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摘要：【目的】研發一种快速鉴定柑橘黄龙病耐性种质材料的方法，为加快柑橘黄龙病耐性育种进程和提高育种效率打下基础。【方法】以收集的36份疑似对柑橘黄龙病具有耐性的柑橘种质为材料，采用直接高接于感染黄龙病菌柑橘树上的方法（高接染毒鉴定法），通过田间症状观察结合定量PCR检测对试验材料的耐病性进行鉴定评价。【结果】春季高接供试材料1个月后接芽萌发，3个月后（2018年6月5日）首次在KH-14上出现典型的叶片斑驳型黄化症状，4个月后（2018年7月5日）观察有23份种质材料的叶片出现斑驳型黄化症状，另外11份种质材料未表现症状;6个月后（2018年9月4日）观察发现KH-18、KH-12、KHY-4、KHY-5和KHY-6等5份种质材料的生长虽然较正常，但叶片已出现黄化症状，只有KH-21的枝梢生长良好，无黄梢和斑驳型黄化叶，初步判定为对黄龙病具有耐性的种质材料。对6份种质材料的定性PCR检测结果表明，KH-21为阴性，其他5份材料为阳性;实时荧光定量PCR检测结果，KH-21的平均黄龙病菌含量为1870.0个细胞/μg DNA，对照材料平均黄龙病菌含量为372285.5个细胞/μg DNA，表明KH-21对柑橘黄龙病具有耐性。【结论】高接染毒鉴定法鉴定周期在6个月左右，具有通量大、时间短、效率高、成本低及结果准确等优点，能达到快速鉴定柑橘品种对柑橘黄龙病耐性的目的，可在柑橘黄龙病耐性鉴定中推广使用。
关键词： 柑橘;黄龙病;耐性;种质材料;高接染毒鉴定法
中图分类号： S436.661.12 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）11-2489-07
A rapid identification method for germplasm materials resistant to citrus Huanglongbing disease
TANG Yan1， WU Xiao-xiao1， LOU Bing-hai1， LIU Ping1， CHEN Chuan-wu1，
NIU Ying1， ZHANG Ge-bi1， YAN Jia-wen2， DENG Chong-ling1*
（1Guangxi Academy of Specialty Crops/Guangxi Key Laboratory of Citrus Biology， Guilin， Guangxi 541004， China; 2College of Life Science， Guangxi Normal University， Guilin， Guangxi 541004， China）
Abstract：【Objective】To develop a rapid identification method for citrus Huanglongbing disease resistant germline materials and provide basis for accelarating the citrus breeding that were resistant to Huanglongbing and increasing the breeding efficiency. 【Method】Thirty-six citrus germplasms suspected to be resistant to citrus Huanglongbing disease were collected in this study. The method of direct high grafting to citrus trees infected with Huanglongbing pathogen was adop-ted. The resistance of the test materials was identified and evaluated by field symptoms combined with quantitative PCR. It was defined as the top grafting identification method. 