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摘要：利用梭罗草（Kengyilia thoroldiana）基因组DNA优化并建立的梭罗草扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，简称AFLP）反应体系。预扩增反应体系25 μL：连接产物1 μL，10×PCR Buffer 25 μL，dNTP 0375 μL，Mg2 1 μL，Taq DNA聚合酶05 μL，EcoRⅠ预扩引物1 μL，MseⅠ预扩引物12 μL，ddH2O加至 25 μL；选扩增反应体系25 μL：预扩产物（稀释20倍）20 μL，10×PCR Buffer 25 μL，dNTP 060 μL，Mg2 2 μL，TaqDNA聚合酶01 μL，EcoR Ⅰ选扩引物15 μL，Mse I选扩引物25 μL，ddH2O加至25 μL。利用优化后的AFLP体系，从梭罗草、大颖草（K grandiglumis）、疏花以礼草（K laxiflora）共10份供试材料中筛选出216对选择性扩增引物，从中筛选出38对具有多态性的引物并从中选出6对条带清晰、鉴别效率高的引物，其中E16C4、E4C10的扩增条带中均有梭罗草的特征条带，为梭罗草的种质鉴定及利用提供科学依据。
关键词：梭罗草；指纹图谱；AFLP体系；以礼草属；预扩增；选扩增；引物；种质鉴定
中图分类号： Q755文献标志码：
文章编号：1002-1302（2017）16-0037-05
收稿日期：2016-04-14
基金项目：国家自然科学基金（编号：31360578）。
作者简介：王晓醒（1991—），女，河北石家庄人，硕士研究生，研究方向为牧草饲料开发利用。E-mail：694840579@qqcom。
通信作者：李长慧，博士，教授，研究方向为牧草饲料开发利用。E-mail：746886595@qqcom。
梭罗草（Kengyilia thoroldiana）属禾本科（Poaceae）以礼草属（Kengyilia），是亚洲中部高寒草原特有种，抗逆性强，具下伸或横走根茎，固土能力强、抗旱、耐寒，返青早、分蘖能力强，适应寒冷干旱的高寒草原和高寒荒漠生境，对三江源区的环境保护和小麦的品种改良有重要意义[1-4]。目前，对梭罗草的研究主要集中在生理生态及人工引种栽培方面[5-6]。
扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，简称AFLP）结合了限制性内切酶片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，简称RFLP）和随机扩增多态性DNA标记（random amplified polymorphic DNA，简称RAPD）技术的优点，具有快速高效、稳定可靠等优势[7-8]，被广泛应用于遗传多样性分析、种质鉴定、遗传图谱构建等研究[9-14]。焦浈等以3种禾本科作物为材料，建立并与优化了针对于禾本科作物的AFLP体系[15]。刘欢等建立并优化了燕麦的AFLP体系[16]。李娜对小麦的AFLP体系进行优化并证实该体系对近缘物种同样适用[17]。AFLP过程比较复杂，针对不同物种有一定的特殊要求，因此AFLP体系优化成为AFLP分子标记研究的基础工作。本研究以梭罗草为植物材料并以大颖草和疏花以礼草作为对比，探讨AFLP分子标记各步骤的影响因素，优化对AFLP进行的正交设计及单因素试验，建立稳定的AFLP分析体系并进一步构建梭罗草的指纹图谱，为梭罗草种质鉴定、遗传分化研究及种质资源保护建立基础。
1材料与方法
11植物材料
本研究包括3个植物材料，共计10个居群（表1），每个居群随机抽取10个单株提取基因组DNA样本，稀释至 50 ng/μL。并分别混合成10个基因池，作为AFLP分析的DNA模板。
12试剂、接头与引物
限制性核酸内切酶Mse Ⅰ、EcoR Ⅰ、T4连接酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg2 、DNA ladder，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；引物及接头，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
13主要儀器
