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摘要 通過添加增效剂、正交试验设计优化PCR反应体系、联合采用多种PCR程序等措施，建立并优化了PCR扩增体系，成功地从高GC青枯菌基因组中扩增出了长度为2434 bp且GC含量高达70.9％的aac基因。PCR反应体系为20uL包括5％DMSO、2.5 mmol/L MgCl2、500 umol/L dNTP、10 pmol/L引物、1.25 U Taq酶、50 ng模板DNA。首先采用热启动PCR：95℃5 rain，保持80℃，加入Taq酶；然后采用二步PCR：5个循环包括变性95℃1 min，65℃1 min最后采用降落PCR：30个循环为95℃1 min，78℃1 min，每个循环降低0.5℃，72℃3 min补充10个循环为95℃1 min，63℃1 min，72℃3 min 72℃10 min。该试验体系的建立与优化为研究高GC含量生物的基因功能提供了方法。
关键词 高GC；PCR；正交试验
中图分类号 432.42
植物细菌性青枯病是我国和世界范围内广泛分布和发生的一种重要细菌病害。病原为茄科青枯病菌(Ralstonia solanacearum nov．cornb E．F Smith，青枯菌)，侵染范围广，可达50多个科数百种植物，包括马铃薯、甘薯、番茄和烟草等，作为世界第四大作物马铃薯受青枯菌的侵染尤为严重。2002年法国科学家Salanoubat等在自然杂志上发表了青枯细菌GMI1000菌株的全基因组序列，青枯菌全基因序列的发表为今后克隆更多的致病相关基因，探究植物病原细菌的致病机理奠定了极其重要的基础。但是，青枯菌全基因组具有较高的GC含量(平均为67％)，采用通常的PCR扩增是很困难的，特别是扩增高GC含量的大片段尤其困难。这是因为当DNA模板含有二级结构或其G C含量较高时，PCR反应效率则会大为减弱，甚至无法扩增靶基因。本试验通过添加增效剂、优化PCR反应体系和优化PCR反应条件3个方面的改进，成功地从青枯菌基因组中扩增出包含全2 434 bp，GC含量为70.9％的aac基因，建立了扩增高GC含量的长片段的方法。高GC aac基因PCR扩增条件优化试验为研究像青枯菌这样高GC生物的研究提供了重要参考。
1 材料和方法
1．1 材料
1．1．1 菌株
青枯菌(Ralstonia solanacearum)GM11000由中国农业科学院蔬菜花卉研究所冯东昕老师提供。
1．1．2 试剂和仪器
Taq酶、dNTPs、DMSO等购自上海生工，500bp DNA ladder购自天根公司，引物由赛百盛公司合成。其他常规试剂均为进口或国产分析纯。仪器有德国Eppendorf公司的Mastercycler gradient扩增仪和5415C型离心机，美国STRAGENE公司的Eagle Eye System凝胶成像系统，北京六一厂DYY-6B型稳压稳流电泳仪。
1．2 方法
青枯菌GMI1000基因组DNA的提取参照颜子颖等的方法。根据GenBank上发表的植物青枯菌GMI1000的aac序列(NP 520668)用Primer Premier 5.0设计一对引物。上游引物从开放阅读框的起始密码子开始，下游引物为编码区3’端外侧序列。上下游引物：5，-CACCG-CATGACGCACGGATTC-3’、5，-CCGGT-TCAGGCAAACGCCCCG-3’，引物扩增片段大小为2 434 bp，包含完整的aac的阅读框(ORF)。PCR条件在试验中优化，扩增产物电泳后凝胶成像系统扫描保存。
2 结果
2．1 常规PCR扩增结果
反应体系为：总反应体系为20uL，模板DNA为50 ng，引物各为10 pmol/L，dNTP为300 umol/L，MgCl2为2 mmol/L，TaqDNA聚合酶为1.25 U。反应条件为94℃预变性4 min；94 uC变性1 min，64～68℃退火1 min、72℃延伸3 min，共30个循环；最后一步延伸10 min。采用常规的PCR扩增条件，无扩增条带，图1a所示。
2．2 使用增效剂和提高变性温度的PCR扩增结果
