论文部分内容阅读
摘 要：铁皮石斛为兰科多年生附生草本植物，但是由于人类的大规模采集，在其需求量急剧增长的情况下，人工的培育变得尤为重要，通过研究铁皮石斛的原球茎增殖的培养基配方，发现1/2MS 28g葡糖糖 1g活性炭 7g琼脂 1.5mg/L6-BA 0.5mg/LNAA最适合于铁皮石斛原球茎的增殖。
关键词：铁皮；石斛原球茎增殖配方；优化
中图分类号：567.2 文献标识码：A
铁皮石斛（Herba Dendrodii Officinalis），兰科多年生附生草本植物。生于海拔达1600m的山地半阴湿的岩石上，喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境，不耐寒。一般均能耐-5℃的低温。石斛可分为黄草、金钗、马鞭等数10种，铁皮石斛为石斛之极品，由于其具有药用价值和保健功能。是历代宫廷贡品，其价值就是药用植物界的“大熊猫”，名列中华九大仙草之首野生“铁皮”石斛是国家重点二级保护的珍稀濒危植物，它因表皮呈铁绿色而得名[1]。铁皮石斛具有独特的药用价值，以其茎入药，中药名：石斛，属补益药中的补阴药[2]。
自古以来，人们用药都是依靠上山采挖收集野生植株，而野生石斛的繁殖率又极低，人们如此只采挖野生的石斛却不人工种植，导致石斛中的上品——铁皮石斛逐渐枯竭并引发其价格一涨再涨！目前，国际市场1kg铁皮石斛干品高达1000～3000美元，鲜品收购价1kg仍在2000元以上。铁皮石斛的逐渐枯竭，再加上开发生产其药用、保健、美容产品开发商家的逐年增加，导致铁皮石斛的成品几乎已无处收购、有价无货，人工种植迫在眉睫。随着科技的发展和社会的进步，人们也认识到这个严峻的问题，也有人员专门从事人工种植铁皮石斛，但是碍于石斛的生长周期长，生长环境要求高，人工种植产业发展前景不是很乐观。同时，许多国内外学者也利用铁皮石斛种子和茎尖来进行组织培养的研究，成果可观，但还是存在试管苗污染严重、增殖系数低、试管苗茎细弱、移栽成活率不高等诸多原因，影响了铁皮石斛试管苗快繁和大规模的工厂化种植。在石斛组织培养过程中，石斛原球茎增殖又十分关键。通过诱导石斛产生大量原球茎，将所得的原球茎切分进行分化形成大量丛生芽，再将丛生芽分苗，培养成小苗，小苗生长成一定高度的植株就可以炼苗种植，而达到快速繁殖的目的。用铁皮石斛茎段诱导出的原球茎通过在不同的基本培养基、碳源、激素水平、添加物及培养方式进行增殖培养，观察其生长情况。光照时间、强度恒定，上午8：00～11：30，下午14：30～17：30，光照强度1000～1600lx，温度（25±1）℃。以找出最适合铁皮石斛原球茎增殖的培养基以及培养方式，为人工种植铁皮石斛提供技术支持和种源[3]。
1 材料与方法
1.1 材料
铁皮石斛原球茎购买于昆明生物公司植物组织培养中心。铁皮石斛多个原球茎聚集呈圆锥状，其顶端有鳞片状的叶原基突起，呈淡绿色，似芽状，尚未分化出真叶。
1.2 方法
选取同一批次接且生长旺盛尚未分化的原球茎，将其切割成直径为1.5～2cm的不规则团块。
1.2.1 基本培养基的筛选
选取切割的原球茎团块接种在MS、1/2MS基本固体培养基上，每种基本培养基接种13瓶，每瓶接种5～6个原球茎团。培养基并附加蔗糖28g/L，琼脂7g/L，活性炭1g/L。35d后观察。
1.2.2 不同浓度的6-BA筛选
选取切割的原球茎团块接种在MS、1/2MS为基本培养基，每种培养基接种13瓶，每瓶接种5～6个原球茎团，附加28g/L蔗糖，活性炭1g/L。NAA 0.5mg/L，6-BA分别为0、0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L、3.0mg/L的情况下培养，45d后观察。
1.2.3 不同浓度的NAA筛选