凝胶电泳使用北京六一生物科技有限公司生产的 DYY-12型电泳仪、JY-CX2A型槽电泳，2 000 V、100 mA、80 W。[JP]
14基因组DNA的酶切与连接
本研究基于已有的文献资料[18]，采用十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethyl ammonium bromide，简称CTAB）法提取供试材料基因组DNA并用核酸测定仪测定DNA的纯度和浓度，每个居群提取10个单株的DNA，稀释至50 ng/μL，于08%琼脂糖凝胶进行电泳检测并将各居群的10份DNA等量混合成基因池。
采用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和MseⅠ对供试材料的基因池进行双酶切，反应体系和条件参照刘欢等在燕麦研究中的方法[16]并略加改进，酶切后与EcoRⅠ和MseⅠ的特定接头连接（表2）。
15预扩和选扩反应的正交试验设计优化
预扩增反应以连接产物为模板DNA，采用25 μL体系，运用正交试验设计对体系中的模板DNA、dNTP、Mg2 、Taq DNA聚合酶、Mse Ⅰ和EcoR Ⅰ对应预扩增引物（E A、M C）的用量进行优化，采用6因素5水平设计试验（表3）。预扩增PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 80 s，20个循环；72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。加上样缓冲液混合后，在6%变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳检测预扩增引物的效果。
选扩增反应以预扩产物（稀释20倍）为模板DNA，采用25 μL体系，运用正交试验设计对体系中的模板DNA、dNTP、Mg2 、Taq DNA聚合酶、EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ对应选扩增引物（E ANN、M CNN）的用量进行优化，采用6因素5水平设计试验（表3）。选扩增PCR反应程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s（每循环降低07 ℃），72 ℃ 80 s，14个循环；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，23个循环；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。加上样缓冲液混合后，在6%变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳检测选扩增引物的效果。 16选扩增引物反应体系的单因素试验设计
根据正交设计试验优化的选扩增引物反应体系设计单因素试验（表4）。对某一因素进行单因素设计时，其他因素采用正交试验筛选出的水平。经PCR扩增后，在6%变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳检测选扩增引物反应效果。
17引物筛选与指纹图谱构建
利用10份植物材料对216对AFLP选扩增引物组合进行初步筛选，获得具有多态性的引物对，进一步筛选出引物扩增带型清晰、对供试材料区鉴别率高的核心引物。指纹图谱构建参照Pan的研究方法[19]，有AFLP片段的记为“A”，无AFLP片段的记为“C”。
[BT1#][STHZ]2结果与分析
21植物基因组DNA提取与检测结果
18～20，08%琼脂糖电泳条带整齐一致，表明杂质去除较干净，纯度较高，可用于AFLP分析（图1）。
22正交试验设计优化
预扩增采用EA和MC引物对酶切片段进行扩增，体系中各因素用量均影响最终结果。正交试验处理的试验产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上检测（图2）发现，预扩增片段在100～500 bp扩增信号较强，各样品间相对一致，说明基因组DNA的提取和酶切连接体系比较合适；6个因素仅取值在两端的水平组合选择性片段扩增量较少（泳道1、10、18、22）或背景太深（泳道11、16、21），其他组合带型较好。试验结果表明，梭罗草AFLP预扩增反应体系各因素水平范围宽泛，根据经济适用原则确定预扩增反应体系：连接产物1 μL，10×PCR Buffer 25 μL，dNTP 0375 μL，Mg2 1 μL，TaqDNA聚合酶05 μL，EcoR I预扩增引物1 μL，Mse I预扩引物12 μL，ddH2O补足至25 μL。