【Result】The test materials that were grafted in spring started to germinate after one month， and three months later（June 5， 2018），typical mottled yellowing on leaves was observed on KH-14 for the fiest time. After four months（July 5， 2018） of top grafting， typical mottled yellowing occurred on 23 mate-rials， and 11 materials showed no such symptom. After six months（September 4， 2018） of top grafting， although the growth of KH-18，KH-12， KHY-4， KHY-5 and KHY-6 were normal， yellowing was observed on their leaves. Only KH-21 grew well， and showed no yellow shoots and yellowing leaves. It was identified as the material with resistance to Huanglongbing disease. Quantitative PCR tests on the above six materials showed that KH-21 was negative and the other five were positive. Real-time fluorescence quantitative PCR test indicated that the average Huanglongbing bacteria amount in KH-21 was 1870.0 cell/μg DNA， and the average Huanglongbing bacteria amount incontrol material was 372285.5 cell/μg DNA， indicating KH-21 was resistant to Huanglongbing bacteria. 【Conclusion】The method for infecting bacteria by topgrafting takes six months， and can detect large amount of seedlings，it is time-saving， high efficient，low-cost and accurate. This methodcan quickly identify the resistance of citrus varieties to citrus Huanglongbing disease， and can be popularized and used in the identification of citrus Huanglongbing disease resistance. Key words： citrus; Huanglongbing disease; resistance; germplasm material; method for infecting bacteria by top grafting
0 引言
【研究意义】柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing）是一种世界范围的柑橘毁灭性细菌病害，其病原是一类难培养的革兰氏阴性细菌（Bassanezi et al.，2009;邓崇岭，2017），目前已发现3个种：亚洲种（Candidatus Liberibacter asiaticus）、非洲种（Ca. L. africanus）（Jagoueix et al.，1994）和美洲种（Ca. L. americanus）（Teixeira et al.，2005;Bové，2006），其中亚洲种发生流行最广泛，在我国发生流行的也是亚洲种。黄龙病每年对我国柑橘产业造成的经济损失高达数十亿元。柑橘树感染黄龙病初期，植株新抽出的枝梢叶片接近成熟时停止转绿，在树冠顶部形成明显的“黄梢”，受害叶片主要表现为斑驳型黄化、均匀型黄化和花叶型3种类型症状。黄龙病树经过2～3年的病情发展，全树发黄，树势迅速衰退，叶片早脱落，枝梢干枯，根系腐烂，病株逐渐枯死。柑橘植株一旦感病，轻者影响产量和品质，重者则造成树死园毁，给果农带来不可估量的经济损失（娄兵海和周常勇，2007;程春振等，2013;周常勇，2018）。目前，柑橘黃龙病的综合防控措施主要有种植柑橘无病苗木、防治柑橘木虱、及时清除病树（邓秀新和彭抒昂，2013）等，虽然严格执行上述措施能有效防控柑橘黄龙病，但在实际生产中存在一定的操作执行难度。因此，筛选出对柑橘黄龙病具有抗性或耐性的柑橘种质材料或新品系，并在生产上推广应用，是解决柑橘黄龙病危害最根本的途径，对柑橘产业可持续健康发展具有十分重要的意义。【前人研究进展】研究表明，部分野生柑橘品种对黄龙病具有一定的耐性，但由于供试野生柑橘品种数量少，迄今为止，国际上尚未挖掘出更有耐黄龙病价值的柑橘资源。