泳完毕后在紫外灯下照片。图像输入仪摄取产物DNA 和内参照DNA电泳条带图像，全自动图像分析系统转化为灰度值，产物DNA 和内参照DNA电泳条带图像灰度值比例即为样品mRNA相对含量。
（三）统计学处理
SPSS10.0统计分析软件包对数据进行处理。以Ｐ<0.05作为判断显著性差异的标准。
二、结果
PCR产物电泳及条带密度扫描显示，与对照组相比，移植组iNOS mRNA表达明显升高, (1.59€?.18 vs 0.31€?.08，P<0.01)；与移植组相比，落新妇甙组iNOSmRNA表达明显降低 (0.33€?.04 vs1.59€?.18, P<0.01)。（图1）。
三、讨论
本研究结果显示，心脏移植急性排斥反应时，iNOS 的表达明显升高，这与国内外报道基本一致。我们的研究还发现落新妇甙能显著抑制心脏移植排斥反应中iNOS 的表达，提示落新妇甙通过降低一氧化氮的合成，预防了一氧化氮的细胞毒性作用，从而保护了移植心脏。
一氧化氮是体内多种组织或细胞产生的免疫调节分子,目前研究发现其与移植器官排斥反应关系密切,在排斥反应过程中, 一氧化氮的合成与释放发生了改变,并影响着器官移植的成功。一氧化氮作为人体内一种生物学活性分子,有两种来源。一种是非酶生(non-enzymistigense),来自体表或摄入的无机氮的化学降解或转化，此来源只占极少部分；另一种是酶生(enzymistigense),由一氧化氮合酶(NOS)所催化生成，此来源只占绝大部分。作为一氧化氮生成过程中关键酶的NOS以三种形式存在：内皮型NOS（eNOS）、诱导型NOS（ iNOS）和神经元型NOS（ nNOS）。正常心脏中内皮细胞和心肌细胞主要以eNOS形式存在，nNOS极为稀少。nNOS基因定位于第12对常染色体,主要存在于脑和神经细胞的细胞质内,故又称为脑型或神经型(nNOS)。eNOS基因定位于第7对常染色体上,主要存在于血管内皮细胞的细胞膜上,故称为内皮型(eNOS)，两者统称为构成型(constitutive NOS, cNOS),其活性为钙和钙调蛋白依赖的,其合成的一氧化氮寿命极短(几秒到几分钟)。而iNOS基因定位于第17对常染色体上,存在于各种类型的细胞中,包括巨噬细胞、软骨细脑、中性粒细胞,为非钙依赖性的,只在细胞受到刺激被激活后才表达,生成的一氧化氮能持续相对较长时间(几小时到几天) 。
生理情况下内皮细胞通过eNOS短暂合成少量NO，具有重要作用：NO弥散于平滑肌细胞通过cGMP 途径松弛血管；进入血流抑制血小板及白细胞的活化、粘附、聚集；通过直接抑制中性粒细胞的呼吸爆发减少氧自由基的产生，从而对心肌起保护作用。但当外界条件如Th1型炎性细胞因子TNF-€%Z、IFN-€%等刺激移植物浸润T淋巴细胞时，缓慢持久产生大量的具有细胞毒性的NO，并且与氧反应生成新的氧自由基，最终导致心肌细胞坏死以及心室功能衰竭。
越来越多的研究表明, iNOS在器官移植排斥反应中发挥重要作用，多种免疫细胞包括巨噬细胞、活化的T淋巴细胞等都能表达iNOS。器官移植排斥反应中产生的一些细胞因子如白细胞介素-1€%[(IL-1€%[),肿瘤坏死因子€%Z(TNF-€%Z),白细胞介素-2(IL-2)等激活T淋巴细胞等免疫细胞,表达大量iNOS ,进而催化L-精氨酸(L-Arg)生成大量的NO。其中TNF-€%Z是诱导iNOS 合成的重要因子, TNF-€%Z开始表达多出现在移植后第3天,与iNOS 在多在移植后第4天表达相一致。
最近有研究报道在器官移植后的不同时间NO的生成量和作用并不相同。NO一般在移植后第4天出现,在第8天开始下降。NOS表达下调原因还不清楚,可能与急性排斥反应的晚期凝血及巨噬细胞浸润下降有关。在移植后的较短时间内, NO主要由eNOS合成，量较少，表达短暂，对移植物起到积极的保护作用。其机制可能包括:抑制平滑肌细胞的增殖,迁移；抑制血小板、白细胞等粘附分子表达,保持内皮完整性；通过cGMP途径抑制血小板粘附聚集；抑制白细胞的粘附和趋化反应,阻断炎症的级联反应；保持血管的基础张力,减少痉挛,维护血管舒张状态,这对于保持血管通畅很重要；阻止细胞因子和脂多糖所引起的细胞凋亡,保护内皮细胞。但在移植后第4～5天，iNOS开始表达，缓慢持久生成大量的NO，此时则通过作用于巰基、金属基团,干扰能量代谢和DNA合成,抑制多种蛋白质功能,使超氧化物岐化酶失活和直接损伤DNA等途径,对移植物造成明显的损害。
落新妇甙是一种从传统中药土茯苓中提取的黄酮类化合物，能选择性地杀伤活化的T细胞,其途经可能是促进活化的T细胞凋亡。我们最近的研究发现落新妇甙能有效抑制心脏移植排斥反应，诱导心脏移植排斥反应中活化的T细胞凋亡，其机制可能与落新妇甙上调同种反应性T细胞Bax、Fas、FasL 和caspase-3 的表达，降低Bcl-2表达等有关。本研究还发现落新妇甙能显著抑制心脏移植排斥反应中iNOS的表达，说明落新妇甙在诱导心脏移植排斥反应中活化T细胞凋亡时，还可通过抑制iNOS的表达，防止NO的大量产生，减少NO的细胞毒作用，从而对移植心脏起保护作用。关于落新妇甙抑制心脏移植排斥反应中iNOS表达的具体机制有待进一步研究。
参考文献：
[1]Pieper GM, Cooper M, Johnson CP, et al. Reduction of myocardial nitrosyl complex formation by a nitric oxide scavenger prolongs cardiac allograft survival. J Cardiovasc Pharmacol,2000,35(1):114-120.
[2]高思海，李 平，潘铁成等. 落新妇甙诱导小鼠心脏移植排斥反应活化T细胞凋亡中华实验外科杂志 2004,21(4):502.