选取切割的原球茎团块接种在MS、1/2MS为基本培养基，每种培养基接种13瓶，每瓶接种5～6个原球茎团，附加蔗糖28g/L，活性炭1g/L，BA 0.5 mg/L，NAA分别取0、0.5mg/L、1.0mg/L，1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L、3.0mg/L的情况下培养。
1.2.4 不同天然添加物质的筛选
选取切割的原球茎团块接种在MS、1/2MS为基本培养基，每种培养基接种13瓶，每瓶接种5～6个原球茎团，附加28g/L蔗糖，活性炭1g/L。香蕉提取液、马铃薯提取液和铃薯汁均为200g/L。45d后观察。
1.2.5 培养基
选取切割的原球茎团块接种在MS、1/2MS为基本培养基，每种培养基接种13瓶，每瓶接种4～5个原球茎团，有光照和无光照做比较。
2 结果与分析
2.1 培养基对原球茎增值的影响
培养基作为原球茎的直接营养来源，培养基成分和浓度的大小直接影响到原球茎的增值、增长情况，最适宜的培养基浓度可随外植体的形态和发育阶段的不同而不同。由表1可知，铁皮石斛原球茎在1/2 MS培养基中增殖效果较在MS培养基中好，起在1/2MS培养基上长势好，苗较绿、较状[4]。
2.2 6-BA浓度对原球茎增殖的影响
在培养基的各种成分中，植物激素对植物的生长调节作用很大。由表2可知，当NAA浓度固定（0.5mg/L）、6-BA浓度不同时，随着BA浓度的不断升高，原球茎增殖的速度加快，但当BA浓度高于1.5mg/L时，原球茎的生长速度反而减慢，这说明BA浓度过高或过低对原球茎的增殖有抑制作用。当BA浓度为1.5mg/L、NAA为0.5mg/L时，原球茎的增殖速度最快，且颜色绿，长势好[5]。 2.3 NAA的浓度对原球茎增殖的影响
在急速成分中影响较大，由表3可知，当6-BA的浓度固定为1.5mg/L，NAA浓度不同，原球茎增殖速度不同，其浓度为0.5mg/L原球茎长势最好。
2.4 不同天然物质对原球茎增殖的影响
由表4可知，在基本培养基固定的情况下，不同天然添加物对铁皮石斛原球茎生长和增值有较大的影响。添加马铃薯汁后原球茎增殖速度较快，原球茎一直保持旺盛的增殖生长，体积增加较为明显，颜色较绿。这说明马铃薯汁对铁皮石斛原球茎的生长具有促进作用；添加香蕉和马铃薯提取液对铁皮石斛原球茎增殖生长也有一定的促进作用，但均不及马铃薯汁，且其含量为200g/L最佳[6]。
2.5 光照的对比
由表5结果显示，在没有光件下，石斛原球茎长得慢，且发黄，污染率提升。光照时原球茎生长的必要条件，其污染率增大可能是阴暗潮湿的环境为微生物的生长提供了优异的环境。
3 结论与讨论
近年来铁皮石斛的组织培养技术发展迅速，取得了很大的进展。本试验从铁皮石斛原球茎生长环境中的营养条件、光照强度等几个方面进行研究，结果表明，1/2MS 28g/L葡糖糖 1g/L活性炭 7g/L琼脂 1.5mg/L6-BA 0.5mg/LNAA最适合于铁皮石斛原球茎的增殖。
参考文献
[1] 艾娟，严宁，胡虹，等.温度对铁皮石斛生长及生理特性的影响[J].云南植物研究，2010，32（5）：420-426.
[2] 包雪声.中国药用石斛[M].上海：上海医科大学出版社，复旦大学出版社，2001：1-49.
[3] 王丽萍，梁淑云.铁皮石斛原球茎诱导与增殖研究[J].中国农学通报，2010，26（1）：265-268.
[4] 韦华芳，张进忠，林贵美，等.细胞分裂素Meta.topolin对香蕉组织培养的影响[J].广东农业科学，2010（7）：52-54.
[5] 张龙，杨洪强，李强，等.生长素和细胞分裂素对平邑甜茶组培苗PAs和N O含量的影响[J].园艺学报，2009，36 （7）：953-958.
