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摘要 2020年检测安徽省滁州、安庆和合肥的20个稻田养殖的200只克氏原螯虾（Procambarus clarkii）鳃组织中白斑综合征病毒和虾虹彩病毒，结果发现白斑综合征病毒阳性检出率为97.5%，病毒含量达106拷贝/mg的检出率与克氏原螯虾死亡率呈正相关。虾虹彩病毒阳性检出率为13%，只在滁州的3个和合肥的2个稻田的养殖虾中检出。
关键词 克氏原螯虾;白斑综合征病毒;虾虹彩病毒
中图分类号 S945.4 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2021）17-0085-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.17.023
Abstract Detection of white spot syndrome virus and shrimp hemocyte iridescent virus was performed in 200 red swamp crayfish （Procambarus clarkii） from 20 paddy fields in Chuzhou，Anqing，Hefei of Anhui Province in 2018.The results showed that the positive rate of WSSV in gill tissue of crayfish was 97.5%.The detection rate of 106 WSSV copies /mg gill tissue was positively correlated with the mortality rate of crayfish.The positive rate of shrimp hemocyte iridescent virus in crayfish was 13%，and was only detected positively in crayfish from 3 paddy fields in Chuzhou and 2 paddy fields in Hefei.
Key words Procambarus clarkii;White spot syndrome virus;Shrimp hemocyte iridescent virus
克氏原螯虾（Procambarus clarkii）肉质细嫩，深受消费者喜爱，是一种十分重要的甲壳类经济动物[1]。近10年来，克氏原螯虾养殖业快速发展，在我国水产行业占有重要的经济地位。2018年克氏原螯虾产量比2017年产量翻倍，达164万t[2]。2018、2019、2020年安徽省克氏原螯虾养殖面积分别为10.67万、20.93万和27.20万hm2，呈急剧增加态势。因此，该虾疾病的防控对产业发展起举足轻重的作用。
2006年，白斑综合征首次在浙江舟山养殖克氏原螯虾中暴发[3]。近些年，WSSV在全国各地克氏原螯虾中检出[2]，患病虾死亡率高达52%[4]，给该虾的养殖业造成了巨大的经濟损失。2014年虾淋巴细胞虹彩病毒（shrimp hemocyte iridescent virus，SHIV）首次被报道引起浙江省凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）出现暴发性疾病，引起虾大量死亡[5]。目前，病毒性疾病尚无有效治疗药物，疫情一旦暴发，不可控制。笔者在安徽省滁州市、安庆市、合肥市稻田采集克氏原螯虾进行WSSV和SHIV检测，对虾的产量及死亡情况进行跟踪调查，以期为稻田养殖克氏原螯虾防控这2种病毒性疾病提供研究基础。
1 材料与方法
1.1 克氏原螯虾样本采集
2020年5月下旬至6月初在安徽省合肥市、安庆市和滁州市20个稻田采集养殖的克氏原螯虾进行检测，每个稻田采集10只虾，体重15～20 g。活体带回实验室，及时采集虾的鳃组织，1只虾为1个样本，放置-80 ℃冰箱冷冻保存备用。
1.2 WSSV荧光定量PCR检测
取适量克氏原螯虾鳃组织进行研磨，用Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit提取DNA作为PCR扩增模板。对抽提的DNA采用OIE的WSSV荧光定量PCR方法进行扩增[6]。制备含扩增片段的质粒，用WSSV荧光定量PCR方法扩增，制作标准曲线，进行定量分析。
1.3 SHIV PCR检测
采用农业农村部在SHIV监测计划中推荐的套式PCR方法进行检测。PCR为50 μL反应体系：DEPC水33.5 μL，10×PCR缓冲液5.0 μL（含1.5 mmol/L MgCl2），4×dNTP混合物4.0 μL（2.5 μmol/L），引物各1.0 μL（20 μmol/L），Taq DNA聚合酶0.5 μL（5.0×106 U/L），模板DNA 5.0 μL。PCR使用的引物与反应条件见表1。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析。
