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摘要： 為了实现罗汉果生产中免除人工授粉和果实无籽化，该研究利用pBI121-Gus构建果实特异启动子2A11与生长素合成相关基因iaaM的嵌合基因（2A11-iaaM）过量表达载体，以罗汉果雌株叶盘为材料，采用农杆菌介导法建立罗汉果高效遗传转化体系，转化和创制单性结实罗汉果种质，通过基因特异引物对的PCR扩增，初步检测出转基因阳性植株，将之移栽大田，观察转基因植株的单性结实性的表现。结果表明：构建罗汉果单性结实性相关的pBAI-Gus植物双元表达载体获得成功;建立了农杆菌介导的罗汉果叶盘遗传转化优化体系，即农杆菌菌液OD600值为0.3～0.5，侵染10 min，最优选择培养基为MS+TDZ 0.7 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+Kan 5 mg·L-1+Cef 300 mg·L-1;经PCR鉴定共获得4株转基因阳性雌株;将阳性植株扩繁后移栽田间，经田间调查发现，24株阳性扩繁植株中有5株正常开花，占总植株数的20.8%，且其子房未经人工授粉发育成幼果，表现单性结实性。在载体构建和农杆菌介导的罗汉果遗传转化体系优化的基础上，将外源单性结实相关嵌合基因整合进罗汉果基因组并得到表达，为后续研究单性结实罗汉果的遗传生理，创制转基因罗汉果单性结实新种质，以及克服其产业化中需要人工授粉和无籽化提供了理论和应用基础。
关键词： 罗汉果， 单性结实， 转基因， 遗传转化
中图分类号： Q943
文献标识码： A
文章编号： 1000-3142（2018）12-1614-12
Transformation of Siraitia grosvenorii with 2A11-iaaM gene
Zhou Qiong1， Hu Shanshan1， Hao Qinglin1， Mo Yanmei1， Li Gang2*， Tang Meiqiong2， Xin Jiajia1， Ning Yizhen1
（ 1. College of Agriculture， Guangxi University， Nanning 530004， China; 2. Guangxi Key Laboratory of Medicinal Resources Protection and Genetic Improvement， Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant， Nanning 530023， China ）
Abstract： To solve the seedless fruit and artificial pollination problems of Siraitia grosvenorii， we used pBI121-Gus to construct chimeric expression vector （pBI121-2A11-iaaM-Gus） with fruit specific promoter 2A11 and auxin synthesis key enzyme tryptophan monooxygenase enzyme gene iaaM. We took leaf disc of female plants as explants to study the antibiotics sensitivity， the impact of bacteriostatic in different concentrations of agrobacterium EHA105， and the different microbial infection time， to establish an efficient agrobacterium-mediated genetic transformation system of S. grosvenorii， and to create the parthenocarpy germplasm of S. grosvenorii. We also designed gene specific primers， and detected the positive plants by PCR technique and transplanted into the field， while recorded the hereditary characters of the transgenic plants. The results showed that the chimeric expression vector （pBI121-2A11-iaaM-Gus） related to parthenocarpy character of S. grosvenorii was successfully constructed， and the agrobacterium-mediated genetic transformation system of S. grosvenorii leaf disc was established. The optimal concentration of infection of agrobacterium tumefaciens was the OD600 value 0.3-0.5， while the optimal infection time was 10 min. And the optimal selective medium was with 5 mg·L-1 kanamycin and 300 mg·L-1 cefotaxime sodium. PCR results showed that four female plants of S. grosvenorii were tested positive. We propagated the four positive female plants in the plant tissue culture room and transplanting the propagated 24 positive female plants to the field. Then the field investigation showed that there were five female plants flowering normally with a proportion of 20.8%， and the S. grosvenorii young fruits which had not been artificially pollinated were observed， which suggested the parthenocarpy character was expressed. The study， integrating the exogenetic parthenocarpy gene into the S. grosvenorii genome and preliminarily expressed， based on expression vector construction and the agrobacterium-mediated genetic transformation system of S. grosvenorii， provides the information for the subsequent study of the genetic physiology， the creation of the transgenosis parthenocarpy germplasm of S. grosvenorii， and solving the seedless fruit and artificial pollination problems of S. grosvenorii. Key words： Siraitia grosvenorii， parthenocarpy， transgenosis， genetic transformation