[6] 李明军，邓丽，刘欣英，等.生长素和细胞分裂素对怀山药微型块茎诱导形成的影响[J].河南农业科学，2008（110）：102-106.
关键词：铁皮；石斛原球茎增殖配方；优化
中图分类号：567.2 文献标识码：A
铁皮石斛（Herba Dendrodii Officinalis），兰科多年生附生草本植物。生于海拔达1600m的山地半阴湿的岩石上，喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境，不耐寒。一般均能耐-5℃的低温。石斛可分为黄草、金钗、马鞭等数10种，铁皮石斛为石斛之极品，由于其具有药用价值和保健功能。是历代宫廷贡品，其价值就是药用植物界的“大熊猫”，名列中华九大仙草之首野生“铁皮”石斛是国家重点二级保护的珍稀濒危植物，它因表皮呈铁绿色而得名[1]。铁皮石斛具有独特的药用价值，以其茎入药，中药名：石斛，属补益药中的补阴药[2]。
自古以来，人们用药都是依靠上山采挖收集野生植株，而野生石斛的繁殖率又极低，人们如此只采挖野生的石斛却不人工种植，导致石斛中的上品——铁皮石斛逐渐枯竭并引发其价格一涨再涨！目前，国际市场1kg铁皮石斛干品高达1000～3000美元，鲜品收购价1kg仍在2000元以上。铁皮石斛的逐渐枯竭，再加上开发生产其药用、保健、美容产品开发商家的逐年增加，导致铁皮石斛的成品几乎已无处收购、有价无货，人工种植迫在眉睫。随着科技的发展和社会的进步，人们也认识到这个严峻的问题，也有人员专门从事人工种植铁皮石斛，但是碍于石斛的生长周期长，生长环境要求高，人工种植产业发展前景不是很乐观。同时，许多国内外学者也利用铁皮石斛种子和茎尖来进行组织培养的研究，成果可观，但还是存在试管苗污染严重、增殖系数低、试管苗茎细弱、移栽成活率不高等诸多原因，影响了铁皮石斛试管苗快繁和大规模的工厂化种植。在石斛组织培养过程中，石斛原球茎增殖又十分关键。通过诱导石斛产生大量原球茎，将所得的原球茎切分进行分化形成大量丛生芽，再将丛生芽分苗，培养成小苗，小苗生长成一定高度的植株就可以炼苗种植，而达到快速繁殖的目的。用铁皮石斛茎段诱导出的原球茎通过在不同的基本培养基、碳源、激素水平、添加物及培养方式进行增殖培养，观察其生长情况。光照时间、强度恒定，上午8：00～11：30，下午14：30～17：30，光照强度1000～1600lx，温度（25±1）℃。以找出最适合铁皮石斛原球茎增殖的培养基以及培养方式，为人工种植铁皮石斛提供技术支持和种源[3]。
1 材料与方法
1.1 材料
铁皮石斛原球茎购买于昆明生物公司植物组织培养中心。铁皮石斛多个原球茎聚集呈圆锥状，其顶端有鳞片状的叶原基突起，呈淡绿色，似芽状，尚未分化出真叶。
1.2 方法
选取同一批次接且生长旺盛尚未分化的原球茎，将其切割成直径为1.5～2cm的不规则团块。
1.2.1 基本培养基的筛选
选取切割的原球茎团块接种在MS、1/2MS基本固体培养基上，每种基本培养基接种13瓶，每瓶接种5～6个原球茎团。培养基并附加蔗糖28g/L，琼脂7g/L，活性炭1g/L。35d后观察。
1.2.2 不同浓度的6-BA筛选
选取切割的原球茎团块接种在MS、1/2MS为基本培养基，每种培养基接种13瓶，每瓶接种5～6个原球茎团，附加28g/L蔗糖，活性炭1g/L。NAA 0.5mg/L，6-BA分别为0、0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L、3.0mg/L的情况下培养，45d后观察。
1.2.3 不同浓度的NAA筛选