广西存在大量的野生和特有柑橘种质资源，石健泉（1989）、邓崇岭等（2013）先后开展了广西柑橘种质的调查、收集和保存工作，目前已在广西特色作物研究院保存了575份柑橘种质资源，其中广西野生和特有柑橘种质资源81份，同时从大田中优选出疑似耐黄龙病种质材料62份，这些资源中可能存在具有柑橘黄龙病耐性的柑橘种质材料。然而，目前对柑橘黄龙病耐性柑橘种质材料的常用鉴定方法是将待鉴定种质材料嫁接到砧木上培育成幼苗，然后将感染黄龙病的芽、皮或枝段嫁接到幼苗上，使黄龙病菌传染到待鉴定的种质材料上，再通过黄龙病典型症状的表现及PCR检测情况判断该种质材料对柑橘黄龙病的耐性（黄小耘和田甜，2015;李彬，2019），鉴定周期较长，且存在接种病原数量少、效率低、成本高等缺点。【本研究切入点】鉴于此，有必要研发一种可快速鉴定柑橘黄龙病耐性种质材料的方法，以解决现有技术的不足。【拟解决的关键问题】研发一种可快速鉴定柑橘黄龙病耐性种质材料的方法，为加快柑橘黄龙病耐性育种进程和提高育种效率打下基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试材料共36份，为2014—2018年在广西调査、发掘和收集的疑似对柑橘黄龙病具有耐性的柑橘种质材料（表1）。36份种质材料分别嫁接在枳砧上，种植于广西特色作物研究院柑橘育种大棚内加以保存，目前生长情况较好，可满足接穗采集和嫁接使用。
1. 2 传（染）毒鉴定方法比较试验
1. 2. 1 嫁接传毒鉴定法（常规方法） 2017年9月，将收集的3份待鉴定沙糖橘种质材料KH-16、KH-17和KH-18取单芽采用小芽腹接法嫁接在枳砧上，于2018年3月剪去嫁接口以上的砧木枝干，至2018年9月抽发的嫁接芽长成小苗;同时，设沙糖橘无病苗为对照。2018年9月从沙糖橘黄龙病树上表现斑驳型黄化叶片症状的枝条上采集接穗，采用腹接法，嫁接到待鉴定的种质材料上，每株均嫁接3个黄龙病病树芽。对供试材料及对照定期进行黄龙病症状观察，并在嫁接传毒6个月后进行定性和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测。
1. 2. 2 高接染毒鉴定法 2018年3月将相同的3份待鉴定沙糖橘种质材料取单芽高接至黄龙病树上，成活后定期进行黄龙病症状观察，并在6个月后进行定性和实时荧光定量PCR检测;同时，将无毒沙糖橘芽高接至同一株黄龙病树上作为对照。
1. 3 高接染毒鉴定试验
1. 3. 1 高接树选择 在柑橘果园中选取感染黄龙病菌的柑橘树，并进行PCR检测加以确定。本次试验果园位于广西桂林市临桂区中庸乡江勒寨村。园中所种柑橘品种为沙糖橘，砧木为枳，共计112株，经PCR检测，112株树全部呈阳性，田间症状观察和PCR检测结果表明，所选的高接树均已感染黄龙病（图1）。
1. 3. 2 高接染毒鉴定试验 于2018年3月将供试材料高接至黄龙病树上。高接供试种质材料36份，其中2份材料由于天牛危害死亡，因此高接鉴定材料实为34份，高接方法为春接。
高接方法主要分为春接和秋接。春接：接种时间为2—4月，高接方式为单芽切接;操作方法：在高接树上选取直径0.5 cm以上的枝条，在树皮平滑处剪断，在枝条断面下方沿皮层与木质部交界处向下纵切一刀，露出形成层，切面短于接穗芽，然后从待鉴定种质材料的枝条上切取单芽，将单芽插入中间砧枝条切口上，对准双方形成层并缚紧。秋接：接种时间为9—11月，高接方式为小芽腹接;操作方法：在高接树上选取直径0.5 cm以上的枝条，在树皮平滑处沿皮层与木质部交界处向下纵切一刀，露出形成层，切面长度2.0～4.0 cm，然后从待鉴定种质材料的枝条上切取芽片，将芽片插入砧枝条切口上并缚紧，保留高接枝条。同时设同一品种的对照品种进行高接。 1. 3. 3 田间症状观察 高接4个月后，根据待鉴定种质材料抽出枝梢的症状进行诊断：枝梢生长良好、无黄梢、无斑驳型黄化叶或仅有轻微叶片黄化症状，则初步判定该种质材料对柑橘黄龙病具有耐性;枝梢生长较弱、黄梢严重、叶片斑驳型黄化症状明显，则初步判定该种质材料对柑橘黄龙病不具耐性。
1. 3. 4 实时荧光定量PCR检测 取高接成活且初步判定为对柑橘黄龙病具有耐性种质材料的叶片，采用改良CTAB法提取DNA（程运江等，2001），得到待测样品的DNA模板;从健康柑橘树的叶片中提取DNA作为阴性对照，从柑橘黄龙病树的叶片中提取DNA作为阳性对照;参照Li等（2006）的方法进行实时荧光定量PCR扩增，绘制标准曲线，并建立标准曲线方程，计算病原菌含量。
2 结果与分析
2. 1 两种鉴定方法结果
对3份沙糖橘种质材料KH-16、KH-17和KH-18进行田间症状观察，结果显示，采用嫁接传毒法的植株在接种毒源6个月后均表现出典型的叶片斑驳型黄化症状;采用高接染毒法的植株在高接3个月后开始出现黄龙病典型叶片黄化症状，4个月后黄龙病典型斑驳型叶片黄化症状明显。
对3份沙糖橘种质材料分别进行定性和实时荧光定量PCR检测，结果（表2）显示，采用嫁接传毒法的材料黄龙病菌平均含量为1079608.0个细胞/μg DNA，采用高接染毒法的材料黄龙病菌平均含量为1269969.7个细胞/μg DNA，较嫁接传毒法的病菌平均含量约高17.63%。