中药材罗汉果（Siraitia grosvenorii）是葫芦科多年生宿根性草质藤本植物罗汉果 （Siraitia grosvenorii） 的干燥果实，具有提神生津、清热润肺、止咳定喘、滑肠通便等效用，是我国特有的药用和甜料经济作物，第一、第二批均被国家卫生部、中医药管理局列为药食同源品种（国家药典委员会，2015;李锋等，2010;张维等，2014）。现代药理、毒理研究表明，罗汉果具有抗炎、抗病毒、抗癌、抗氧化、免疫调节、保护肝脏、降低血脂等多种作用，却无毒副作用。罗汉果果实主要有效成份为葫芦烷四环三萜皂苷，以甜苷Ⅴ含量最高，约占总皂苷含量的20%，是世界上最强的非糖甜味物质之一，万分之一浓度时为5%蔗糖甜度的425倍，高甜、低热、天然、保健，具有广阔的开发前景和市场空间（Li et al，2014;秦莹莹和李啸红，2012）。但是，罗汉果具有雌雄异株的发育生物学特点，且花粉粘重而不利于风媒传粉，野生大黑蜂减少而影响栽培品种的虫媒传粉。在栽培生产中，需要大量人工授粉，才能获得经济效益，而自然条件下罗汉果花粉寿命短，通常需要在开花当天上午完成授粉，劳动成本高。因此，罗汉果栽培生产中迫切需要解决“如何免除人工授粉”的难题。此外，罗汉果的种子中不含甜苷而含有大量种油，不仅影响口感，又增加了提取纯化的难度以及加工成本。虽然已有三倍体无籽罗汉果研究的报道，但因果实小、生长期短等原因，迄今尚无可应用于生产的三倍体优良品种。因此，如何免除人工授粉和实现果实无籽化，是罗汉果产业化发展中亟待解决的技术难题。
单性结实是指子房不经受精而形成无籽果实的现象，与生长素信号、或赤霉素信号途径等有关（刘迪等，2008）。单性结实植株具有结实率高、品质优良、果实无籽、无畸形果、可稳定遗传等优势，是食用、加工和生产中追求的重要目标（Pandolfini et al，2002;毛自朝等，2002）。除了自然存在的可遗传的单性结实以外，还可以通过激素诱导、转基因技术等获得单性结实。在雌花开花的当天利用2，4-D涂抹罗汉果子房壁，也可刺激子房膨大，每隔8～10 d涂1次，共2～3次，还可得到与人工授粉大小相等的单性结实果实（李珍贞和邬辉平，1988）。但激素处理技术要求较高，浓度难以控制，容易產生畸形果，需要较多劳动力，还存在激素残留影响健康，故生产上不宜推广采用。培育单性结实罗汉果新种质不仅能克服其生产中迫切需要解决的人工授粉的主要难题，也能解决授粉带来的果实有籽难题，是罗汉果产业化发展和育种的最佳选择和热点前沿。
运用基因工程的方法，转入与内源激素代谢或信号转导相关的基因来创制单性结实，从而获得无籽果实，已经成为植物遗传工程的主要手段，在番茄、茄子、草莓、树莓和甜瓜等物种中获得转基因单性结实植株，但还没有关于罗汉果转基因单性结实的报道（陶炼，2013）。2A11启动子是来源于番茄的果实特异性表达启动子，具有良好的驱动外源基因组织特异性表达的启动子活性（Van Haaren & Catherine，1991;林炳英等，2006）。iaaM基因主要来源于根癌农杆菌和假单孢菌，编码色氨酸单加氧酶，可利用色氨酸合成吲哚乙酸，从而提高生长素含量，将iaaM与子房或幼果特异启动子组成的嵌合基因导入植物体中，使用其在开花期和果实发育早期表达，可诱导茄子、番茄等以果实为主要收获对象的植物的单性结实（荆风雪，2013;Rotino et al，1997;Ficcadenti et al，1999）。本研究拟在植物双元表达载体pBI121-Gus基础上，构建2A11-iaaM的过量表达载体，利用叶盘转化法，研究农杆菌介导的罗汉果遗传转化体系，创制转基因单性结实罗汉果雌性种质，为深入其遗传生理研究、品种培育等提供基础。
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与处理所用的材料取自种植于广西药用植物园实验基地的已开花的罗汉果雌株，选取幼嫩带有腋芽的罗汉果茎段，用75%酒精消毒30 s，0.1% HgCl2消毒10 min，无菌蒸馏水冲洗5次，之后用无菌滤纸吸干茎段表面水分，并将茎段接种于MS培养基中，置于恒温光照培养箱进行组织培养，设置温度为25 ℃，光照强度为2 000 lx，光照时间为12 h·d-1。由此获得的罗汉果无菌苗用于后续遗传转化实验。
载体构建及遗传转化所用pBI121-Gus植物双元表达载体、含pMD-2A11克隆子的大肠杆菌、含pMD-iaaM克隆子的大肠杆菌、根癌农杆菌EHA105均由广西药用植物园李刚副研究员提供。其中，2A11和iaaM分别是从樱桃番茄总DNA中克隆的果实特异启动子和从根癌农杆菌C58菌株DNA中克隆的生长素合素相关酶基因，启动子2A11上、下游特异性引物分别引入限制性核酸内切酶HindⅢ和Xba I酶切位点，经目标基因、载体等核酸序列分析，于iaaM基因上、下游特异性引物的5′端分别引入限制性核酸内切酶Xba I和Xma I酶切位点（表1）。前述各菌液（加少量甘油）保存于-80 ℃冰箱。
1.1.2 试剂和仪器试剂：胰蛋白胨、酵母提取物、蔗糖、琼脂、MS培养基（不含蔗糖）、6-BA、IBA、TDZ、NAA、乙酰丁香酮、头孢霉素、利福平、卡那霉素、氯仿、异戊醇、CTAB、PVP、β-巯基乙醇、质粒DNA小量抽提试剂盒等均购自上海生工;pMDTM19-T simple vector、限制性核酸内切酶Xba I、Xma I、HindⅢ和TaqTM购自Takara和Thermo;2×Es Taq MasterMix（含染料）购自北京康为世纪;引物合成及核酸测序由华大基因公司完成。仪器：移液枪（Eppendorf）、高速冷冻离心机（湘仪，TGL-16M）、PCR仪（BIO RAD，T100 Thermal Cycler）、电泳仪（DYY-10C）、（经济型）双人单面垂直净化工作台（SW-CJ-2D）、振荡培养箱（上海知楚，ZQZY-HC）、电热恒温培养箱（上海跃进，HH-B11·420S）、高压灭菌锅（ZEALWAY，G180T）、数显恒温水浴锅（金坛市盛威实验仪器厂）、紫外分光光度计等。 1.1.3 培养基选择培养基：MS+TDZ 0.7 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+Kan 5 mg·L-1+Cef 300 mg·L-1。愈伤组织诱导培养基：MS+TDZ 0.7 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1。愈伤组织分化培养基：MS+TDZ 0.7 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+GA30.5 mg·L-1+芸苔素内酯 0.5 mg·L-1。不定芽增殖培养基：MS+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1。生根培养基：MS+NAA 0.5 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1。
1.1.4 所用引物本研究中用到的所有引物如表1所示。
1.2 嵌合表达载体pBI121-2A11-iaaM的构建