选扩增反应采用EA GA和MC CA对预扩增产物进行再次扩增。对上述优化过的预扩体系产生的预扩产物进行选择性扩增体系优化，正交试验处理的产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上检测发现，扩增片段在100～500 bp扩增信号较强，不同处理对选扩反应影响较大，仅试验组合4、13、15、19、24、25相对带型较好（图3）。试验结果表明，选扩体系设置的6因素中对结果影响较大的为dNTP和Mg2 （dNTPs浓度过低时，造成非特异性扩增增加，反之，则扩增产物会逐渐减少，Mg2 的影响效应与此相反），其次是引物、预扩产物、Taq DNA 聚合酶；初步确定最佳选扩反应体系：预扩产物（稀释[CM（25]20倍）20μL，10×PCRBuffer25μL，dNTP075μL，
Mg2 2 μL，TaqDNA聚合酶01 μL，EcoRⅠ选扩引物15 μL，MseⅠ选扩引物25 μL，ddH2O补足至25 μL。
23单因素试验设计优化
由正交试验结果可知，dNTP、Mg2 、引物、预扩产物、Taq DNA 聚合酶对选扩体系影响较大，采用单因素试验设计进一步研究，dNTP用量调整为060、065、070、075、080 μL。选扩增引物反应体系中单因素不同水平试验电泳图谱（图4）结果表明，各因素水平控制良好，较好带型均出现在各因素中值附近；进一步优化的选扩增反应体系（25 μL）：预扩产物（稀释20倍）20 μL，10×PCR Buffer 25 μL，dNTP 06 μL，[JP2]Mg2 2 μL， TaqDNA聚合酶01 μL， EcoR Ⅰ选扩引物 15 μL，[JP]Mse Ⅰ选扩引物25 μL，ddH2O补足至25 μL。
24引物筛选和指纹图谱构建
对10份供试材料筛选216对选择性扩增引物（图5），从
中筛选出38对具有多态性的引物并从中选出6对条带清晰，鉴别效率高的引物（表5），其中E16C4、E4C10（图6）的扩增条带中均有梭罗草的特征条带。这6对AFLP引物组合的扩增产物共统计出28个AFLP多态性片段，因此这28个AFLP标记的有无，即为供试植物材料的指纹。由于任何单一引物对都不能独自鉴定10份植物材料，所以本研究对10份植物材料构建E16C4、E3C16引物对的指纹图谱（表6），以鉴别10份植物材料。
3结论与讨论
本研究采用正交结合单因素试验设计，兼顾各因素间的交互作用。试验结果表明，梭罗草的AFLP分析对2种引物的用量需求并不相同，MseⅠ的预扩增引物和选扩增引物均略高于EcoRⅠ的预扩增和选扩增引物，这一点在之前的禾本科作物AFLP体系优化的国内相关文献中并未提及。分析原因可[CM（25]能为AFLP扩增片段同时具有4个碱基的 MseⅠ和6个碱
注：A表示有AFLP标记片段；C表示无AFLP标记片段。[HT][FK）]
基的EcoRⅠ黏性末端，依据4种碱基随机排列组合，MseⅠ的位点多于EcoRⅠ，则用量相对较少理论上是可行的。同样，MseⅠ的预扩增引物和选扩增引物应略高于EcoRⅠ的引物。
DNA指纹图谱构建是种质资源分子鉴定的基础，常用的分子生物学方法很多。SSR和AFLP是构建DNA指纹图谱的首选技术。本研究选取谱带稳定性较好、鉴定效率较高的6对AFLP引物构建10份植物材料的DNA指纹图谱，6对引物扩增结果不一致，表明此方法可以构建梭罗草的指纹图谱数据库。顯影结果中观察到梭罗草的特征条带（图6），能直接将梭罗草与大颖草和疏花以礼草区别出来，可以用来鉴定梭罗草种质资源。
梭罗草是青藏高原高寒荒漠草原的优势乡土草种，对生态恢复和拓宽小麦育种的遗传基础具有重要意义。目前，针对于梭罗草的研究主要集中于宏观方面，分子水平上的研究有待进一步发展。AFLP分子标记的引物在物种之间具有通用性，无须事前了解基因组的序列信息，是以分子水平研究梭罗草的良好接入点。为进一步利用AFLP分子标记研究梭罗草的遗传多样性、遗传分化等建立了基础。 參考文献：
[ZK（#]郭本兆 中国植物志（第九卷第3册）[M] 北京：科学教育出版社，1987
李淑娟，李长慧，何国英，等 梭罗草的染色体核型分析[J] 安徽农业科学，2010，38（7）：3356-3357