选取切割的原球茎团块接种在MS、1/2MS为基本培养基，每种培养基接种13瓶，每瓶接种5～6个原球茎团，附加蔗糖28g/L，活性炭1g/L，BA 0.5 mg/L，NAA分别取0、0.5mg/L、1.0mg/L，1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L、3.0mg/L的情况下培养。
1.2.4 不同天然添加物质的筛选
选取切割的原球茎团块接种在MS、1/2MS为基本培养基，每种培养基接种13瓶，每瓶接种5～6个原球茎团，附加28g/L蔗糖，活性炭1g/L。香蕉提取液、马铃薯提取液和铃薯汁均为200g/L。45d后观察。
1.2.5 培养基
选取切割的原球茎团块接种在MS、1/2MS为基本培养基，每种培养基接种13瓶，每瓶接种4～5个原球茎团，有光照和无光照做比较。
2 结果与分析
2.1 培养基对原球茎增值的影响
培养基作为原球茎的直接营养来源，培养基成分和浓度的大小直接影响到原球茎的增值、增长情况，最适宜的培养基浓度可随外植体的形态和发育阶段的不同而不同。由表1可知，铁皮石斛原球茎在1/2 MS培养基中增殖效果较在MS培养基中好，起在1/2MS培养基上长势好，苗较绿、较状[4]。
2.2 6-BA浓度对原球茎增殖的影响
在培养基的各种成分中，植物激素对植物的生长调节作用很大。由表2可知，当NAA浓度固定（0.5mg/L）、6-BA浓度不同时，随着BA浓度的不断升高，原球茎增殖的速度加快，但当BA浓度高于1.5mg/L时，原球茎的生长速度反而减慢，这说明BA浓度过高或过低对原球茎的增殖有抑制作用。当BA浓度为1.5mg/L、NAA为0.5mg/L时，原球茎的增殖速度最快，且颜色绿，长势好[5]。 2.3 NAA的浓度对原球茎增殖的影响
在急速成分中影响较大，由表3可知，当6-BA的浓度固定为1.5mg/L，NAA浓度不同，原球茎增殖速度不同，其浓度为0.5mg/L原球茎长势最好。
2.4 不同天然物质对原球茎增殖的影响
由表4可知，在基本培养基固定的情况下，不同天然添加物对铁皮石斛原球茎生长和增值有较大的影响。添加马铃薯汁后原球茎增殖速度较快，原球茎一直保持旺盛的增殖生长，体积增加较为明显，颜色较绿。这说明马铃薯汁对铁皮石斛原球茎的生长具有促进作用；添加香蕉和马铃薯提取液对铁皮石斛原球茎增殖生长也有一定的促进作用，但均不及马铃薯汁，且其含量为200g/L最佳[6]。
2.5 光照的对比
由表5结果显示，在没有光件下，石斛原球茎长得慢，且发黄，污染率提升。光照时原球茎生长的必要条件，其污染率增大可能是阴暗潮湿的环境为微生物的生长提供了优异的环境。
3 结论与讨论
近年来铁皮石斛的组织培养技术发展迅速，取得了很大的进展。本试验从铁皮石斛原球茎生长环境中的营养条件、光照强度等几个方面进行研究，结果表明，1/2MS 28g/L葡糖糖 1g/L活性炭 7g/L琼脂 1.5mg/L6-BA 0.5mg/LNAA最适合于铁皮石斛原球茎的增殖。
参考文献
[1] 艾娟，严宁，胡虹，等.温度对铁皮石斛生长及生理特性的影响[J].云南植物研究，2010，32（5）：420-426.
[2] 包雪声.中国药用石斛[M].上海：上海医科大学出版社，复旦大学出版社，2001：1-49.
[3] 王丽萍，梁淑云.铁皮石斛原球茎诱导与增殖研究[J].中国农学通报，2010，26（1）：265-268.
[4] 韦华芳，张进忠，林贵美，等.细胞分裂素Meta.topolin对香蕉组织培养的影响[J].广东农业科学，2010（7）：52-54.
[5] 张龙，杨洪强，李强，等.生长素和细胞分裂素对平邑甜茶组培苗PAs和N O含量的影响[J].园艺学报，2009，36 （7）：953-958.
[6] 李明军，邓丽，刘欣英，等.生长素和细胞分裂素对怀山药微型块茎诱导形成的影响[J].河南农业科学，2008（110）：102-106.