1.2.1 载体和目的片段质粒提取将保存于-80 ℃冰箱的pBI121-Gus菌液接种到含50 μg·mL-1 Kan的LB液体培养基中，37 ℃恒温，200 r·min-1过夜振荡培养。用无菌接种环在超净工作台挑取上述菌液，并于含50 μg·mL-1 Kan的LB固体培养基上划线培养得出单菌落。用无菌枪头挑取单菌落进行扩大培养。pMD-2A11和pMD-iaaM菌液的扩大培养方法同上，其中LB培养基中加入的抗生素和抗生素浓度为50 μg·mL-1 Amp。按照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒（Sangon）说明书对上述扩大培养后的菌液进行质粒抽提，并取3 μL质粒DNA样品用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，观察质粒DNA提取的质量及完整性，用超微量紫外分光光度计测定DNA的浓度及纯度。
1.2.2 pBI121-Gus与2A11的连接由于iaaM基因序列内含HindⅢ限制性酶切位点，所以载体构建中，先连接启动子2A11，再连接目的基因iaaM。pMD-2A11质粒和pBI121-Gus质粒双酶切反应使用Xba I和HindⅢ限制性内切酶，反应条件为37 ℃ 2 h，酶切反应体系见表2。将上述酶切反应产物分别进行切胶回收目的片段和载体片段，并检测回收片段的质量和浓度。配制连接反应体系：10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 μL，目的基因 4.5 μL，載体1.5 μL，T4 DNA Ligase（350 U·μL-1） 1.5 μL，加水至总体积20 μL，16 ℃水浴连接过夜。
将连接产物转化DH5α感受态细胞，常规涂板于含有IPTG、X-gal和Kan（50 μg·mL-1）的LB固体平板培养基上（按《分子克隆》中相应说明操作），培养过夜，随机挑取转化平板的白色单菌落于加有Kan 50 μg·mL-1的LB液体培养基上中，37 ℃恒温，200 r·min-1摇床培养过夜;通过菌液PCR鉴定阳性克隆，将阳性克隆的菌斑提取质粒，酶切检测再次确定阳性克隆菌斑，得到具有目的基因的中间表达载体pBI121-2A11。
1.2.3 iaaM和中间载体pBI121-2A11的连接pMD-iaaM质粒和pBI121-2A11质粒双酶切反应使用Xba I和Xma I限制性内切酶，反应温度为37 ℃，反应体系见表3，连接方法同1.2.2。得到嵌合表达载体pBI121-2A11-iaaM。设计引物对（跨启动子和目的基因全长）AI1F和AI1R，用于后续PCR检测。采用AI1F和AI1R引物对一次性扩增出包含2A11和iaaM基因的序列，做T克隆，送去华大基因测序公司测序，测序所得序列在GenBank数据库进行Blast比对、分析，证实无误后用于后续实验。
1.3 遗传转化体系的优化-
1.3.1 抗生素Kan敏感性试验分别配制含有不同浓度 （0、2、4、6、8、10、13、16、20、30 mg·L-1）Kan的愈伤组织诱导培养基，将预培养4 d的罗汉果叶盘进行接种，每个试验接种8瓶，每瓶接种10个叶盘。置于恒温光照培养箱，设置培养条件：温度25 ℃，光照强度2 000 lx，光照时间12 h·d-1，培养25 d后记录叶盘生长情况。-
1.3.2 抗生素Cef抑菌试验分别配制含有不同浓度 （0、50、100、200、300、400、500 mg·L-1） Cef的愈伤组织诱导培养基，将经过相同预培养和共培养操作的罗汉果叶盘用无菌水清洗以后进行接种，
每个试验接种8瓶，每瓶接种10个叶盘。置于恒温光照培养箱，设置培养条件：温度25 ℃，光照强度2 000 lx，光照时间12 h·d-1，培养两周后记录叶盘生长情况。-
1.3.3 农杆菌侵染菌液浓度的确立取3 mL振荡培养后的农杆菌菌液，于紫外分光光度计下测定OD600值，并稀释为不同OD600（0.1、0.3、0.5、0.7）的菌液，分别对预培养4 d的罗汉果叶盘进行相同时间的侵染，将侵染后的叶盘接种至愈伤组织诱导培养基（含100 μmol AS），每个试验接种3瓶，每瓶接种20个叶盘。置于黑暗条件下共培养3 d后，进行选择培养，设置培养条件：温度25 ℃，光照强度2 000 lx，光照时间12 h·d-1，培养两周后记录叶盘生长情况。-
1.3.4 农杆菌侵染时间的确立用相同浓度的农杆菌菌液对预培养4 d的罗汉果叶盘进行侵染，侵染时间分别为5、10、15、20、25 min，将侵染后的叶盘接种至愈伤组织诱导培养基（含100 μmol AS），每个试验接种3瓶，每瓶接种20个叶盘。置于黑暗条件下共培养3 d后，进行选择培养，设置培养条件：温度25 ℃，光照强度2 000 lx，光照时间12 h·d-1，培养两周后记录叶盘生长情况。 1.4 pBI121-2A11-iaaM基因对罗汉果的转化-
1.4.1 罗汉果雌株叶盘的准备与预培养将罗汉果雌株无菌叶片用灭过菌的打孔器打出直径约0.5 cm的小圆片，划伤叶背面及叶脉，接种在叶片愈伤组织诱导培养基上，并使伤口充分接触培养基表面。黑暗条件下预培养4 d，直至叶盘周边表现卷曲、上翘、膨大并产生颗粒状愈伤。-
1.4.2 载体菌液准备从-80 ℃冰箱取出已转入pBI121-2A11-iaaM基因的农杆菌菌液，在附加50 μg·mL-1 Kan、20 μg·mL-1 rif的YEB固体平板上进行划线，28 ℃培养48 h;挑取单菌落，接种到10 mL附加50 μg·mL-1 Kan、20 μg·mL-1 rif的YEB液体培养基中，28 ℃，200 r·min-1振荡培养48 h;取上述菌液1 mL加入50 mL新配制的无抗生素的YEB液体培养基，同时加入100 μmol的AS，28 ℃，200 r·min-1培养6 h左右，使得菌液OD600为0.3～0.5时即可用于侵染。-
1.4.3 侵染于超净工作台上，将预培养4 d的罗汉果叶盘接种到上述准备的载体菌液中，28 ℃，150 r·min-1浸泡10 min;迅速取出叶盘并用无菌滤纸吸去附着的菌液;将侵染过的罗汉果叶盘接种在叶片愈伤组织诱导培养基（含100 μmol AS）上，黑暗条件下共培养3 d。-
1.4.4 选择培养用无菌水清洗经过共培养的罗汉果叶盘，无菌滤纸吸干后接种到叶片愈伤组织诱导培养基（含5 mg·L-1 Kan、300 mg·L-1 Cef）上，光照条件下进行选择培养;将经过选择培养2周后的罗汉果叶盘用无菌水清洗后，接种到叶片愈伤组织分化培养基（含5 mg·L-1 Kan、100 mg·L-1 Cef）上，光照条件下进行继代选择培养，直至开始分化产生不定芽。-
1.4.5 不定芽增殖培养将经过继代选择培养后产生不定芽的愈伤组织转接至含5 mg·L-1 Kan、100 mg·L-1 Cef的不定芽增殖培养基，光照条件下进行培养。-
1.4.6 生根培养待不定芽生长的长度在2 cm以上时，切下并插入含5 mg·L-1 Kan、100 mg·L-1 Cef的生根培养基中，在光照条件下进行培养，2周左右长出不定根。
1.5 分子检测
采用CTAB法微量提取已生出不定根的植株的部分茎叶，利用设计出的特异引物（表1）扩增目的片段。PCR扩增反应体系：0.5 μL DNA，5 μL 2×Es Taq MasterMix，0.4 μL引物F/R，加水至总体
系10 μL。PCR扩增反应条件：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，55～60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行30个循环;72 ℃ 8～10 min;4 ℃保存。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，并在凝胶成像系统中成像。
本研究设计了三套特异引物共同用于PCR扩增检测转基因阳性植株（表1），目的在于提高PCR检测阳性植株的准确性，使检测结果更具可靠性。其中，2A11 F/R是针对果实特异启动子2A11序列设计的特异引物，iaaM F/R是针对单性结实基因iaaM序列设计的特异引物，AI CF/R是同时跨部分目的基因和部分启动子序列设计的特异引物。