[3]李长慧 梭罗草有性繁殖特性的研究[D] 北京：中国农业科学院，2014
[4]Jensen K B Genome analysis of Eurasian Elymus thoroldianus，E melantherus，and Ekokonoricus （Triticeae：Poaceae）[J] International Journal of Plant Sciences，1996，157（1）：136-141
[5]王佩羽 播种深度和施肥水平对梭罗草农艺性状的影响[D] 西宁：青海大学，2013
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[15]焦浈，孙营，李娜，等 禾本科作物基因组AFLP分析体系的建立及优化[J] 华北农学报，2007，22（4）：108-111
[16]刘欢，赵桂琴，耿小丽，等 燕麦AFLP反应体系的建立与优化[J] 草业科学，2008，25（2）：84-89
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[19]Pan Y B Highly polymorphic microsatellite DNA markers for sugarcane germplasm evaluation and variety identity testing[J] Sugar Tech，2006，8（4）：246-256
关键词：梭罗草；指纹图谱；AFLP体系；以礼草属；预扩增；选扩增；引物；种质鉴定
中图分类号： Q755文献标志码：
文章编号：1002-1302（2017）16-0037-05
收稿日期：2016-04-14
基金项目：国家自然科学基金（编号：31360578）。
作者简介：王晓醒（1991—），女，河北石家庄人，硕士研究生，研究方向为牧草饲料开发利用。E-mail：694840579@qqcom。
通信作者：李长慧，博士，教授，研究方向为牧草饲料开发利用。E-mail：746886595@qqcom。
梭罗草（Kengyilia thoroldiana）属禾本科（Poaceae）以礼草属（Kengyilia），是亚洲中部高寒草原特有种，抗逆性强，具下伸或横走根茎，固土能力强、抗旱、耐寒，返青早、分蘖能力强，适应寒冷干旱的高寒草原和高寒荒漠生境，对三江源区的环境保护和小麦的品种改良有重要意义[1-4]。目前，对梭罗草的研究主要集中在生理生态及人工引种栽培方面[5-6]。
扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，简称AFLP）结合了限制性内切酶片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，简称RFLP）和随机扩增多态性DNA标记（random amplified polymorphic DNA，简称RAPD）技术的优点，具有快速高效、稳定可靠等优势[7-8]，被广泛应用于遗传多样性分析、种质鉴定、遗传图谱构建等研究[9-14]。焦浈等以3种禾本科作物为材料，建立并与优化了针对于禾本科作物的AFLP体系[15]。刘欢等建立并优化了燕麦的AFLP体系[16]。李娜对小麦的AFLP体系进行优化并证实该体系对近缘物种同样适用[17]。AFLP过程比较复杂，针对不同物种有一定的特殊要求，因此AFLP体系优化成为AFLP分子标记研究的基础工作。本研究以梭罗草为植物材料并以大颖草和疏花以礼草作为对比，探讨AFLP分子标记各步骤的影响因素，优化对AFLP进行的正交设计及单因素试验，建立稳定的AFLP分析体系并进一步构建梭罗草的指纹图谱，为梭罗草种质鉴定、遗传分化研究及种质资源保护建立基础。
1材料与方法
11植物材料
本研究包括3个植物材料，共计10个居群（表1），每个居群随机抽取10个单株提取基因组DNA样本，稀释至 50 ng/μL。并分别混合成10个基因池，作为AFLP分析的DNA模板。
12试剂、接头与引物
限制性核酸内切酶Mse Ⅰ、EcoR Ⅰ、T4连接酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg2 、DNA ladder，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；引物及接头，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