嫁接传毒鉴定法（常规方法）是在待鉴定种质上嫁接已感染黄龙病的芽、皮或枝段，使黄龙病菌传染到待鉴定的种质材料上，嫁接材料由于体积小，含有的病原數量较少，使得接种病原数量少，鉴定周期为10～16个月。高接染毒鉴定法是将待鉴定的种质材料直接高接在柑橘黄龙病树上，病原数量多且可持续侵染待鉴定的种质材料，高接成活后通过黄龙病症状观察结合黄龙病菌PCR定量检测进行耐性鉴定，鉴定周期为6个月。两者相比较，高接染毒鉴定法具有通量大、时间短、效率高、成本低及结果准确等优点。
2. 2 高接柑橘成活率调查结果
2018年7月31日，对高接试验果园的嫁接成活情况进行观察统计，高接芽共计397个，其中成活芽357个，成活率为89.92%。
2. 3 高接后田间症状观察结果
春季高接鉴定材料1个月后接芽萌发，2个月后接芽生长正常，3个月后开始出现黄龙病典型叶片黄化症状，4个月后黄龙病典型斑驳型叶片黄化症状明显（图2），可进行黄龙病田间症状观察和统计，同时进行黄龙病菌定性PCR检测（图3）。2018年6月5日首次出现典型的叶片斑驳型黄化症状，种质材料编号为KH-14（宫川）;6月19日观察发现9份种质材料的叶片出现斑驳型黄化症状;7月5日观察23份种质材料的叶片出现斑驳型黄化症状，另外11份种质材料未表现症状;8月7日观察只有6份种质材料（KH-21、KH-18、KH-12、KHY-4、KHY-5和KHY-6）的叶片未表现症状，其余材料出现叶片斑驳型黄化症状，说明34份种质材料对柑橘黄龙病的耐性存在差异;9月4日观察KH-18、KH-12、KHY-4、KHY-5和KHY-6等5份种质材料的生长虽然较正常，但叶片已出现黄化症状（非黄龙病典型斑驳型黄化症状），疑似感染黄龙病病菌，只有编号为KH-21材料（沙糖橘）的枝梢生长良好，无黄梢和斑驳型黄化叶，初步判定为对黄龙病具有耐性的种质材料。对照同一品种则已表现出典型的黄龙病症状，即枝梢生长较弱、黄梢严重、叶片斑驳型黄化症状明显，初步判定为对黄龙病不具耐性的种质材料。
2. 4 定量PCR检测结果
2018年9月7日，对8月7日观察的6份未表现黄龙病症状的种质材料进行定性PCR检测，结果表明，KH-21材料检测结果为阴性，其他5份材料检测结果为阳性，虽然5份材料已感染黄龙病菌，但其枝梢生长较正常、生长势较旺，感染时间也较晚，说明对黄龙病有一定的耐病性。2018年9月12日对定性PCR检测呈阴性的KH-21材料进行实时荧光定量PCR检测，结果表明，KH-21材料中的黄龙病菌含量为1809.0个细胞/μg DNA，对照材料黄龙病菌含量为951837.0个细胞/μg DNA（图4）;此后，在不同时期连续进行5次实时荧光定量PCR检测，结果显示，KH-21平均黄龙病菌含量为1870.0个细胞/μg DNA，对照材料平均黄龙病菌含量为372285.5个细胞/μg DNA ，对照含菌量是KH-21的199.1倍，说明KH-21材料中的黄龙病菌含量明显低于对照（图5）。
2. 5 田间症状结合实时荧光定量PCR检测对耐性种质的评价
实时荧光定量PCR检测及田间症状观察结果显示，编号为KH-21材料的枝梢生长良好，在试验果园内未观察到黄梢和叶片斑驳型黄化症状，且实时荧光定量PCR检测结果表明黄龙病菌含量为1809.0个细胞/μg DNA，表明KH-21对柑橘黄龙病具有耐性。
3 讨论
尽管黄龙病病原可感染所有柑橘主栽品种，且目前还未发现抗性资源和材料，但已有研究发现，不同柑橘品种对黄龙病的耐性不同，宽皮橘（C. reticulata）、甜橙（C. sinensis）和桔柚（C. reticulata×C. paradisi）最感病，柠檬（C. limonum）和葡萄柚（C. paradisi）较耐病，枳壳（Poncitrus. trifoliate）、来檬（C. aurantifolia）和枳橙（C. sinensis×P. trifoliate）最耐病（黄丽，2013）;胡柚、金柑和佛手较抗病，椪柑和瓯柑等较易感病（蒋自珍等，2006）。Shokrollah等（2011）通过柑橘嫁接试验证明，依据植株黄龙病症状可将供试材料分为5组：重症组，包括宽皮柑橘、甜橙和印度酸橘;中症组，包括金柑、阿力檬和小花大翼橙;轻症组，包括枸橼、部分来檬和粗柠檬等;耐病组（无黄龙病症状，但有黄龙病菌检出），包括酸橙和某些来檬;抗病组（无症状且黄龙病菌检测阴性），包括Limau Bali柚、马蜂柑和Limau Tembikai。林雄杰等（2014）测试13个枳属及其杂交种砧木对黄龙病的抗性，结果所有供试砧木品种均表现出黄龙病症状，其中LT49、5号小花枳、墨西哥枳橙、LT54和鄢陵枳橙等5个品种接穗上的黄龙病症状表现较严重。刘登全等（2014）采用黄龙病毒源树对不同柑橘品种进行嫁接，结果表明，椪柑高度感病，琯溪蜜柚次之，温州蜜柑高度抗病。McCollum等（2016）通过长期田间评估发现，大部分柑橘品种均易感染黄龙病，而澳沙檬和澳指檬等柑橘近缘属植物对黄龙病具有一定的抗/耐病性。