1.6 田间调查
将经过PCR检测呈阳性的拟转基因植株进行扩繁，生根之后先于网室大棚环境中炼苗5～7 d;再转移至营养钵中生长20 d左右，使得组培苗充分适应外界环境条件;最后移栽大棚，观察记录性状表现。
2结果与分析
2.1 pBI121-Gus与2A11的连接
选择Hind Ⅲ 和Xba I分别对pBI121-Gus和pMD-2A11进行酶切，分别切去pBI121-Gus的CaMV35S启动子回收大片段线性化植物双元表达载体，切去pMD 19-T载体回收小片段2A11，将2A11连接进pBI121-Gus载体后的图谱见图1。其中，2A11质粒的双酶切结果得出1 300 bp左右的目的片段和2 700 bp左右的pMD 19-T simple vector片段（圖2）。将2A11与线性化pBI121-Gus连接后，转化感受态大肠杆菌DH5α，涂板，在蓝白筛选平板上挑取8个菌斑，经过PCR检测（图3），这8个菌斑全为阳性，选择1，2，3号菌斑做双酶切验证，结果均为阳性。
2.2 iaaM和中间载体pBI121-2A11的连接
iaaM基因与中间载体pBI121-2A11连接转化后挑取8个菌斑，经过PCR检测和双酶切验证得出2个阳性菌斑。测序所得序列在GenBank数据库进行Blast比对，结果显示启动子片段2A11基因序列和目标基因片段iaaM基因序列与已报道的2A11和iaaM基因序列，同源性都为99%，可编码相应蛋白序列。构建好的嵌合载体pBI121-2A11-iaaM图谱如图4所示。
2.3 抗生素Kan敏感性试验
罗汉果叶盘对抗生素Kan的敏感性试验结果如表4。从表4可见，罗汉果叶盘的持绿率和出芽率随着Kan浓度增加而降低，芽的分化和生长也随之缓慢直至停止萎蔫。罗汉果叶盘的持绿率自Kan浓度高于4 mg·L-1起开始下降，而出芽率在Kan浓度低于6 mg·L-1时均维持在较高水平，过高的Kan浓度会影响转化细胞的正常生长分化，浓度过低又难以起到筛选作用。由此可判断，罗汉果叶盘分化出芽过程对抗生素Kan的选择压为5 mg·L-1。 2.4 抗生素Cef抑菌试验
由表5可知，罗汉果叶盘的污染率和出芽率随
着Cef浓度的增加而降低，且Cef的浓度为300～500 mg·L-1时，污染率为0，抑菌效果最佳，同时在此浓度范围内，Cef浓度为300 mg·L-1时，罗汉果叶盘的出芽率相对较高。过低的Cef浓度难以抑菌，过高的Cef浓度又会抑制出芽。由此可判断，抗生素Cef抑制罗汉果叶盘感染农杆菌的最佳浓度为300 mg·L-1。
2.5 农杆菌侵染菌液浓度的确立
由表6可知，罗汉果叶盘的污染率随着农杆菌菌液浓度的增加而升高，同時罗汉果叶盘的出芽率随着农杆菌菌液浓度的增加而降低。过高的农杆菌菌液浓度（OD600=0.7），会导致罗汉果叶盘污染严重，不能分化出芽;过低的农杆菌菌液浓度（OD600=0.1），则会影响转化的效率。由此可判断，农杆菌用于侵染时的菌液OD600值最好为0.3～0.5。
2.6 农杆菌侵染时间的确立
由表7可知，罗汉果叶盘的污染率随农杆菌侵染时间的增加而升高，同时罗汉果叶盘的出芽率随农杆菌侵染时间的增加而降低。当农杆菌侵染时间超过15 min，会导致罗汉果叶盘污染严重，不能分化出芽;而农杆菌侵染时间过短，又会影响遗传转化的效率。由此可判断，农杆菌用于侵染时的最佳时间为10 min。
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2.7 罗汉果叶盘的再生组织培养
图5显示了罗汉果叶盘经侵染之后的共培养情况、愈伤组织诱导情况、分化出芽情况以及生根培养情况。调查统计发现，在已优化罗汉果遗传转化体系的基础上，对罗汉果叶盘进行农杆菌转化及后续组织培养。由此可看出，罗汉果叶盘侵染之后颜色鲜绿，长势良好，分化出芽情况正常。
2.8 转化植株的分子检测
经过农杆菌介导转化和抗性培养基筛选培养，共得到15个抗性芽，转接至生根培养基培养30 d后，采用CTAB法微量提取植株部分茎叶DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，结果如图6所示。根据特异引物（表1）进行PCR检测扩增目的片段，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，综合三套特异引物的检测结果，结果显示共有4株转化植株扩增出目的条带（图7）。
2.9 田间调查
将PCR检测呈阳性的拟转基因植株扩繁生根后移栽大棚，观察记录性状表现。结果显示，扩繁之后的24株拟转基因阳性植株在营养生长时期长势良好，叶色鲜绿，叶型正常。在开花期有5株拟转基因植株正常开花，占总植株数的20.8%，且开花植株的子房在挂果期未经授粉即发育成果实，表现单性结实性。对转基因单性结实的罗汉果果实和正常人工授粉得到的罗汉果果实，在果实发育75 d后分别随机取样10个，统计果实的横径、纵径、重量以及种子情况（表8），果实的纵剖手工切片照片见图8。结果显示，转基因单性结实果实比正常人工授粉果实具有果形小、种子数极少且不具种仁等特点。有关转基因单性结实果实发育品质的形成、遗传生理规律以及大量转化苗的鉴定、筛选工作仍在进一步的研究之中。
3讨论
本研究将嵌合有果实特异启动子2A11与生长素合成相关基因iaaM连入pBI121-Gus，成功构建了pBI121-2A11-iaaM-Gus过量表达载体，并建立和优化了根癌农杆菌介导的以罗汉果叶片为受体的遗传转化体系。首先，以预培养4 d的罗汉果叶盘接种到OD600值为0.3～0.5，含100 μmol的AS的农杆菌菌液中，侵染10 min，迅速取出叶盘并用无菌滤纸吸去附着的菌液; 将侵染过的罗汉果叶
盘接种在叶片愈伤组织诱导培养基（含100 μmol AS）上，黑暗条件下共培养3 d;选择培养基：MS+TDZ 0.7 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+Kan 5 mg·L-1+Cef 300 mg·L-1。然后，经过不定芽增殖、壮苗培养后，进行分子鉴定。
本研究前期受体预实验表明，罗汉果种子苗胚轴可经过体细胞胚性愈伤发生途径成苗，但因性别鉴定困难，所以采用罗汉果雌株叶片为受体。叶盘转化法是Horsch et al（1985）建立的一种简便有效的植物遗传转化方法，最高转化频率达15%，是目前双子叶植物较为常用的转化技术，但得到的转化体有可能是嵌合体（王蕾，2007）。罗汉果叶片经胚性愈伤发生途径成苗困难，所以，遗传转化后采用器官发生途径直接成苗，转化后的植株多细胞起源，存在嵌合现象，为此，实验中采用分子生物学技术进行两次鉴定，即在对增殖芽第一次鉴定后，取芽尖扩繁，再进行第二次鉴定。PCR扩增技术作为一种快捷、灵敏的基因检测方法，能够简便有效地确定已整合进外源基因的植株，但PCR的检测结果容易出现假阳性。为获得更可靠的实验结果，本研究在对转化植株进行PCR检测时，同时使用了2A11、iaaM以及跨2A11和iaaM部分序列的嵌合基因的三套特异引物进行检测。
本研究根据经验， 自然条件下若无人工辅助授
粉，栽培罗汉果极少因虫媒或风媒等原因结出果实，通常被认为与栽培罗汉果蜜腺退化、大黑蜂减少、花粉粘重等因素有关;但严谨起见，为防止罗汉果开花期间虫媒或风媒传粉的干扰，实验安排将经过分子鉴定为阳性的拟转基因植株种植于孔径1 mm见方的网室大棚中，且仅种有罗汉果雌株（附近没有罗汉果雄株），既从源头上杜绝了罗汉果雄花花粉来源，也在一定程度上防止了昆虫传授异源花粉引起的干扰。