13主要儀器
凝胶电泳使用北京六一生物科技有限公司生产的 DYY-12型电泳仪、JY-CX2A型槽电泳，2 000 V、100 mA、80 W。[JP]
14基因组DNA的酶切与连接
本研究基于已有的文献资料[18]，采用十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethyl ammonium bromide，简称CTAB）法提取供试材料基因组DNA并用核酸测定仪测定DNA的纯度和浓度，每个居群提取10个单株的DNA，稀释至50 ng/μL，于08%琼脂糖凝胶进行电泳检测并将各居群的10份DNA等量混合成基因池。
采用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和MseⅠ对供试材料的基因池进行双酶切，反应体系和条件参照刘欢等在燕麦研究中的方法[16]并略加改进，酶切后与EcoRⅠ和MseⅠ的特定接头连接（表2）。
15预扩和选扩反应的正交试验设计优化
预扩增反应以连接产物为模板DNA，采用25 μL体系，运用正交试验设计对体系中的模板DNA、dNTP、Mg2 、Taq DNA聚合酶、Mse Ⅰ和EcoR Ⅰ对应预扩增引物（E A、M C）的用量进行优化，采用6因素5水平设计试验（表3）。预扩增PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 80 s，20个循环；72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。加上样缓冲液混合后，在6%变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳检测预扩增引物的效果。
选扩增反应以预扩产物（稀释20倍）为模板DNA，采用25 μL体系，运用正交试验设计对体系中的模板DNA、dNTP、Mg2 、Taq DNA聚合酶、EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ对应选扩增引物（E ANN、M CNN）的用量进行优化，采用6因素5水平设计试验（表3）。选扩增PCR反应程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s（每循环降低07 ℃），72 ℃ 80 s，14个循环；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，23个循环；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。加上样缓冲液混合后，在6%变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳检测选扩增引物的效果。 16选扩增引物反应体系的单因素试验设计
根据正交设计试验优化的选扩增引物反应体系设计单因素试验（表4）。对某一因素进行单因素设计时，其他因素采用正交试验筛选出的水平。经PCR扩增后，在6%变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳检测选扩增引物反应效果。
17引物筛选与指纹图谱构建
利用10份植物材料对216对AFLP选扩增引物组合进行初步筛选，获得具有多态性的引物对，进一步筛选出引物扩增带型清晰、对供试材料区鉴别率高的核心引物。指纹图谱构建参照Pan的研究方法[19]，有AFLP片段的记为“A”，无AFLP片段的记为“C”。
[BT1#][STHZ]2结果与分析
21植物基因组DNA提取与检测结果
18～20，08%琼脂糖电泳条带整齐一致，表明杂质去除较干净，纯度较高，可用于AFLP分析（图1）。
22正交试验设计优化
预扩增采用EA和MC引物对酶切片段进行扩增，体系中各因素用量均影响最终结果。正交试验处理的试验产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上检测（图2）发现，预扩增片段在100～500 bp扩增信号较强，各样品间相对一致，说明基因组DNA的提取和酶切连接体系比较合适；6个因素仅取值在两端的水平组合选择性片段扩增量较少（泳道1、10、18、22）或背景太深（泳道11、16、21），其他组合带型较好。试验结果表明，梭罗草AFLP预扩增反应体系各因素水平范围宽泛，根据经济适用原则确定预扩增反应体系：连接产物1 μL，10×PCR Buffer 25 μL，dNTP 0375 μL，Mg2 1 μL，TaqDNA聚合酶05 μL，EcoR I预扩增引物1 μL，Mse I预扩引物12 μL，ddH2O补足至25 μL。