以上研究均表明，不同柑橘品种对黄龙病的耐性存在差异。 目前，对柑橘黄龙病耐性种质材料的鉴定方法通常是嫁接传毒鉴定法，该方法的主要缺点是每份待鉴定材料只能通过嫁接来接种病原，由于嫁接材料体积小，含有的病原数量较少，使得接种病原数量少;此外，由于鉴定周期通常在10～16个月，时间长、效率低、成本高。本研究首次将待鉴定的种质材料直接高接在柑橘黄龙病病树上，高接成活后通过黄龙病症状观察，并结合黄龙病菌定量PCR检测进行耐性鉴定，即高接染毒鉴定法，目前国内外未见有类似报道。高接染毒鉴定法克服了现有技术的不足，提供了一種对柑橘黄龙病具有耐性的种质材料的快速鉴定方法：每份待鉴定种质材料直接嫁接在柑橘黄龙病病树上，病原数量多且可持续侵染待鉴定的种质材料;鉴定周期在6个月左右，具有通量大、时间短、效率高、成本低及结果准确等优点。
4 结论
本研究将待鉴定的种质材料直接高接于柑橘黄龙病病树上进行耐性鉴定，即高接染毒鉴定法，能达到快速鉴定柑橘品种对柑橘黄龙病耐性的目的，为开展柑橘黄龙病耐性育种和耐病分子机制研究打下一定基础，可在柑橘黄龙病耐性鉴定中推广使用。
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（责任编辑 麻小燕）
关键词： 柑橘;黄龙病;耐性;种质材料;高接染毒鉴定法
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Abstract：【Objective】To develop a rapid identification method for citrus Huanglongbing disease resistant germline materials and provide basis for accelarating the citrus breeding that were resistant to Huanglongbing and increasing the breeding efficiency. 【Method】Thirty-six citrus germplasms suspected to be resistant to citrus Huanglongbing disease were collected in this study. The method of direct high grafting to citrus trees infected with Huanglongbing pathogen was adop-ted. The resistance of the test materials was identified and evaluated by field symptoms combined with quantitative PCR. It was defined as the top grafting identification method. 【Result】The test materials that were grafted in spring started to germinate after one month， and three months later（June 5， 2018），typical mottled yellowing on leaves was observed on KH-14 for the fiest time. After four months（July 5， 2018） of top grafting， typical mottled yellowing occurred on 23 mate-rials， and 11 materials showed no such symptom. After six months（September 4， 2018） of top grafting， although the growth of KH-18，KH-12， KHY-4， KHY-5 and KHY-6 were normal， yellowing was observed on their leaves. Only KH-21 grew well， and showed no yellow shoots and yellowing leaves. It was identified as the material with resistance to Huanglongbing disease. Quantitative PCR tests on the above six materials showed that KH-21 was negative and the other five were positive. Real-time fluorescence quantitative PCR test indicated that the average Huanglongbing bacteria amount in KH-21 was 1870.0 cell/μg DNA， and the average Huanglongbing bacteria amount incontrol material was 372285.5 cell/μg DNA， indicating KH-21 was resistant to Huanglongbing bacteria. 