经分子鉴定所得转基因罗汉果阳性植株，部分正常开花，并不经授粉而长成小果，由于T0代转基因罗汉果受病毒影响较重，转入基因的表达、其内源激素含量、单性结实性等可能受到影响。利用单性结实品种，由于不需要种植雄株以提供花粉，可以增加单位面积上雌株的植株数而提高产量。单性结实品种能克服低温、弱光、授粉困难等，具有较强的适应性和种植范围， 果实使用加工 方便，市场前景好（Hazra & Dutta，2010;Yan，2010;Shabtai，2007）。研究表明，转基因单性结实番茄果实的品质没有异常变化（Rotino，2005），利用CPPU诱导的甜瓜单性结实果实中蔗糖和果糖比有籽果中含量高（Li，2011）。单性结实基本代谢谱没有改变，是其结构、风味和营养没有显著变化的主要原因（Picone，2011）。转基因单性结实罗汉果的单性结实性、品质、产量、适应性、次生代谢等表现如何尚有待进一步研究。
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关键词： 罗汉果， 单性结实， 转基因， 遗传转化
中图分类号： Q943
文献标识码： A
文章编号： 1000-3142（2018）12-1614-12
Transformation of Siraitia grosvenorii with 2A11-iaaM gene
Zhou Qiong1， Hu Shanshan1， Hao Qinglin1， Mo Yanmei1， Li Gang2*， Tang Meiqiong2， Xin Jiajia1， Ning Yizhen1
（ 1. College of Agriculture， Guangxi University， Nanning 530004， China; 2. Guangxi Key Laboratory of Medicinal Resources Protection and Genetic Improvement， Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant， Nanning 530023， China ）
Abstract： To solve the seedless fruit and artificial pollination problems of Siraitia grosvenorii， we used pBI121-Gus to construct chimeric expression vector （pBI121-2A11-iaaM-Gus） with fruit specific promoter 2A11 and auxin synthesis key enzyme tryptophan monooxygenase enzyme gene iaaM. We took leaf disc of female plants as explants to study the antibiotics sensitivity， the impact of bacteriostatic in different concentrations of agrobacterium EHA105， and the different microbial infection time， to establish an efficient agrobacterium-mediated genetic transformation system of S. grosvenorii， and to create the parthenocarpy germplasm of S. grosvenorii. We also designed gene specific primers， and detected the positive plants by PCR technique and transplanted into the field， while recorded the hereditary characters of the transgenic plants. The results showed that the chimeric expression vector （pBI121-2A11-iaaM-Gus） related to parthenocarpy character of S. grosvenorii was successfully constructed， and the agrobacterium-mediated genetic transformation system of S. grosvenorii leaf disc was established. The optimal concentration of infection of agrobacterium tumefaciens was the OD600 value 0.3-0.5， while the optimal infection time was 10 min. And the optimal selective medium was with 5 mg·L-1 kanamycin and 300 mg·L-1 cefotaxime sodium. PCR results showed that four female plants of S. grosvenorii were tested positive. We propagated the four positive female plants in the plant tissue culture room and transplanting the propagated 24 positive female plants to the field. Then the field investigation showed that there were five female plants flowering normally with a proportion of 20.8%， and the S. grosvenorii young fruits which had not been artificially pollinated were observed， which suggested the parthenocarpy character was expressed. The study， integrating the exogenetic parthenocarpy gene into the S. grosvenorii genome and preliminarily expressed， based on expression vector construction and the agrobacterium-mediated genetic transformation system of S. grosvenorii， provides the information for the subsequent study of the genetic physiology， the creation of the transgenosis parthenocarpy germplasm of S. grosvenorii， and solving the seedless fruit and artificial pollination problems of S. grosvenorii. Key words： Siraitia grosvenorii， parthenocarpy， transgenosis， genetic transformation
