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摘 要：本文用高效液相法对黄连上清片中的黄芩苷的进行了含量测定。固定相为：依利特hypersil BDS C18 色谱柱（4.6*250*5u），乙腈-甲醇-水-磷酸（20：15：65∶0.1）为流动相，检测波长为315nm；黄芩苷在5～95μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。黄芩苷的平均回收率为99.5%。本法简便、重现性好、回收率高，可用于黄连上清片中黄芩苷的含量测定。
关键词：黄连上清片；黄芩苷；测定
黄连上清片由连翘、蔓荆子（炒）、荆芥穗、薄荷、黄连、大黄、栀子、黄芩、菊花、白芷、桔梗、川芎、石膏、黄柏、防风、旋覆花、甘草组成。黄连上清片具有清热通便，散风止痛的功效。黄连上清片用于内热火盛引起的头晕脑胀、口舌生疮、咽喉红肿、牙龈肿痛、暴发火眼、小便色黄等。黄芩苷（Baicalin）是从黄芩根中提取分离出来的一种黄酮类化合物，具有抑菌、利尿、抗氧化、抗白内障、镇静、降压、保肝、降脂、抗炎、抗变态、解痉、抗癌反应等生理效能。黄芩苷还能吸收紫外线，清除氧自由基，又能抑制黑色素的生成也可用于化妆品。黄芩苷为黄连上清片主要成分之一。本文用高效液相法对黄连上清片中的黄芩苷的进行了含量测定。
1 仪器与试药
1.1 仪器：PURIST超纯水系统（上海瑞枫生物科技有限公司）；HX-06超声波清洗器（武汉恒信世纪科技有限公司）；PHS-550智能型台式酸度计（杭州陆恒生物科技有限公司）；1800美国必能信超声波清洗机（北京星越天成科技有限公司）；LC-5520高效液相色谱仪（北京东西分析仪器有限公司）；UV-6双光束扫描型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；Precisa XB220A电子分析天平（上海精科天美科学仪器有限公司）。
1.2 试药：乙腈（成都三维化工有限责任公司）、盐酸（淄博市临淄冰清精细化工厂）、三乙胺（淄博市临淄冰清精细化工厂）、甲醇（上海祁安化工有限公司）、冰乙酸（山东佳泰石油化工有限公司）、磷酸（济南世纪通达化工有限公司）、磷酸氢二铵（淄博市淄川区鑫川化工厂）、冰醋酸（淄博市临淄冰清精细化工厂）。
2 含量测定
2.1 色谱条件：依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下[1-6]。色谱柱为依利特hypersil BDS C18 色谱柱（4.6*250*5u）；乙腈-甲醇-水-磷酸（20：15：65∶0.1）为流动相；检测波长为315nm；流速1.0mL·min-1；柱温：30℃。理论板数按黄芩苷峰计算应不得低于2000。
2.2 供试品溶液的制备
取黄连上清片适量，研细，精密称定至容量瓶内，加适量流动相超声溶解，放凉，用流动相定容，过0.45μm的滤膜，即得。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取黄芩苷对照品约10mg，置50毫升棕色容量瓶中，用流动相超声波振荡溶解并用水稀释至刻度，摇匀，精密吸取10毫升，置100毫升棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL溶液中含黄芩苷20μg）。
2.4 阴性干扰试验：按方中比例取连翘、蔓荆子（炒）、荆芥穗、薄荷、栀子、菊花、白芷、桔梗、川芎、石膏、防风、旋覆花、甘草等原辅料，按照制备工艺方法制成阴性制剂，按2.3项下方法制成供试品溶液，按色谱条件测定。结果表明：在选定条件下测得的阴性液吸收曲线在与黄芩苷相同保留时间处不存在吸收峰，说明此方法具有较强的专属性。
2.5 标准曲线的制备
制备浓度为5μg·mL-1、15μg·mL-1、25μg·mL-1、35μg·mL-1、45μg·mL-1、55μg·mL-1、65μg·mL-1、75μg·mL-1、85μg·mL-1、95μg·mL-1的对照品溶液，分别精密吸取10μL注入HPLC，记录色谱图。以峰面积积分值A（μg）为横坐标，进样量为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。试验表明，黄芩苷对照品在5～95μg·mL-1范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验
精密吸取黄芩苷对照品溶液10μL重复进样6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD为0.55%。结果表明，本实验精密度良好。
2.7 重现性试验