反应体系为：总反应体系为20 uL，DMSO终浓度为5％，模板DNA为50 ng，引物各为10 pmol/L，dNTP为300 umol/L，MgCl2为2 mmol/L，TaqDNA聚合酶为1.25U。反应条件为95℃预变性5 min；95℃变性1 min，64～68℃(退火温度的梯度为1℃)退火1 min、72℃延伸3 min，共30个循环；最后一步延伸10 min。通过加入增效剂和提高变性温度至95℃，扩增出了微弱的目的条带，图1b所示。
2．3 正交试验优化结果
正交试验设计是根据统计学原理，研究各因素试验的一种设计方法，它利用正交表来安排试验。应用这个表安排的多因素试验，通常是参与试验的全部因素、水平的部分试验，但由于正交法有正交性，所以用正交法安排的试验就有均衡分散和整齐可比的特点，可以通过部分试验，了解全面试验的情况和因素之间的内在规律，较快的找到最优的水平组合。正交设计选用L9(34)正交表，设计包括各反应成分、循环条件的因素一水平表及试验表，其中反应成分表如表1，2所示。由图1c可知，只有9号PCR体系成功地扩增出了大小约为2.5 kb的aac基因。故9号试验体系为最优体系，总反应体系为20uL，DMSO终浓度为5％，模板DNA为50 ng，引物各为10 pmol/L，dNTP为500umol/L，MgCl2为2.5 mmol/L，Taq酶1.25 U。反应条件为95℃预变性5 min；95℃变性1 min，64～68℃退火1 min、72℃延伸3 min，共30个循环；最后一步延伸10 min。但是9号体系仍然存在非特异性的扩增，下一步需要改进PCR程序以提高PCR扩增的特异性，减少非特异性条带。
2．4 多种PCR联合扩增结果
选用正交试验的最优体系，联合采用热启动PCR、二步PCR、降落PCR以去除非特异性扩增，如下所述，首先采用热启动PCR：95℃5 min，保持80℃，加入Taq酶；然后采用二步PCR：5个循环包括变性95℃1 min，65℃ 1 min；最后采用降落PCR：30个循环为95℃1 min，78℃1 min，每个循环降低0.5℃，72℃3 min补充10个循环包括95℃1 min，63℃1 min，72℃3 min；72℃ 10 min。通過采用正交试验的最优体系以及改进了的PCR程序避免了非特异性扩增，从而成功地扩增出了约为2.5 kb的单-PCR条带即aac基因，如图1d所示。本试验成功地扩增出了大量特异性的PCR产物，为aac基因的克隆奠定了坚实的基础。
3 讨论
自从1985年Mullis等发明了聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)以来，PCR及其衍生物的分子生物学方法无论在人类基因组研究还是在疾病的病因、诊断及治疗等方面的研究中均有举足轻重的地位。然而PCR技术也不是没有局限性的，如其忠实性就是棘手问题：它可能产生“假突变”或在引物并非完全匹配条件下产生“非特异”产物。其次PCR反应效率也是不容忽视的问题，当DNA模板含有二级结构或其G C含量较高时，PCR反应效率则会大为减弱，甚至无法扩增靶基因。在本试验中，采用常规的PCR条件无法扩增出任何条带。这是因为aac基因GC含量达70.9％，容易形成二级结构。高GC含量PCR扩增的难点在于：(1)难变性，DNA模板在常规变性温度(94℃)下，变性不完全。(2)难退火，由于DNA模板形成的二级结构，退火时引物不易与模板结合。(3)难延伸，由于DNA模板形成的二级结构，使PCR产物的延伸效率大幅下降。据报道，通过添加不同的增效剂如甜菜碱、二甲基亚砜、甘油、甲酰胺、吐温-20等能够使富含GC的DNA变性和减少DNA二级结构对PCR的影响。本试验采用了不同浓度的甲酰胺，甘油，吐温－20，二甲基亚砜，结果发现仅有5％的二甲基亚砜有效，但是扩增的目的片段微弱。这就说明有必要将PCR体系进行优化。笔者采用了正交法设计，充分考虑了PCR反应中每个因素同时变化对反应的影响，通过一次试验就得到了较好的反应体系。这表明正交试验是优化PCR反应体系的理想方法，但是仍然存在非特异性扩增。选用正交试验的较优体系并同时联合了热启动PCR、二步PCR、降落PCR以去除非特异性扩增。预变性采用95℃5 min，使具有复杂二级结构的模板DNA充分变性；二步PCR使得引物能够与模板DNA充分结合；试验中加入5％的DMSO减弱了模板DNA的二级结构的影响，便于Taq酶延伸；试验也采用了热启动PCR和降落PCR以减少非特异性条带，从而克服了高GC扩增3个难点。