中药材罗汉果（Siraitia grosvenorii）是葫芦科多年生宿根性草质藤本植物罗汉果 （Siraitia grosvenorii） 的干燥果实，具有提神生津、清热润肺、止咳定喘、滑肠通便等效用，是我国特有的药用和甜料经济作物，第一、第二批均被国家卫生部、中医药管理局列为药食同源品种（国家药典委员会，2015;李锋等，2010;张维等，2014）。现代药理、毒理研究表明，罗汉果具有抗炎、抗病毒、抗癌、抗氧化、免疫调节、保护肝脏、降低血脂等多种作用，却无毒副作用。罗汉果果实主要有效成份为葫芦烷四环三萜皂苷，以甜苷Ⅴ含量最高，约占总皂苷含量的20%，是世界上最强的非糖甜味物质之一，万分之一浓度时为5%蔗糖甜度的425倍，高甜、低热、天然、保健，具有广阔的开发前景和市场空间（Li et al，2014;秦莹莹和李啸红，2012）。但是，罗汉果具有雌雄异株的发育生物学特点，且花粉粘重而不利于风媒传粉，野生大黑蜂减少而影响栽培品种的虫媒传粉。在栽培生产中，需要大量人工授粉，才能获得经济效益，而自然条件下罗汉果花粉寿命短，通常需要在开花当天上午完成授粉，劳动成本高。因此，罗汉果栽培生产中迫切需要解决“如何免除人工授粉”的难题。此外，罗汉果的种子中不含甜苷而含有大量种油，不仅影响口感，又增加了提取纯化的难度以及加工成本。虽然已有三倍体无籽罗汉果研究的报道，但因果实小、生长期短等原因，迄今尚无可应用于生产的三倍体优良品种。因此，如何免除人工授粉和实现果实无籽化，是罗汉果产业化发展中亟待解决的技术难题。
单性结实是指子房不经受精而形成无籽果实的现象，与生长素信号、或赤霉素信号途径等有关（刘迪等，2008）。单性结实植株具有结实率高、品质优良、果实无籽、无畸形果、可稳定遗传等优势，是食用、加工和生产中追求的重要目标（Pandolfini et al，2002;毛自朝等，2002）。除了自然存在的可遗传的单性结实以外，还可以通过激素诱导、转基因技术等获得单性结实。在雌花开花的当天利用2，4-D涂抹罗汉果子房壁，也可刺激子房膨大，每隔8～10 d涂1次，共2～3次，还可得到与人工授粉大小相等的单性结实果实（李珍贞和邬辉平，1988）。但激素处理技术要求较高，浓度难以控制，容易產生畸形果，需要较多劳动力，还存在激素残留影响健康，故生产上不宜推广采用。培育单性结实罗汉果新种质不仅能克服其生产中迫切需要解决的人工授粉的主要难题，也能解决授粉带来的果实有籽难题，是罗汉果产业化发展和育种的最佳选择和热点前沿。
运用基因工程的方法，转入与内源激素代谢或信号转导相关的基因来创制单性结实，从而获得无籽果实，已经成为植物遗传工程的主要手段，在番茄、茄子、草莓、树莓和甜瓜等物种中获得转基因单性结实植株，但还没有关于罗汉果转基因单性结实的报道（陶炼，2013）。2A11启动子是来源于番茄的果实特异性表达启动子，具有良好的驱动外源基因组织特异性表达的启动子活性（Van Haaren & Catherine，1991;林炳英等，2006）。iaaM基因主要来源于根癌农杆菌和假单孢菌，编码色氨酸单加氧酶，可利用色氨酸合成吲哚乙酸，从而提高生长素含量，将iaaM与子房或幼果特异启动子组成的嵌合基因导入植物体中，使用其在开花期和果实发育早期表达，可诱导茄子、番茄等以果实为主要收获对象的植物的单性结实（荆风雪，2013;Rotino et al，1997;Ficcadenti et al，1999）。本研究拟在植物双元表达载体pBI121-Gus基础上，构建2A11-iaaM的过量表达载体，利用叶盘转化法，研究农杆菌介导的罗汉果遗传转化体系，创制转基因单性结实罗汉果雌性种质，为深入其遗传生理研究、品种培育等提供基础。
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与处理所用的材料取自种植于广西药用植物园实验基地的已开花的罗汉果雌株，选取幼嫩带有腋芽的罗汉果茎段，用75%酒精消毒30 s，0.1% HgCl2消毒10 min，无菌蒸馏水冲洗5次，之后用无菌滤纸吸干茎段表面水分，并将茎段接种于MS培养基中，置于恒温光照培养箱进行组织培养，设置温度为25 ℃，光照强度为2 000 lx，光照时间为12 h·d-1。由此获得的罗汉果无菌苗用于后续遗传转化实验。
载体构建及遗传转化所用pBI121-Gus植物双元表达载体、含pMD-2A11克隆子的大肠杆菌、含pMD-iaaM克隆子的大肠杆菌、根癌农杆菌EHA105均由广西药用植物园李刚副研究员提供。其中，2A11和iaaM分别是从樱桃番茄总DNA中克隆的果实特异启动子和从根癌农杆菌C58菌株DNA中克隆的生长素合素相关酶基因，启动子2A11上、下游特异性引物分别引入限制性核酸内切酶HindⅢ和Xba I酶切位点，经目标基因、载体等核酸序列分析，于iaaM基因上、下游特异性引物的5′端分别引入限制性核酸内切酶Xba I和Xma I酶切位点（表1）。前述各菌液（加少量甘油）保存于-80 ℃冰箱。
1.1.2 试剂和仪器试剂：胰蛋白胨、酵母提取物、蔗糖、琼脂、MS培养基（不含蔗糖）、6-BA、IBA、TDZ、NAA、乙酰丁香酮、头孢霉素、利福平、卡那霉素、氯仿、异戊醇、CTAB、PVP、β-巯基乙醇、质粒DNA小量抽提试剂盒等均购自上海生工;pMDTM19-T simple vector、限制性核酸内切酶Xba I、Xma I、HindⅢ和TaqTM购自Takara和Thermo;2×Es Taq MasterMix（含染料）购自北京康为世纪;引物合成及核酸测序由华大基因公司完成。仪器：移液枪（Eppendorf）、高速冷冻离心机（湘仪，TGL-16M）、PCR仪（BIO RAD，T100 Thermal Cycler）、电泳仪（DYY-10C）、（经济型）双人单面垂直净化工作台（SW-CJ-2D）、振荡培养箱（上海知楚，ZQZY-HC）、电热恒温培养箱（上海跃进，HH-B11·420S）、高压灭菌锅（ZEALWAY，G180T）、数显恒温水浴锅（金坛市盛威实验仪器厂）、紫外分光光度计等。 1.1.3 培养基选择培养基：MS+TDZ 0.7 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+Kan 5 mg·L-1+Cef 300 mg·L-1。愈伤组织诱导培养基：MS+TDZ 0.7 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1。愈伤组织分化培养基：MS+TDZ 0.7 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+GA30.5 mg·L-1+芸苔素内酯 0.5 mg·L-1。不定芽增殖培养基：MS+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1。生根培养基：MS+NAA 0.5 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1。
1.1.4 所用引物本研究中用到的所有引物如表1所示。
1.2 嵌合表达载体pBI121-2A11-iaaM的构建
1.2.1 载体和目的片段质粒提取将保存于-80 ℃冰箱的pBI121-Gus菌液接种到含50 μg·mL-1 Kan的LB液体培养基中，37 ℃恒温，200 r·min-1过夜振荡培养。用无菌接种环在超净工作台挑取上述菌液，并于含50 μg·mL-1 Kan的LB固体培养基上划线培养得出单菌落。用无菌枪头挑取单菌落进行扩大培养。pMD-2A11和pMD-iaaM菌液的扩大培养方法同上，其中LB培养基中加入的抗生素和抗生素浓度为50 μg·mL-1 Amp。按照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒（Sangon）说明书对上述扩大培养后的菌液进行质粒抽提，并取3 μL质粒DNA样品用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，观察质粒DNA提取的质量及完整性，用超微量紫外分光光度计测定DNA的浓度及纯度。