【Conclusion】The method for infecting bacteria by topgrafting takes six months， and can detect large amount of seedlings，it is time-saving， high efficient，low-cost and accurate. This methodcan quickly identify the resistance of citrus varieties to citrus Huanglongbing disease， and can be popularized and used in the identification of citrus Huanglongbing disease resistance. Key words： citrus; Huanglongbing disease; resistance; germplasm material; method for infecting bacteria by top grafting
0 引言
【研究意义】柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing）是一种世界范围的柑橘毁灭性细菌病害，其病原是一类难培养的革兰氏阴性细菌（Bassanezi et al.，2009;邓崇岭，2017），目前已发现3个种：亚洲种（Candidatus Liberibacter asiaticus）、非洲种（Ca. L. africanus）（Jagoueix et al.，1994）和美洲种（Ca. L. americanus）（Teixeira et al.，2005;Bové，2006），其中亚洲种发生流行最广泛，在我国发生流行的也是亚洲种。黄龙病每年对我国柑橘产业造成的经济损失高达数十亿元。柑橘树感染黄龙病初期，植株新抽出的枝梢叶片接近成熟时停止转绿，在树冠顶部形成明显的“黄梢”，受害叶片主要表现为斑驳型黄化、均匀型黄化和花叶型3种类型症状。黄龙病树经过2～3年的病情发展，全树发黄，树势迅速衰退，叶片早脱落，枝梢干枯，根系腐烂，病株逐渐枯死。柑橘植株一旦感病，轻者影响产量和品质，重者则造成树死园毁，给果农带来不可估量的经济损失（娄兵海和周常勇，2007;程春振等，2013;周常勇，2018）。目前，柑橘黃龙病的综合防控措施主要有种植柑橘无病苗木、防治柑橘木虱、及时清除病树（邓秀新和彭抒昂，2013）等，虽然严格执行上述措施能有效防控柑橘黄龙病，但在实际生产中存在一定的操作执行难度。因此，筛选出对柑橘黄龙病具有抗性或耐性的柑橘种质材料或新品系，并在生产上推广应用，是解决柑橘黄龙病危害最根本的途径，对柑橘产业可持续健康发展具有十分重要的意义。【前人研究进展】研究表明，部分野生柑橘品种对黄龙病具有一定的耐性，但由于供试野生柑橘品种数量少，迄今为止，国际上尚未挖掘出更有耐黄龙病价值的柑橘资源。广西存在大量的野生和特有柑橘种质资源，石健泉（1989）、邓崇岭等（2013）先后开展了广西柑橘种质的调查、收集和保存工作，目前已在广西特色作物研究院保存了575份柑橘种质资源，其中广西野生和特有柑橘种质资源81份，同时从大田中优选出疑似耐黄龙病种质材料62份，这些资源中可能存在具有柑橘黄龙病耐性的柑橘种质材料。然而，目前对柑橘黄龙病耐性柑橘种质材料的常用鉴定方法是将待鉴定种质材料嫁接到砧木上培育成幼苗，然后将感染黄龙病的芽、皮或枝段嫁接到幼苗上，使黄龙病菌传染到待鉴定的种质材料上，再通过黄龙病典型症状的表现及PCR检测情况判断该种质材料对柑橘黄龙病的耐性（黄小耘和田甜，2015;李彬，2019），鉴定周期较长，且存在接种病原数量少、效率低、成本高等缺点。【本研究切入点】鉴于此，有必要研发一种可快速鉴定柑橘黄龙病耐性种质材料的方法，以解决现有技术的不足。【拟解决的关键问题】研发一种可快速鉴定柑橘黄龙病耐性种质材料的方法，为加快柑橘黄龙病耐性育种进程和提高育种效率打下基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试材料共36份，为2014—2018年在广西调査、发掘和收集的疑似对柑橘黄龙病具有耐性的柑橘种质材料（表1）。36份种质材料分别嫁接在枳砧上，种植于广西特色作物研究院柑橘育种大棚内加以保存，目前生长情况较好，可满足接穗采集和嫁接使用。