总之，针对高GC基因难扩增的特点，首先，通过提高变性温度和添加增效剂，消除复杂的二级结构的影响；其次，采用正交试验设计，优化PCR反应体系；最后，通过改进PCR程序，以消除非特异性扩增，从而获得了大量特异性的PCR产物。
关键词 高GC；PCR；正交试验
中图分类号 432.42
植物细菌性青枯病是我国和世界范围内广泛分布和发生的一种重要细菌病害。病原为茄科青枯病菌(Ralstonia solanacearum nov．cornb E．F Smith，青枯菌)，侵染范围广，可达50多个科数百种植物，包括马铃薯、甘薯、番茄和烟草等，作为世界第四大作物马铃薯受青枯菌的侵染尤为严重。2002年法国科学家Salanoubat等在自然杂志上发表了青枯细菌GMI1000菌株的全基因组序列，青枯菌全基因序列的发表为今后克隆更多的致病相关基因，探究植物病原细菌的致病机理奠定了极其重要的基础。但是，青枯菌全基因组具有较高的GC含量(平均为67％)，采用通常的PCR扩增是很困难的，特别是扩增高GC含量的大片段尤其困难。这是因为当DNA模板含有二级结构或其G C含量较高时，PCR反应效率则会大为减弱，甚至无法扩增靶基因。本试验通过添加增效剂、优化PCR反应体系和优化PCR反应条件3个方面的改进，成功地从青枯菌基因组中扩增出包含全2 434 bp，GC含量为70.9％的aac基因，建立了扩增高GC含量的长片段的方法。高GC aac基因PCR扩增条件优化试验为研究像青枯菌这样高GC生物的研究提供了重要参考。
1 材料和方法
1．1 材料
1．1．1 菌株
青枯菌(Ralstonia solanacearum)GM11000由中国农业科学院蔬菜花卉研究所冯东昕老师提供。
1．1．2 试剂和仪器
Taq酶、dNTPs、DMSO等购自上海生工，500bp DNA ladder购自天根公司，引物由赛百盛公司合成。其他常规试剂均为进口或国产分析纯。仪器有德国Eppendorf公司的Mastercycler gradient扩增仪和5415C型离心机，美国STRAGENE公司的Eagle Eye System凝胶成像系统，北京六一厂DYY-6B型稳压稳流电泳仪。
1．2 方法
青枯菌GMI1000基因组DNA的提取参照颜子颖等的方法。根据GenBank上发表的植物青枯菌GMI1000的aac序列(NP 520668)用Primer Premier 5.0设计一对引物。上游引物从开放阅读框的起始密码子开始，下游引物为编码区3’端外侧序列。上下游引物：5，-CACCG-CATGACGCACGGATTC-3’、5，-CCGGT-TCAGGCAAACGCCCCG-3’，引物扩增片段大小为2 434 bp，包含完整的aac的阅读框(ORF)。PCR条件在试验中优化，扩增产物电泳后凝胶成像系统扫描保存。
2 结果
2．1 常规PCR扩增结果
反应体系为：总反应体系为20uL，模板DNA为50 ng，引物各为10 pmol/L，dNTP为300 umol/L，MgCl2为2 mmol/L，TaqDNA聚合酶为1.25 U。反应条件为94℃预变性4 min；94 uC变性1 min，64～68℃退火1 min、72℃延伸3 min，共30个循环；最后一步延伸10 min。采用常规的PCR扩增条件，无扩增条带，图1a所示。
2．2 使用增效剂和提高变性温度的PCR扩增结果
反应体系为：总反应体系为20 uL，DMSO终浓度为5％，模板DNA为50 ng，引物各为10 pmol/L，dNTP为300 umol/L，MgCl2为2 mmol/L，TaqDNA聚合酶为1.25U。反应条件为95℃预变性5 min；95℃变性1 min，64～68℃(退火温度的梯度为1℃)退火1 min、72℃延伸3 min，共30个循环；最后一步延伸10 min。通过加入增效剂和提高变性温度至95℃，扩增出了微弱的目的条带，图1b所示。
2．3 正交试验优化结果