1.2.2 pBI121-Gus与2A11的连接由于iaaM基因序列内含HindⅢ限制性酶切位点，所以载体构建中，先连接启动子2A11，再连接目的基因iaaM。pMD-2A11质粒和pBI121-Gus质粒双酶切反应使用Xba I和HindⅢ限制性内切酶，反应条件为37 ℃ 2 h，酶切反应体系见表2。将上述酶切反应产物分别进行切胶回收目的片段和载体片段，并检测回收片段的质量和浓度。配制连接反应体系：10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 μL，目的基因 4.5 μL，載体1.5 μL，T4 DNA Ligase（350 U·μL-1） 1.5 μL，加水至总体积20 μL，16 ℃水浴连接过夜。
将连接产物转化DH5α感受态细胞，常规涂板于含有IPTG、X-gal和Kan（50 μg·mL-1）的LB固体平板培养基上（按《分子克隆》中相应说明操作），培养过夜，随机挑取转化平板的白色单菌落于加有Kan 50 μg·mL-1的LB液体培养基上中，37 ℃恒温，200 r·min-1摇床培养过夜;通过菌液PCR鉴定阳性克隆，将阳性克隆的菌斑提取质粒，酶切检测再次确定阳性克隆菌斑，得到具有目的基因的中间表达载体pBI121-2A11。
1.2.3 iaaM和中间载体pBI121-2A11的连接pMD-iaaM质粒和pBI121-2A11质粒双酶切反应使用Xba I和Xma I限制性内切酶，反应温度为37 ℃，反应体系见表3，连接方法同1.2.2。得到嵌合表达载体pBI121-2A11-iaaM。设计引物对（跨启动子和目的基因全长）AI1F和AI1R，用于后续PCR检测。采用AI1F和AI1R引物对一次性扩增出包含2A11和iaaM基因的序列，做T克隆，送去华大基因测序公司测序，测序所得序列在GenBank数据库进行Blast比对、分析，证实无误后用于后续实验。
1.3 遗传转化体系的优化-
1.3.1 抗生素Kan敏感性试验分别配制含有不同浓度 （0、2、4、6、8、10、13、16、20、30 mg·L-1）Kan的愈伤组织诱导培养基，将预培养4 d的罗汉果叶盘进行接种，每个试验接种8瓶，每瓶接种10个叶盘。置于恒温光照培养箱，设置培养条件：温度25 ℃，光照强度2 000 lx，光照时间12 h·d-1，培养25 d后记录叶盘生长情况。-
1.3.2 抗生素Cef抑菌试验分别配制含有不同浓度 （0、50、100、200、300、400、500 mg·L-1） Cef的愈伤组织诱导培养基，将经过相同预培养和共培养操作的罗汉果叶盘用无菌水清洗以后进行接种，
每个试验接种8瓶，每瓶接种10个叶盘。置于恒温光照培养箱，设置培养条件：温度25 ℃，光照强度2 000 lx，光照时间12 h·d-1，培养两周后记录叶盘生长情况。-
1.3.3 农杆菌侵染菌液浓度的确立取3 mL振荡培养后的农杆菌菌液，于紫外分光光度计下测定OD600值，并稀释为不同OD600（0.1、0.3、0.5、0.7）的菌液，分别对预培养4 d的罗汉果叶盘进行相同时间的侵染，将侵染后的叶盘接种至愈伤组织诱导培养基（含100 μmol AS），每个试验接种3瓶，每瓶接种20个叶盘。置于黑暗条件下共培养3 d后，进行选择培养，设置培养条件：温度25 ℃，光照强度2 000 lx，光照时间12 h·d-1，培养两周后记录叶盘生长情况。-
1.3.4 农杆菌侵染时间的确立用相同浓度的农杆菌菌液对预培养4 d的罗汉果叶盘进行侵染，侵染时间分别为5、10、15、20、25 min，将侵染后的叶盘接种至愈伤组织诱导培养基（含100 μmol AS），每个试验接种3瓶，每瓶接种20个叶盘。置于黑暗条件下共培养3 d后，进行选择培养，设置培养条件：温度25 ℃，光照强度2 000 lx，光照时间12 h·d-1，培养两周后记录叶盘生长情况。 1.4 pBI121-2A11-iaaM基因对罗汉果的转化-
1.4.1 罗汉果雌株叶盘的准备与预培养将罗汉果雌株无菌叶片用灭过菌的打孔器打出直径约0.5 cm的小圆片，划伤叶背面及叶脉，接种在叶片愈伤组织诱导培养基上，并使伤口充分接触培养基表面。黑暗条件下预培养4 d，直至叶盘周边表现卷曲、上翘、膨大并产生颗粒状愈伤。-
1.4.2 载体菌液准备从-80 ℃冰箱取出已转入pBI121-2A11-iaaM基因的农杆菌菌液，在附加50 μg·mL-1 Kan、20 μg·mL-1 rif的YEB固体平板上进行划线，28 ℃培养48 h;挑取单菌落，接种到10 mL附加50 μg·mL-1 Kan、20 μg·mL-1 rif的YEB液体培养基中，28 ℃，200 r·min-1振荡培养48 h;取上述菌液1 mL加入50 mL新配制的无抗生素的YEB液体培养基，同时加入100 μmol的AS，28 ℃，200 r·min-1培养6 h左右，使得菌液OD600为0.3～0.5时即可用于侵染。-
1.4.3 侵染于超净工作台上，将预培养4 d的罗汉果叶盘接种到上述准备的载体菌液中，28 ℃，150 r·min-1浸泡10 min;迅速取出叶盘并用无菌滤纸吸去附着的菌液;将侵染过的罗汉果叶盘接种在叶片愈伤组织诱导培养基（含100 μmol AS）上，黑暗条件下共培养3 d。-
1.4.4 选择培养用无菌水清洗经过共培养的罗汉果叶盘，无菌滤纸吸干后接种到叶片愈伤组织诱导培养基（含5 mg·L-1 Kan、300 mg·L-1 Cef）上，光照条件下进行选择培养;将经过选择培养2周后的罗汉果叶盘用无菌水清洗后，接种到叶片愈伤组织分化培养基（含5 mg·L-1 Kan、100 mg·L-1 Cef）上，光照条件下进行继代选择培养，直至开始分化产生不定芽。-
1.4.5 不定芽增殖培养将经过继代选择培养后产生不定芽的愈伤组织转接至含5 mg·L-1 Kan、100 mg·L-1 Cef的不定芽增殖培养基，光照条件下进行培养。-
1.4.6 生根培养待不定芽生长的长度在2 cm以上时，切下并插入含5 mg·L-1 Kan、100 mg·L-1 Cef的生根培养基中，在光照条件下进行培养，2周左右长出不定根。
1.5 分子检测
采用CTAB法微量提取已生出不定根的植株的部分茎叶，利用设计出的特异引物（表1）扩增目的片段。PCR扩增反应体系：0.5 μL DNA，5 μL 2×Es Taq MasterMix，0.4 μL引物F/R，加水至总体
系10 μL。PCR扩增反应条件：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，55～60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行30个循环;72 ℃ 8～10 min;4 ℃保存。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，并在凝胶成像系统中成像。
本研究设计了三套特异引物共同用于PCR扩增检测转基因阳性植株（表1），目的在于提高PCR检测阳性植株的准确性，使检测结果更具可靠性。其中，2A11 F/R是针对果实特异启动子2A11序列设计的特异引物，iaaM F/R是针对单性结实基因iaaM序列设计的特异引物，AI CF/R是同时跨部分目的基因和部分启动子序列设计的特异引物。
1.6 田间调查
将经过PCR检测呈阳性的拟转基因植株进行扩繁，生根之后先于网室大棚环境中炼苗5～7 d;再转移至营养钵中生长20 d左右，使得组培苗充分适应外界环境条件;最后移栽大棚，观察记录性状表现。
2结果与分析
2.1 pBI121-Gus与2A11的连接