1. 2 传（染）毒鉴定方法比较试验
1. 2. 1 嫁接传毒鉴定法（常规方法） 2017年9月，将收集的3份待鉴定沙糖橘种质材料KH-16、KH-17和KH-18取单芽采用小芽腹接法嫁接在枳砧上，于2018年3月剪去嫁接口以上的砧木枝干，至2018年9月抽发的嫁接芽长成小苗;同时，设沙糖橘无病苗为对照。2018年9月从沙糖橘黄龙病树上表现斑驳型黄化叶片症状的枝条上采集接穗，采用腹接法，嫁接到待鉴定的种质材料上，每株均嫁接3个黄龙病病树芽。对供试材料及对照定期进行黄龙病症状观察，并在嫁接传毒6个月后进行定性和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测。
1. 2. 2 高接染毒鉴定法 2018年3月将相同的3份待鉴定沙糖橘种质材料取单芽高接至黄龙病树上，成活后定期进行黄龙病症状观察，并在6个月后进行定性和实时荧光定量PCR检测;同时，将无毒沙糖橘芽高接至同一株黄龙病树上作为对照。
1. 3 高接染毒鉴定试验
1. 3. 1 高接树选择 在柑橘果园中选取感染黄龙病菌的柑橘树，并进行PCR检测加以确定。本次试验果园位于广西桂林市临桂区中庸乡江勒寨村。园中所种柑橘品种为沙糖橘，砧木为枳，共计112株，经PCR检测，112株树全部呈阳性，田间症状观察和PCR检测结果表明，所选的高接树均已感染黄龙病（图1）。
1. 3. 2 高接染毒鉴定试验 于2018年3月将供试材料高接至黄龙病树上。高接供试种质材料36份，其中2份材料由于天牛危害死亡，因此高接鉴定材料实为34份，高接方法为春接。
高接方法主要分为春接和秋接。春接：接种时间为2—4月，高接方式为单芽切接;操作方法：在高接树上选取直径0.5 cm以上的枝条，在树皮平滑处剪断，在枝条断面下方沿皮层与木质部交界处向下纵切一刀，露出形成层，切面短于接穗芽，然后从待鉴定种质材料的枝条上切取单芽，将单芽插入中间砧枝条切口上，对准双方形成层并缚紧。秋接：接种时间为9—11月，高接方式为小芽腹接;操作方法：在高接树上选取直径0.5 cm以上的枝条，在树皮平滑处沿皮层与木质部交界处向下纵切一刀，露出形成层，切面长度2.0～4.0 cm，然后从待鉴定种质材料的枝条上切取芽片，将芽片插入砧枝条切口上并缚紧，保留高接枝条。同时设同一品种的对照品种进行高接。 1. 3. 3 田间症状观察 高接4个月后，根据待鉴定种质材料抽出枝梢的症状进行诊断：枝梢生长良好、无黄梢、无斑驳型黄化叶或仅有轻微叶片黄化症状，则初步判定该种质材料对柑橘黄龙病具有耐性;枝梢生长较弱、黄梢严重、叶片斑驳型黄化症状明显，则初步判定该种质材料对柑橘黄龙病不具耐性。
1. 3. 4 实时荧光定量PCR检测 取高接成活且初步判定为对柑橘黄龙病具有耐性种质材料的叶片，采用改良CTAB法提取DNA（程运江等，2001），得到待测样品的DNA模板;从健康柑橘树的叶片中提取DNA作为阴性对照，从柑橘黄龙病树的叶片中提取DNA作为阳性对照;参照Li等（2006）的方法进行实时荧光定量PCR扩增，绘制标准曲线，并建立标准曲线方程，计算病原菌含量。
2 结果与分析
2. 1 两种鉴定方法结果
对3份沙糖橘种质材料KH-16、KH-17和KH-18进行田间症状观察，结果显示，采用嫁接传毒法的植株在接种毒源6个月后均表现出典型的叶片斑驳型黄化症状;采用高接染毒法的植株在高接3个月后开始出现黄龙病典型叶片黄化症状，4个月后黄龙病典型斑驳型叶片黄化症状明显。
对3份沙糖橘种质材料分别进行定性和实时荧光定量PCR检测，结果（表2）显示，采用嫁接传毒法的材料黄龙病菌平均含量为1079608.0个细胞/μg DNA，采用高接染毒法的材料黄龙病菌平均含量为1269969.7个细胞/μg DNA，较嫁接传毒法的病菌平均含量约高17.63%。
嫁接传毒鉴定法（常规方法）是在待鉴定种质上嫁接已感染黄龙病的芽、皮或枝段，使黄龙病菌传染到待鉴定的种质材料上，嫁接材料由于体积小，含有的病原數量较少，使得接种病原数量少，鉴定周期为10～16个月。高接染毒鉴定法是将待鉴定的种质材料直接高接在柑橘黄龙病树上，病原数量多且可持续侵染待鉴定的种质材料，高接成活后通过黄龙病症状观察结合黄龙病菌PCR定量检测进行耐性鉴定，鉴定周期为6个月。两者相比较，高接染毒鉴定法具有通量大、时间短、效率高、成本低及结果准确等优点。
2. 2 高接柑橘成活率调查结果
2018年7月31日，对高接试验果园的嫁接成活情况进行观察统计，高接芽共计397个，其中成活芽357个，成活率为89.92%。
2. 3 高接后田间症状观察结果