分别称取同批黄连上清片样品6份，分别制备成供试品，按色谱条件测定含量，并计算样品的RSD值为0.53%，结果表明，此含量测定方法的重现性良好。
2.8 稳定性试验
取供试品溶液，分别在0，1，2，3，4h，6h精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，进样测定，供试品黄芩苷峰面积积分值的RSD为0.52%。结果表明黄芩苷至少在6h内稳定。
2.9 回收率试验
采用加样回收试验，取已知含量的同一批供试品各6份，精密称定，分精密添加一定量的黄芩苷对照品，按供试品制备所述方法制备供试品溶液，测定含量（同时测定样品含量），计算回收率。6次测定的平均回收率为99.5%，RSD为0.76%。
2.10 样品含量测定
依照上述含量测定方法，测定黄连上清片三批样品中黄芩苷的含量，结果三批样品的含量分别为0.82毫克/片、0.88毫克/片、0.86毫克/片。
3 讨论
分别考察乙腈-甲醇-水-磷酸（20：15：65∶0.1），乙腈-甲醇-水-三乙胺（20：20：60∶0.01），乙腈-0.033mol/L磷酸二氢钾（含0.5%三乙胺，用磷酸调节pH至3.0）（30：70），乙腈-甲醇-冰乙酸-水（15：15∶3∶67），水（0.4%磷酸∶0.7%三乙胺）-乙腈（77∶23），0.05mol.L-1磷酸二氢钾溶液（用磷酸调pH到3.0）-乙腈（20∶80），乙腈-甲醇-1%醋酸钠-冰醋酸（18：12：70∶0.1），乙腈-甲醇-四氢呋喃-水（10：15：35∶40）不同比例的流动相，结果以乙腈-甲醇-水-磷酸（20：15：65∶0.1）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用乙腈-甲醇-水-磷酸（20：15：65∶0.1）为流动相。本实验方法是一种简便、准确、安全的测定黄连上清片含量的方法。黄连上清片中黄芩苷的含量应大于0.80毫克/片。
参考文献
[1]李东霞，高明，孟庆刚，王建英，孙慧，汪晴.野生与栽培黄芩的比较研究[J].天津中医药，2007（4）.
[2]崔岚，安富荣，夏玲红.反相高效液相色谱法测定舒肝祛脂胶囊黄芩苷含量[J].医药导报，2007（11）.
[3]翟红，王小龙.RP-HPLC法测定黄连上清片中黄芩苷的含量[J].中国药师，2006（10）.
[4]黄海燕，钟建理，薛漓.黄连上清片中黄连的鉴别及含量测定[J].中国医院药学杂志，2007（3）.
[5]马虹，毛大鸣，林佳任.高效液相法测定炎可宁胶囊中黄芩苷的含量[J].贵阳中医学院学报，2007（5）.
[6]吴泽君，王爱良，刘水平，李剑英.黄连上清片质量控制方法的研究[J].中国药学杂志，2003（12）.
关键词：黄连上清片；黄芩苷；测定
黄连上清片由连翘、蔓荆子（炒）、荆芥穗、薄荷、黄连、大黄、栀子、黄芩、菊花、白芷、桔梗、川芎、石膏、黄柏、防风、旋覆花、甘草组成。黄连上清片具有清热通便，散风止痛的功效。黄连上清片用于内热火盛引起的头晕脑胀、口舌生疮、咽喉红肿、牙龈肿痛、暴发火眼、小便色黄等。黄芩苷（Baicalin）是从黄芩根中提取分离出来的一种黄酮类化合物，具有抑菌、利尿、抗氧化、抗白内障、镇静、降压、保肝、降脂、抗炎、抗变态、解痉、抗癌反应等生理效能。黄芩苷还能吸收紫外线，清除氧自由基，又能抑制黑色素的生成也可用于化妆品。黄芩苷为黄连上清片主要成分之一。本文用高效液相法对黄连上清片中的黄芩苷的进行了含量测定。
1 仪器与试药
1.1 仪器：PURIST超纯水系统（上海瑞枫生物科技有限公司）；HX-06超声波清洗器（武汉恒信世纪科技有限公司）；PHS-550智能型台式酸度计（杭州陆恒生物科技有限公司）；1800美国必能信超声波清洗机（北京星越天成科技有限公司）；LC-5520高效液相色谱仪（北京东西分析仪器有限公司）；UV-6双光束扫描型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；Precisa XB220A电子分析天平（上海精科天美科学仪器有限公司）。
1.2 试药：乙腈（成都三维化工有限责任公司）、盐酸（淄博市临淄冰清精细化工厂）、三乙胺（淄博市临淄冰清精细化工厂）、甲醇（上海祁安化工有限公司）、冰乙酸（山东佳泰石油化工有限公司）、磷酸（济南世纪通达化工有限公司）、磷酸氢二铵（淄博市淄川区鑫川化工厂）、冰醋酸（淄博市临淄冰清精细化工厂）。
2 含量测定
2.1 色谱条件：依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下[1-6]。色谱柱为依利特hypersil BDS C18 色谱柱（4.6*250*5u）；乙腈-甲醇-水-磷酸（20：15：65∶0.1）为流动相；检测波长为315nm；流速1.0mL·min-1；柱温：30℃。理论板数按黄芩苷峰计算应不得低于2000。