选扩增反应采用EA GA和MC CA对预扩增产物进行再次扩增。对上述优化过的预扩体系产生的预扩产物进行选择性扩增体系优化，正交试验处理的产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上检测发现，扩增片段在100～500 bp扩增信号较强，不同处理对选扩反应影响较大，仅试验组合4、13、15、19、24、25相对带型较好（图3）。试验结果表明，选扩体系设置的6因素中对结果影响较大的为dNTP和Mg2 （dNTPs浓度过低时，造成非特异性扩增增加，反之，则扩增产物会逐渐减少，Mg2 的影响效应与此相反），其次是引物、预扩产物、Taq DNA 聚合酶；初步确定最佳选扩反应体系：预扩产物（稀释[CM（25]20倍）20μL，10×PCRBuffer25μL，dNTP075μL，
Mg2 2 μL，TaqDNA聚合酶01 μL，EcoRⅠ选扩引物15 μL，MseⅠ选扩引物25 μL，ddH2O补足至25 μL。
23单因素试验设计优化
由正交试验结果可知，dNTP、Mg2 、引物、预扩产物、Taq DNA 聚合酶对选扩体系影响较大，采用单因素试验设计进一步研究，dNTP用量调整为060、065、070、075、080 μL。选扩增引物反应体系中单因素不同水平试验电泳图谱（图4）结果表明，各因素水平控制良好，较好带型均出现在各因素中值附近；进一步优化的选扩增反应体系（25 μL）：预扩产物（稀释20倍）20 μL，10×PCR Buffer 25 μL，dNTP 06 μL，[JP2]Mg2 2 μL， TaqDNA聚合酶01 μL， EcoR Ⅰ选扩引物 15 μL，[JP]Mse Ⅰ选扩引物25 μL，ddH2O补足至25 μL。
24引物筛选和指纹图谱构建
对10份供试材料筛选216对选择性扩增引物（图5），从
中筛选出38对具有多态性的引物并从中选出6对条带清晰，鉴别效率高的引物（表5），其中E16C4、E4C10（图6）的扩增条带中均有梭罗草的特征条带。这6对AFLP引物组合的扩增产物共统计出28个AFLP多态性片段，因此这28个AFLP标记的有无，即为供试植物材料的指纹。由于任何单一引物对都不能独自鉴定10份植物材料，所以本研究对10份植物材料构建E16C4、E3C16引物对的指纹图谱（表6），以鉴别10份植物材料。
3结论与讨论
本研究采用正交结合单因素试验设计，兼顾各因素间的交互作用。试验结果表明，梭罗草的AFLP分析对2种引物的用量需求并不相同，MseⅠ的预扩增引物和选扩增引物均略高于EcoRⅠ的预扩增和选扩增引物，这一点在之前的禾本科作物AFLP体系优化的国内相关文献中并未提及。分析原因可[CM（25]能为AFLP扩增片段同时具有4个碱基的 MseⅠ和6个碱
注：A表示有AFLP标记片段；C表示无AFLP标记片段。[HT][FK）]
基的EcoRⅠ黏性末端，依据4种碱基随机排列组合，MseⅠ的位点多于EcoRⅠ，则用量相对较少理论上是可行的。同样，MseⅠ的预扩增引物和选扩增引物应略高于EcoRⅠ的引物。
DNA指纹图谱构建是种质资源分子鉴定的基础，常用的分子生物学方法很多。SSR和AFLP是构建DNA指纹图谱的首选技术。本研究选取谱带稳定性较好、鉴定效率较高的6对AFLP引物构建10份植物材料的DNA指纹图谱，6对引物扩增结果不一致，表明此方法可以构建梭罗草的指纹图谱数据库。顯影结果中观察到梭罗草的特征条带（图6），能直接将梭罗草与大颖草和疏花以礼草区别出来，可以用来鉴定梭罗草种质资源。
梭罗草是青藏高原高寒荒漠草原的优势乡土草种，对生态恢复和拓宽小麦育种的遗传基础具有重要意义。目前，针对于梭罗草的研究主要集中于宏观方面，分子水平上的研究有待进一步发展。AFLP分子标记的引物在物种之间具有通用性，无须事前了解基因组的序列信息，是以分子水平研究梭罗草的良好接入点。为进一步利用AFLP分子标记研究梭罗草的遗传多样性、遗传分化等建立了基础。 參考文献：
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