[3]高思海, 李 平, 潘铁成等. 小鼠颈部异位心脏移植模型的改进第四军医大学学报2004，25（5）：397.
[4]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 分子克隆学 金冬雁 译北京：科学出版社，1998.343-407.
[5]Joshi MS, Lancaster JR Jr, et al. In situ measurement of nitric oxide production in cardiac isografts and rejecting allografts by an electrochemical method. Nitric Oxide ,2001 ,5(6):561-565.
[6]Inuzuka S, Koga S, Nishikido M, et al. Donor-specific blood transfusion prolongs cardiac allograft survival in rats by low nitric oxide production and elevated serum levels of prostaglandin E(2).Immunol Lett,2002 ,83(2):119-124.
[7]Pieper GM, Roza AM, Adams MB, et al. A ruthenium (III) polyaminocarboxylate complex, a novel nitric oxide scavenger, enhances graft survival and decreases nitrosylated heme protein in models of acute and delayed cardiac transplant rejection. J Cardiovasc Pharmacol, 2002 ,39(3):441-448.
[8]Wildhirt SM, Weis M, Schulze C, et al. Expression of endomyocardial nitric oxide synthase and coronary endothelial function in human cardiac allografts. Circulation 2001 ,104(12 Suppl 1):I 336-343.
[9]Wildhirt SM, Weis M, Schulze C, et al. Coronary flow reserve and nitric oxide synthases after cardiac transplantation in humans. Eur J Cardiothorac Surg, 2001 ,19(6):840-847.
[10]Wildhirt SM, Weis M, Schulze C, et al. An association between microvascular endothelial dysfunction, transcardiac nitric oxide production and pro-inflammatory cytokines after heart transplantation in humans. Transpl Int, 2000, 13 Suppl 1:S228-34.
[11]Qian Z, Gelzer-Bell R, Yang SX, et al. Inducible nitric oxide synthase inhibition of weibel-palade body release in cardiac transplant rejection. Circulation, 2001, 104(19):2369-2375.
[12]Skarsgard PL, Wang X, McDonald P, et al. Profound inhibition of myogenic tone in rat cardiac allografts is due to eNOS- and iNOS-based nitric oxide and an intrinsic defect in vascular smooth muscle contraction. Circulation, 2000, 101(11):1303-1310.
[13]Akizuki E, Akaike T, Okamoto S,et al.Role of nitric oxide and superoxide in acute cardiac allograft rejection in rats. Proc Soc Exp Biol Med, 2000, 225(2):151-159.
[14]Yan R, Xu Q. Astilbin selectively facilitates the apoptosis of interleukin-2-dependent phytohemagglutinin-activated jurkat cells. Pharmacol Res 2001;44(2):135-9.
[15]高思海，陳涛, 潘铁成. 落新妇甙对同种反应性T细胞Bax,Bcl-2和 caspase-3表达的影响 中华实用中西医杂志 2003,3(16):2110-2111.
[16]高思海，李 平, 潘铁成.落新妇甙对同种反应性T细胞Fas, FasL和TNF-R1和TNF-R2基因表达的调控中华实用中西医杂志 2004,4（17）：217-218.