正交试验设计是根据统计学原理，研究各因素试验的一种设计方法，它利用正交表来安排试验。应用这个表安排的多因素试验，通常是参与试验的全部因素、水平的部分试验，但由于正交法有正交性，所以用正交法安排的试验就有均衡分散和整齐可比的特点，可以通过部分试验，了解全面试验的情况和因素之间的内在规律，较快的找到最优的水平组合。正交设计选用L9(34)正交表，设计包括各反应成分、循环条件的因素一水平表及试验表，其中反应成分表如表1，2所示。由图1c可知，只有9号PCR体系成功地扩增出了大小约为2.5 kb的aac基因。故9号试验体系为最优体系，总反应体系为20uL，DMSO终浓度为5％，模板DNA为50 ng，引物各为10 pmol/L，dNTP为500umol/L，MgCl2为2.5 mmol/L，Taq酶1.25 U。反应条件为95℃预变性5 min；95℃变性1 min，64～68℃退火1 min、72℃延伸3 min，共30个循环；最后一步延伸10 min。但是9号体系仍然存在非特异性的扩增，下一步需要改进PCR程序以提高PCR扩增的特异性，减少非特异性条带。
2．4 多种PCR联合扩增结果
选用正交试验的最优体系，联合采用热启动PCR、二步PCR、降落PCR以去除非特异性扩增，如下所述，首先采用热启动PCR：95℃5 min，保持80℃，加入Taq酶；然后采用二步PCR：5个循环包括变性95℃1 min，65℃ 1 min；最后采用降落PCR：30个循环为95℃1 min，78℃1 min，每个循环降低0.5℃，72℃3 min补充10个循环包括95℃1 min，63℃1 min，72℃3 min；72℃ 10 min。通過采用正交试验的最优体系以及改进了的PCR程序避免了非特异性扩增，从而成功地扩增出了约为2.5 kb的单-PCR条带即aac基因，如图1d所示。本试验成功地扩增出了大量特异性的PCR产物，为aac基因的克隆奠定了坚实的基础。
3 讨论
自从1985年Mullis等发明了聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)以来，PCR及其衍生物的分子生物学方法无论在人类基因组研究还是在疾病的病因、诊断及治疗等方面的研究中均有举足轻重的地位。然而PCR技术也不是没有局限性的，如其忠实性就是棘手问题：它可能产生“假突变”或在引物并非完全匹配条件下产生“非特异”产物。其次PCR反应效率也是不容忽视的问题，当DNA模板含有二级结构或其G C含量较高时，PCR反应效率则会大为减弱，甚至无法扩增靶基因。在本试验中，采用常规的PCR条件无法扩增出任何条带。这是因为aac基因GC含量达70.9％，容易形成二级结构。高GC含量PCR扩增的难点在于：(1)难变性，DNA模板在常规变性温度(94℃)下，变性不完全。(2)难退火，由于DNA模板形成的二级结构，退火时引物不易与模板结合。(3)难延伸，由于DNA模板形成的二级结构，使PCR产物的延伸效率大幅下降。据报道，通过添加不同的增效剂如甜菜碱、二甲基亚砜、甘油、甲酰胺、吐温-20等能够使富含GC的DNA变性和减少DNA二级结构对PCR的影响。本试验采用了不同浓度的甲酰胺，甘油，吐温－20，二甲基亚砜，结果发现仅有5％的二甲基亚砜有效，但是扩增的目的片段微弱。这就说明有必要将PCR体系进行优化。笔者采用了正交法设计，充分考虑了PCR反应中每个因素同时变化对反应的影响，通过一次试验就得到了较好的反应体系。这表明正交试验是优化PCR反应体系的理想方法，但是仍然存在非特异性扩增。选用正交试验的较优体系并同时联合了热启动PCR、二步PCR、降落PCR以去除非特异性扩增。预变性采用95℃5 min，使具有复杂二级结构的模板DNA充分变性；二步PCR使得引物能够与模板DNA充分结合；试验中加入5％的DMSO减弱了模板DNA的二级结构的影响，便于Taq酶延伸；试验也采用了热启动PCR和降落PCR以减少非特异性条带，从而克服了高GC扩增3个难点。
总之，针对高GC基因难扩增的特点，首先，通过提高变性温度和添加增效剂，消除复杂的二级结构的影响；其次，采用正交试验设计，优化PCR反应体系；最后，通过改进PCR程序，以消除非特异性扩增，从而获得了大量特异性的PCR产物。