选择Hind Ⅲ 和Xba I分别对pBI121-Gus和pMD-2A11进行酶切，分别切去pBI121-Gus的CaMV35S启动子回收大片段线性化植物双元表达载体，切去pMD 19-T载体回收小片段2A11，将2A11连接进pBI121-Gus载体后的图谱见图1。其中，2A11质粒的双酶切结果得出1 300 bp左右的目的片段和2 700 bp左右的pMD 19-T simple vector片段（圖2）。将2A11与线性化pBI121-Gus连接后，转化感受态大肠杆菌DH5α，涂板，在蓝白筛选平板上挑取8个菌斑，经过PCR检测（图3），这8个菌斑全为阳性，选择1，2，3号菌斑做双酶切验证，结果均为阳性。
2.2 iaaM和中间载体pBI121-2A11的连接
iaaM基因与中间载体pBI121-2A11连接转化后挑取8个菌斑，经过PCR检测和双酶切验证得出2个阳性菌斑。测序所得序列在GenBank数据库进行Blast比对，结果显示启动子片段2A11基因序列和目标基因片段iaaM基因序列与已报道的2A11和iaaM基因序列，同源性都为99%，可编码相应蛋白序列。构建好的嵌合载体pBI121-2A11-iaaM图谱如图4所示。
2.3 抗生素Kan敏感性试验
罗汉果叶盘对抗生素Kan的敏感性试验结果如表4。从表4可见，罗汉果叶盘的持绿率和出芽率随着Kan浓度增加而降低，芽的分化和生长也随之缓慢直至停止萎蔫。罗汉果叶盘的持绿率自Kan浓度高于4 mg·L-1起开始下降，而出芽率在Kan浓度低于6 mg·L-1时均维持在较高水平，过高的Kan浓度会影响转化细胞的正常生长分化，浓度过低又难以起到筛选作用。由此可判断，罗汉果叶盘分化出芽过程对抗生素Kan的选择压为5 mg·L-1。 2.4 抗生素Cef抑菌试验
由表5可知，罗汉果叶盘的污染率和出芽率随
着Cef浓度的增加而降低，且Cef的浓度为300～500 mg·L-1时，污染率为0，抑菌效果最佳，同时在此浓度范围内，Cef浓度为300 mg·L-1时，罗汉果叶盘的出芽率相对较高。过低的Cef浓度难以抑菌，过高的Cef浓度又会抑制出芽。由此可判断，抗生素Cef抑制罗汉果叶盘感染农杆菌的最佳浓度为300 mg·L-1。
2.5 农杆菌侵染菌液浓度的确立
由表6可知，罗汉果叶盘的污染率随着农杆菌菌液浓度的增加而升高，同時罗汉果叶盘的出芽率随着农杆菌菌液浓度的增加而降低。过高的农杆菌菌液浓度（OD600=0.7），会导致罗汉果叶盘污染严重，不能分化出芽;过低的农杆菌菌液浓度（OD600=0.1），则会影响转化的效率。由此可判断，农杆菌用于侵染时的菌液OD600值最好为0.3～0.5。
2.6 农杆菌侵染时间的确立
由表7可知，罗汉果叶盘的污染率随农杆菌侵染时间的增加而升高，同时罗汉果叶盘的出芽率随农杆菌侵染时间的增加而降低。当农杆菌侵染时间超过15 min，会导致罗汉果叶盘污染严重，不能分化出芽;而农杆菌侵染时间过短，又会影响遗传转化的效率。由此可判断，农杆菌用于侵染时的最佳时间为10 min。
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2.7 罗汉果叶盘的再生组织培养
图5显示了罗汉果叶盘经侵染之后的共培养情况、愈伤组织诱导情况、分化出芽情况以及生根培养情况。调查统计发现，在已优化罗汉果遗传转化体系的基础上，对罗汉果叶盘进行农杆菌转化及后续组织培养。由此可看出，罗汉果叶盘侵染之后颜色鲜绿，长势良好，分化出芽情况正常。
2.8 转化植株的分子检测
经过农杆菌介导转化和抗性培养基筛选培养，共得到15个抗性芽，转接至生根培养基培养30 d后，采用CTAB法微量提取植株部分茎叶DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，结果如图6所示。根据特异引物（表1）进行PCR检测扩增目的片段，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，综合三套特异引物的检测结果，结果显示共有4株转化植株扩增出目的条带（图7）。
2.9 田间调查
将PCR检测呈阳性的拟转基因植株扩繁生根后移栽大棚，观察记录性状表现。结果显示，扩繁之后的24株拟转基因阳性植株在营养生长时期长势良好，叶色鲜绿，叶型正常。在开花期有5株拟转基因植株正常开花，占总植株数的20.8%，且开花植株的子房在挂果期未经授粉即发育成果实，表现单性结实性。对转基因单性结实的罗汉果果实和正常人工授粉得到的罗汉果果实，在果实发育75 d后分别随机取样10个，统计果实的横径、纵径、重量以及种子情况（表8），果实的纵剖手工切片照片见图8。结果显示，转基因单性结实果实比正常人工授粉果实具有果形小、种子数极少且不具种仁等特点。有关转基因单性结实果实发育品质的形成、遗传生理规律以及大量转化苗的鉴定、筛选工作仍在进一步的研究之中。
3讨论
本研究将嵌合有果实特异启动子2A11与生长素合成相关基因iaaM连入pBI121-Gus，成功构建了pBI121-2A11-iaaM-Gus过量表达载体，并建立和优化了根癌农杆菌介导的以罗汉果叶片为受体的遗传转化体系。首先，以预培养4 d的罗汉果叶盘接种到OD600值为0.3～0.5，含100 μmol的AS的农杆菌菌液中，侵染10 min，迅速取出叶盘并用无菌滤纸吸去附着的菌液; 将侵染过的罗汉果叶
盘接种在叶片愈伤组织诱导培养基（含100 μmol AS）上，黑暗条件下共培养3 d;选择培养基：MS+TDZ 0.7 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+Kan 5 mg·L-1+Cef 300 mg·L-1。然后，经过不定芽增殖、壮苗培养后，进行分子鉴定。
本研究前期受体预实验表明，罗汉果种子苗胚轴可经过体细胞胚性愈伤发生途径成苗，但因性别鉴定困难，所以采用罗汉果雌株叶片为受体。叶盘转化法是Horsch et al（1985）建立的一种简便有效的植物遗传转化方法，最高转化频率达15%，是目前双子叶植物较为常用的转化技术，但得到的转化体有可能是嵌合体（王蕾，2007）。罗汉果叶片经胚性愈伤发生途径成苗困难，所以，遗传转化后采用器官发生途径直接成苗，转化后的植株多细胞起源，存在嵌合现象，为此，实验中采用分子生物学技术进行两次鉴定，即在对增殖芽第一次鉴定后，取芽尖扩繁，再进行第二次鉴定。PCR扩增技术作为一种快捷、灵敏的基因检测方法，能够简便有效地确定已整合进外源基因的植株，但PCR的检测结果容易出现假阳性。为获得更可靠的实验结果，本研究在对转化植株进行PCR检测时，同时使用了2A11、iaaM以及跨2A11和iaaM部分序列的嵌合基因的三套特异引物进行检测。
本研究根据经验， 自然条件下若无人工辅助授
粉，栽培罗汉果极少因虫媒或风媒等原因结出果实，通常被认为与栽培罗汉果蜜腺退化、大黑蜂减少、花粉粘重等因素有关;但严谨起见，为防止罗汉果开花期间虫媒或风媒传粉的干扰，实验安排将经过分子鉴定为阳性的拟转基因植株种植于孔径1 mm见方的网室大棚中，且仅种有罗汉果雌株（附近没有罗汉果雄株），既从源头上杜绝了罗汉果雄花花粉来源，也在一定程度上防止了昆虫传授异源花粉引起的干扰。
经分子鉴定所得转基因罗汉果阳性植株，部分正常开花，并不经授粉而长成小果，由于T0代转基因罗汉果受病毒影响较重，转入基因的表达、其内源激素含量、单性结实性等可能受到影响。利用单性结实品种，由于不需要种植雄株以提供花粉，可以增加单位面积上雌株的植株数而提高产量。单性结实品种能克服低温、弱光、授粉困难等，具有较强的适应性和种植范围， 果实使用加工 方便，市场前景好（Hazra & Dutta，2010;Yan，2010;Shabtai，2007）。研究表明，转基因单性结实番茄果实的品质没有异常变化（Rotino，2005），利用CPPU诱导的甜瓜单性结实果实中蔗糖和果糖比有籽果中含量高（Li，2011）。单性结实基本代谢谱没有改变，是其结构、风味和营养没有显著变化的主要原因（Picone，2011）。转基因单性结实罗汉果的单性结实性、品质、产量、适应性、次生代谢等表现如何尚有待进一步研究。
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