春季高接鉴定材料1个月后接芽萌发，2个月后接芽生长正常，3个月后开始出现黄龙病典型叶片黄化症状，4个月后黄龙病典型斑驳型叶片黄化症状明显（图2），可进行黄龙病田间症状观察和统计，同时进行黄龙病菌定性PCR检测（图3）。2018年6月5日首次出现典型的叶片斑驳型黄化症状，种质材料编号为KH-14（宫川）;6月19日观察发现9份种质材料的叶片出现斑驳型黄化症状;7月5日观察23份种质材料的叶片出现斑驳型黄化症状，另外11份种质材料未表现症状;8月7日观察只有6份种质材料（KH-21、KH-18、KH-12、KHY-4、KHY-5和KHY-6）的叶片未表现症状，其余材料出现叶片斑驳型黄化症状，说明34份种质材料对柑橘黄龙病的耐性存在差异;9月4日观察KH-18、KH-12、KHY-4、KHY-5和KHY-6等5份种质材料的生长虽然较正常，但叶片已出现黄化症状（非黄龙病典型斑驳型黄化症状），疑似感染黄龙病病菌，只有编号为KH-21材料（沙糖橘）的枝梢生长良好，无黄梢和斑驳型黄化叶，初步判定为对黄龙病具有耐性的种质材料。对照同一品种则已表现出典型的黄龙病症状，即枝梢生长较弱、黄梢严重、叶片斑驳型黄化症状明显，初步判定为对黄龙病不具耐性的种质材料。
2. 4 定量PCR检测结果
2018年9月7日，对8月7日观察的6份未表现黄龙病症状的种质材料进行定性PCR检测，结果表明，KH-21材料检测结果为阴性，其他5份材料检测结果为阳性，虽然5份材料已感染黄龙病菌，但其枝梢生长较正常、生长势较旺，感染时间也较晚，说明对黄龙病有一定的耐病性。2018年9月12日对定性PCR检测呈阴性的KH-21材料进行实时荧光定量PCR检测，结果表明，KH-21材料中的黄龙病菌含量为1809.0个细胞/μg DNA，对照材料黄龙病菌含量为951837.0个细胞/μg DNA（图4）;此后，在不同时期连续进行5次实时荧光定量PCR检测，结果显示，KH-21平均黄龙病菌含量为1870.0个细胞/μg DNA，对照材料平均黄龙病菌含量为372285.5个细胞/μg DNA ，对照含菌量是KH-21的199.1倍，说明KH-21材料中的黄龙病菌含量明显低于对照（图5）。
2. 5 田间症状结合实时荧光定量PCR检测对耐性种质的评价
实时荧光定量PCR检测及田间症状观察结果显示，编号为KH-21材料的枝梢生长良好，在试验果园内未观察到黄梢和叶片斑驳型黄化症状，且实时荧光定量PCR检测结果表明黄龙病菌含量为1809.0个细胞/μg DNA，表明KH-21对柑橘黄龙病具有耐性。
3 讨论
尽管黄龙病病原可感染所有柑橘主栽品种，且目前还未发现抗性资源和材料，但已有研究发现，不同柑橘品种对黄龙病的耐性不同，宽皮橘（C. reticulata）、甜橙（C. sinensis）和桔柚（C. reticulata×C. paradisi）最感病，柠檬（C. limonum）和葡萄柚（C. paradisi）较耐病，枳壳（Poncitrus. trifoliate）、来檬（C. aurantifolia）和枳橙（C. sinensis×P. trifoliate）最耐病（黄丽，2013）;胡柚、金柑和佛手较抗病，椪柑和瓯柑等较易感病（蒋自珍等，2006）。Shokrollah等（2011）通过柑橘嫁接试验证明，依据植株黄龙病症状可将供试材料分为5组：重症组，包括宽皮柑橘、甜橙和印度酸橘;中症组，包括金柑、阿力檬和小花大翼橙;轻症组，包括枸橼、部分来檬和粗柠檬等;耐病组（无黄龙病症状，但有黄龙病菌检出），包括酸橙和某些来檬;抗病组（无症状且黄龙病菌检测阴性），包括Limau Bali柚、马蜂柑和Limau Tembikai。林雄杰等（2014）测试13个枳属及其杂交种砧木对黄龙病的抗性，结果所有供试砧木品种均表现出黄龙病症状，其中LT49、5号小花枳、墨西哥枳橙、LT54和鄢陵枳橙等5个品种接穗上的黄龙病症状表现较严重。刘登全等（2014）采用黄龙病毒源树对不同柑橘品种进行嫁接，结果表明，椪柑高度感病，琯溪蜜柚次之，温州蜜柑高度抗病。McCollum等（2016）通过长期田间评估发现，大部分柑橘品种均易感染黄龙病，而澳沙檬和澳指檬等柑橘近缘属植物对黄龙病具有一定的抗/耐病性。以上研究均表明，不同柑橘品种对黄龙病的耐性存在差异。 目前，对柑橘黄龙病耐性种质材料的鉴定方法通常是嫁接传毒鉴定法，该方法的主要缺点是每份待鉴定材料只能通过嫁接来接种病原，由于嫁接材料体积小，含有的病原数量较少，使得接种病原数量少;此外，由于鉴定周期通常在10～16个月，时间长、效率低、成本高。本研究首次将待鉴定的种质材料直接高接在柑橘黄龙病病树上，高接成活后通过黄龙病症状观察，并结合黄龙病菌定量PCR检测进行耐性鉴定，即高接染毒鉴定法，目前国内外未见有类似报道。高接染毒鉴定法克服了现有技术的不足，提供了一種对柑橘黄龙病具有耐性的种质材料的快速鉴定方法：每份待鉴定种质材料直接嫁接在柑橘黄龙病病树上，病原数量多且可持续侵染待鉴定的种质材料;鉴定周期在6个月左右，具有通量大、时间短、效率高、成本低及结果准确等优点。
4 结论
本研究将待鉴定的种质材料直接高接于柑橘黄龙病病树上进行耐性鉴定，即高接染毒鉴定法，能达到快速鉴定柑橘品种对柑橘黄龙病耐性的目的，为开展柑橘黄龙病耐性育种和耐病分子机制研究打下一定基础，可在柑橘黄龙病耐性鉴定中推广使用。
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（责任编辑 麻小燕）