2.2 供试品溶液的制备
取黄连上清片适量，研细，精密称定至容量瓶内，加适量流动相超声溶解，放凉，用流动相定容，过0.45μm的滤膜，即得。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取黄芩苷对照品约10mg，置50毫升棕色容量瓶中，用流动相超声波振荡溶解并用水稀释至刻度，摇匀，精密吸取10毫升，置100毫升棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL溶液中含黄芩苷20μg）。
2.4 阴性干扰试验：按方中比例取连翘、蔓荆子（炒）、荆芥穗、薄荷、栀子、菊花、白芷、桔梗、川芎、石膏、防风、旋覆花、甘草等原辅料，按照制备工艺方法制成阴性制剂，按2.3项下方法制成供试品溶液，按色谱条件测定。结果表明：在选定条件下测得的阴性液吸收曲线在与黄芩苷相同保留时间处不存在吸收峰，说明此方法具有较强的专属性。
2.5 标准曲线的制备
制备浓度为5μg·mL-1、15μg·mL-1、25μg·mL-1、35μg·mL-1、45μg·mL-1、55μg·mL-1、65μg·mL-1、75μg·mL-1、85μg·mL-1、95μg·mL-1的对照品溶液，分别精密吸取10μL注入HPLC，记录色谱图。以峰面积积分值A（μg）为横坐标，进样量为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。试验表明，黄芩苷对照品在5～95μg·mL-1范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验
精密吸取黄芩苷对照品溶液10μL重复进样6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD为0.55%。结果表明，本实验精密度良好。
2.7 重现性试验
分别称取同批黄连上清片样品6份，分别制备成供试品，按色谱条件测定含量，并计算样品的RSD值为0.53%，结果表明，此含量测定方法的重现性良好。
2.8 稳定性试验
取供试品溶液，分别在0，1，2，3，4h，6h精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，进样测定，供试品黄芩苷峰面积积分值的RSD为0.52%。结果表明黄芩苷至少在6h内稳定。
2.9 回收率试验
采用加样回收试验，取已知含量的同一批供试品各6份，精密称定，分精密添加一定量的黄芩苷对照品，按供试品制备所述方法制备供试品溶液，测定含量（同时测定样品含量），计算回收率。6次测定的平均回收率为99.5%，RSD为0.76%。
2.10 样品含量测定
依照上述含量测定方法，测定黄连上清片三批样品中黄芩苷的含量，结果三批样品的含量分别为0.82毫克/片、0.88毫克/片、0.86毫克/片。
3 讨论
分别考察乙腈-甲醇-水-磷酸（20：15：65∶0.1），乙腈-甲醇-水-三乙胺（20：20：60∶0.01），乙腈-0.033mol/L磷酸二氢钾（含0.5%三乙胺，用磷酸调节pH至3.0）（30：70），乙腈-甲醇-冰乙酸-水（15：15∶3∶67），水（0.4%磷酸∶0.7%三乙胺）-乙腈（77∶23），0.05mol.L-1磷酸二氢钾溶液（用磷酸调pH到3.0）-乙腈（20∶80），乙腈-甲醇-1%醋酸钠-冰醋酸（18：12：70∶0.1），乙腈-甲醇-四氢呋喃-水（10：15：35∶40）不同比例的流动相，结果以乙腈-甲醇-水-磷酸（20：15：65∶0.1）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用乙腈-甲醇-水-磷酸（20：15：65∶0.1）为流动相。本实验方法是一种简便、准确、安全的测定黄连上清片含量的方法。黄连上清片中黄芩苷的含量应大于0.80毫克/片。
参考文献
[1]李东霞，高明，孟庆刚，王建英，孙慧，汪晴.野生与栽培黄芩的比较研究[J].天津中医药，2007（4）.
[2]崔岚，安富荣，夏玲红.反相高效液相色谱法测定舒肝祛脂胶囊黄芩苷含量[J].医药导报，2007（11）.
[3]翟红，王小龙.RP-HPLC法测定黄连上清片中黄芩苷的含量[J].中国药师，2006（10）.
[4]黄海燕，钟建理，薛漓.黄连上清片中黄连的鉴别及含量测定[J].中国医院药学杂志，2007（3）.
[5]马虹，毛大鸣，林佳任.高效液相法测定炎可宁胶囊中黄芩苷的含量[J].贵阳中医学院学报，2007（5）.
[6]吴泽君，王爱良，刘水平，李剑英.黄连上清片质量控制方法的研究[J].中国药学杂志，2003（12）.