1.4 克氏原螯虾发病情况
稻田均为稻虾连作种养模式，一年养殖一茬克氏原螯虾，4—5月轮捕虾上市，6月初开始种植水稻。统计虾的产量，观察虾的发病情况，统计虾的死亡量，计算死亡率。
1.5 WSSV感染试验
取0.1 g患病克氏原螯虾鳃组织，用5 mL三羟甲基氨基甲烷氯化钠EDTA缓冲剂（0.05 mol/L Tris，0.1 mol/L NaCl，0.001 mol/L EDTA，pH 7.4）匀浆，4 ℃、 6 000 r/min离心20 min，上清用0.45 μm PVDF膜过滤，稀释103倍，第二腹节注射克氏原螯虾20只，10 μL/只稀释液，观察虾的死亡情况。取10只濒临死亡克氏原螯虾鳃组织进行研磨，抽提虾鳃组织的DNA采用OIE的WSSV实时荧光定量PCR方法进行扩增，进行定量分析。 2 结果与分析
2.1 克氏原螯虾WSSV检测
200只克氏原螯虾的WSSV荧光定量PCR检测阳性率为97.5%，其中，15个稻田的虾WSSV PCR阳性检出率为100%（表2）。统计各稻田虾鳃中WSSV含量为106拷贝/mg以上的检出率：8和18号稻田的检出率分别为100%、90%;9和15号稻田的检出率分别为60%、30%;4、6、10和13号稻田的检出率为20%～40%;1、2、5、7和12号稻田的检出率均为10%。另7个稻田养殖虾鳃中WSSV含量均在104拷贝/mg及以下。
2.2 克氏原螯虾SHIV检测 200个克氏原螯虾鳃组织样本，首轮SHIV PCR检测结果均为阴性，第二轮PCR阳性检出率为13%（表3）。滁州2、3和4号稻田养殖虾的SHIV阳性检出率分别为70%、20%、70%;合肥的19、20号稻田养殖虾的SHIV阳性检出率均为50%;安庆的7个稻田养殖虾的SHIV检测结果均为阴性。
2.3 克氏原螯虾发病情况
20个稻田克氏原螯虾产量均在2 550 kg/hm2以下。所有稻田养殖克氏原螯虾均出现不同程度死亡，8和18号稻田的虾死亡率最高，达30%;9和15号稻田的虾死亡率分别达20%、15%;4、6、10和13号稻田的虾死亡率均为10%。1、2、5、7和12号稻田的虾死亡率为5%，其他7个稻田的虾死亡率为2%。
2.4 WSSV感染试验 人工感染试验结果显示，克氏原螯虾在注射感染后5 d内全部死亡。10只克氏原螯虾鳃中WSSV含量为2.23×108～6.39×108拷贝/mg（图1）。
3 讨论
SHIV只在滁州和合肥的部分稻田养殖克氏原螯虾中检出，且首轮PCR阳性率为零，表明SHIV尚未在安徽省养殖克氏原螯虾中大规模流行，且病毒携带量比较低，不会造成该虾死亡。该研究使用OIE的荧光定量PCR方法检测WSSV，比WSSV套式PCR检测方法的灵敏度（20个拷贝）高，为4个拷贝[6]。WSSV在20个稻田养殖克氏原螯虾中呈高流行趋势，7个稻田养殖虾的鳃中WSSV拷贝数均在104拷贝/mg以下，虾只出现零星死亡。随着稻田养殖虾的鳃中WSSV含量在106拷贝/mg以上的检出率增加，虾死亡率也增加。克氏原螯虾的死亡率始终低于WSSV含量为106拷贝/mg的检出率，一个原因是克氏原螯虾繁殖不同步，成虾养成的时间不同，采取轮捕的方式上市，4月中旬之前，水温较低，WSSV复制速度慢，虾携带病毒含量低，此前出售的虾未发病;4月下旬后水温上升，WSSV复制加快，克氏原螯虾携带WSSV的量大幅度增加。另一个原因是携带大量WSSV也未必导致敏感宿主发病、死亡[7]，人工感染试验中濒临死亡的克氏原螯虾鳃组织中WSSV含量达108拷贝/mg，表明采集的克氏原螯虾鳃中WSSV含量均未达到导致其死亡的程度。维氏气单孢菌和WSSV共同感染鳃导致克氏原螯虾死亡率达100%，比单独WSSV感染的死亡率（83.3%）高[8]。肝胰腺中气单孢菌属和柠檬酸杆菌属细菌大量增殖导致克氏原螯虾患病[9-11]。健康克氏原螯虾的肠道存在一定量的氣单孢菌属、柠檬酸杆菌属和志贺氏菌属条件致病菌[12]，由于细菌间的协同作用，正常情况下不会对机体健康造成危
害[13]。但WSSV感染会破坏甲壳动物中肠表皮完整性[14]，肠道中存在的条件致病菌最容易在该处定殖、繁殖，造成以条件致病菌大量增加为特点的肠道菌群失调。因此，携带WSSV 106拷贝/mg以上的克氏原螯虾是否发病死亡，还取决于其机体免疫力及肠道、肝胰腺和鳃组织中条件致病菌的增殖。
2018年WSSV在全国13个省养殖的克氏原螯虾中检出率为46.3%，呈广泛流行趋势[2]。但白斑综合征疾病只是零星发生，表明该病可控，主要从调控养殖水环境、增强克氏原螯虾免疫和调控虾肠道菌群入手。每隔10 d用一次分解底改，晴天施用芽孢杆菌制剂，阴雨天施用过碳酸钠制剂，可以将稻田的环境因子（pH、氨氮、亚硝酸盐）控制在合理范围内。稻田每隔10 d用碘制剂消毒一次，消灭养殖水体中的致病菌。用乳酸菌拌料投喂调节虾肠道菌群。
参考文献
[1] SHEN H S，HU Y C，MA Y C，et al.In-depth transcriptome analysis of the red swamp crayfish Procambarus clarkii[J].PLoS One，2014，9（10）：1-15.
[2] 农业农村部渔业渔政管理局，全国水产技术推广总站，中国水产学会.2019中国水生动物卫生状况报告[M].北京：中国农业出版社，2019.
[3] 王忠发，何伟贤，许文军.白斑综合症病毒引起小龙虾疫病爆发流行的病原学研究[J].中国卫生检验杂志，2007，17（8）：1397-1399.
[4] 丁正峰，薛晖，夏爱军，等.白斑综合征病毒在养殖克氏原螯虾中感染流行研究[J].南京农业大学学报，2008，31（4）：129-133.
[5] QIU L，CHEN M M，WAN X Y，et al.Characterization of a new member of Iridoviridae，shrimp hemocyte iridescent virus （SHIV），found in white leg shrimp （Litopenaeus vannamei）[J].Scientific reports，2017，7（1）：1959-1985.
[6] OIE.Manual of diagnostic tests for aquatic animals[EB/OL].[2020-07-28].http：//www.oie.int/en/standard-setting/aquatic-manual/access-online. [7] TSAI M F，KOU G H，LIU H C，et al.Long-term presence of white spot syndrome virus （WSSV） in a cultivated shrimp population without disease outbreaks[J].Disease aquatic organism，1999，38： 107-114.
[8] YUAN G L，ZHU L，JIANG X Y，et al.Diagnosis of co-infection with white spot syndrome virus and Aeromonas veronii in red swamp crayfish Procambarus clarkii[J/OL].Aquaculture，2020，532[2020-07-28].https：//doi.org/10.1016/j.aquaculture.2020.736010.
[9] 陳红莲，宋光同，何吉祥，等.克氏原螯虾弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定与药敏试验[J].淡水渔业，2014，44（1）：73-77.
[10] 彭博文，杨移斌，艾晓辉，等.克氏原螯虾源维氏气单胞菌分离鉴定及药敏特性研究[J].海洋湖沼通报，2018（4）：108-114.
[11] 唐庆权，韩阳，许晓牧，等.克氏原螯虾肝胰腺病原菌的分离鉴定和药敏试验[J].安徽农业科学，2019，47（21）：96-98.
[12] SHUI Y，GUAN Z B，LIU G F，et al.Gut microbiota of red swamp crayfish Procambarus clarkii in integrated crayfish-rice cultivation model[J].AMB Express，2020，10（1）：1-11.
[13] ZHU J Y，DAI W F，QIU Q F，et al.Contrasting ecological processes and functional compositions between intestinal bacterial community in healthy and diseased shrimp[J].Microbiology ecology，2016，72（4）：975-985.
[14] PILOTTO M R，GONCALVES A N A，VIEIRA F N，et al.Exploring the impact of the biofloc rearing system and an oral WSSV challenge on the intestinal bacteriome of Litopenaeus vannamei[J].Microorganisms，2018，6（3）：1-16.
关键词 克氏原螯虾;白斑综合征病毒;虾虹彩病毒
中图分类号 S945.4 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2021）17-0085-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.17.023
Abstract Detection of white spot syndrome virus and shrimp hemocyte iridescent virus was performed in 200 red swamp crayfish （Procambarus clarkii） from 20 paddy fields in Chuzhou，Anqing，Hefei of Anhui Province in 2018.The results showed that the positive rate of WSSV in gill tissue of crayfish was 97.5%.The detection rate of 106 WSSV copies /mg gill tissue was positively correlated with the mortality rate of crayfish.The positive rate of shrimp hemocyte iridescent virus in crayfish was 13%，and was only detected positively in crayfish from 3 paddy fields in Chuzhou and 2 paddy fields in Hefei.
Key words Procambarus clarkii;White spot syndrome virus;Shrimp hemocyte iridescent virus
克氏原螯虾（Procambarus clarkii）肉质细嫩，深受消费者喜爱，是一种十分重要的甲壳类经济动物[1]。近10年来，克氏原螯虾养殖业快速发展，在我国水产行业占有重要的经济地位。2018年克氏原螯虾产量比2017年产量翻倍，达164万t[2]。2018、2019、2020年安徽省克氏原螯虾养殖面积分别为10.67万、20.93万和27.20万hm2，呈急剧增加态势。因此，该虾疾病的防控对产业发展起举足轻重的作用。
2006年，白斑综合征首次在浙江舟山养殖克氏原螯虾中暴发[3]。近些年，WSSV在全国各地克氏原螯虾中检出[2]，患病虾死亡率高达52%[4]，给该虾的养殖业造成了巨大的经濟损失。2014年虾淋巴细胞虹彩病毒（shrimp hemocyte iridescent virus，SHIV）首次被报道引起浙江省凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）出现暴发性疾病，引起虾大量死亡[5]。目前，病毒性疾病尚无有效治疗药物，疫情一旦暴发，不可控制。笔者在安徽省滁州市、安庆市、合肥市稻田采集克氏原螯虾进行WSSV和SHIV检测，对虾的产量及死亡情况进行跟踪调查，以期为稻田养殖克氏原螯虾防控这2种病毒性疾病提供研究基础。
1 材料与方法
1.1 克氏原螯虾样本采集
2020年5月下旬至6月初在安徽省合肥市、安庆市和滁州市20个稻田采集养殖的克氏原螯虾进行检测，每个稻田采集10只虾，体重15～20 g。活体带回实验室，及时采集虾的鳃组织，1只虾为1个样本，放置-80 ℃冰箱冷冻保存备用。
1.2 WSSV荧光定量PCR检测
取适量克氏原螯虾鳃组织进行研磨，用Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit提取DNA作为PCR扩增模板。对抽提的DNA采用OIE的WSSV荧光定量PCR方法进行扩增[6]。制备含扩增片段的质粒，用WSSV荧光定量PCR方法扩增，制作标准曲线，进行定量分析。
1.3 SHIV PCR检测
采用农业农村部在SHIV监测计划中推荐的套式PCR方法进行检测。PCR为50 μL反应体系：DEPC水33.5 μL，10×PCR缓冲液5.0 μL（含1.5 mmol/L MgCl2），4×dNTP混合物4.0 μL（2.5 μmol/L），引物各1.0 μL（20 μmol/L），Taq DNA聚合酶0.5 μL（5.0×106 U/L），模板DNA 5.0 μL。PCR使用的引物与反应条件见表1。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析。
1.4 克氏原螯虾发病情况
稻田均为稻虾连作种养模式，一年养殖一茬克氏原螯虾，4—5月轮捕虾上市，6月初开始种植水稻。统计虾的产量，观察虾的发病情况，统计虾的死亡量，计算死亡率。
1.5 WSSV感染试验
取0.1 g患病克氏原螯虾鳃组织，用5 mL三羟甲基氨基甲烷氯化钠EDTA缓冲剂（0.05 mol/L Tris，0.1 mol/L NaCl，0.001 mol/L EDTA，pH 7.4）匀浆，4 ℃、 6 000 r/min离心20 min，上清用0.45 μm PVDF膜过滤，稀释103倍，第二腹节注射克氏原螯虾20只，10 μL/只稀释液，观察虾的死亡情况。取10只濒临死亡克氏原螯虾鳃组织进行研磨，抽提虾鳃组织的DNA采用OIE的WSSV实时荧光定量PCR方法进行扩增，进行定量分析。 2 结果与分析
2.1 克氏原螯虾WSSV检测
200只克氏原螯虾的WSSV荧光定量PCR检测阳性率为97.5%，其中，15个稻田的虾WSSV PCR阳性检出率为100%（表2）。统计各稻田虾鳃中WSSV含量为106拷贝/mg以上的检出率：8和18号稻田的检出率分别为100%、90%;9和15号稻田的检出率分别为60%、30%;4、6、10和13号稻田的检出率为20%～40%;1、2、5、7和12号稻田的检出率均为10%。另7个稻田养殖虾鳃中WSSV含量均在104拷贝/mg及以下。
2.2 克氏原螯虾SHIV检测 200个克氏原螯虾鳃组织样本，首轮SHIV PCR检测结果均为阴性，第二轮PCR阳性检出率为13%（表3）。滁州2、3和4号稻田养殖虾的SHIV阳性检出率分别为70%、20%、70%;合肥的19、20号稻田养殖虾的SHIV阳性检出率均为50%;安庆的7个稻田养殖虾的SHIV检测结果均为阴性。
2.3 克氏原螯虾发病情况
20个稻田克氏原螯虾产量均在2 550 kg/hm2以下。所有稻田养殖克氏原螯虾均出现不同程度死亡，8和18号稻田的虾死亡率最高，达30%;9和15号稻田的虾死亡率分别达20%、15%;4、6、10和13号稻田的虾死亡率均为10%。1、2、5、7和12号稻田的虾死亡率为5%，其他7个稻田的虾死亡率为2%。
2.4 WSSV感染试验 人工感染试验结果显示，克氏原螯虾在注射感染后5 d内全部死亡。10只克氏原螯虾鳃中WSSV含量为2.23×108～6.39×108拷贝/mg（图1）。
3 讨论
SHIV只在滁州和合肥的部分稻田养殖克氏原螯虾中检出，且首轮PCR阳性率为零，表明SHIV尚未在安徽省养殖克氏原螯虾中大规模流行，且病毒携带量比较低，不会造成该虾死亡。该研究使用OIE的荧光定量PCR方法检测WSSV，比WSSV套式PCR检测方法的灵敏度（20个拷贝）高，为4个拷贝[6]。WSSV在20个稻田养殖克氏原螯虾中呈高流行趋势，7个稻田养殖虾的鳃中WSSV拷贝数均在104拷贝/mg以下，虾只出现零星死亡。随着稻田养殖虾的鳃中WSSV含量在106拷贝/mg以上的检出率增加，虾死亡率也增加。克氏原螯虾的死亡率始终低于WSSV含量为106拷贝/mg的检出率，一个原因是克氏原螯虾繁殖不同步，成虾养成的时间不同，采取轮捕的方式上市，4月中旬之前，水温较低，WSSV复制速度慢，虾携带病毒含量低，此前出售的虾未发病;4月下旬后水温上升，WSSV复制加快，克氏原螯虾携带WSSV的量大幅度增加。另一个原因是携带大量WSSV也未必导致敏感宿主发病、死亡[7]，人工感染试验中濒临死亡的克氏原螯虾鳃组织中WSSV含量达108拷贝/mg，表明采集的克氏原螯虾鳃中WSSV含量均未达到导致其死亡的程度。维氏气单孢菌和WSSV共同感染鳃导致克氏原螯虾死亡率达100%，比单独WSSV感染的死亡率（83.3%）高[8]。肝胰腺中气单孢菌属和柠檬酸杆菌属细菌大量增殖导致克氏原螯虾患病[9-11]。健康克氏原螯虾的肠道存在一定量的氣单孢菌属、柠檬酸杆菌属和志贺氏菌属条件致病菌[12]，由于细菌间的协同作用，正常情况下不会对机体健康造成危
害[13]。但WSSV感染会破坏甲壳动物中肠表皮完整性[14]，肠道中存在的条件致病菌最容易在该处定殖、繁殖，造成以条件致病菌大量增加为特点的肠道菌群失调。因此，携带WSSV 106拷贝/mg以上的克氏原螯虾是否发病死亡，还取决于其机体免疫力及肠道、肝胰腺和鳃组织中条件致病菌的增殖。
2018年WSSV在全国13个省养殖的克氏原螯虾中检出率为46.3%，呈广泛流行趋势[2]。但白斑综合征疾病只是零星发生，表明该病可控，主要从调控养殖水环境、增强克氏原螯虾免疫和调控虾肠道菌群入手。每隔10 d用一次分解底改，晴天施用芽孢杆菌制剂，阴雨天施用过碳酸钠制剂，可以将稻田的环境因子（pH、氨氮、亚硝酸盐）控制在合理范围内。稻田每隔10 d用碘制剂消毒一次，消灭养殖水体中的致病菌。用乳酸菌拌料投喂调节虾肠道菌群。
参考文献
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[10] 彭博文，杨移斌，艾晓辉，等.克氏原螯虾源维氏气单胞菌分离鉴定及药敏特性研究[J].海洋湖沼通报，2018（4）：108-114.
[11] 唐庆权，韩阳，许晓牧，等.克氏原螯虾肝胰腺病原菌的分离鉴定和药敏试验[J].安徽农业科学，2019，47（21）：96-98.
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