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摘 要：对206个收集自世界各地的双孢蘑菇栽培菌株的总DNA进行大规模的SRAP、ISSR和RAPD分析，共获得15条SRAP、3条ISSR和2条RAPD特异性标记条带。利用这20个标记条带对206个菌株中的具有代表性的3种不同农艺性状的131个菌株进行统计和分析，获得标记和相关性状的相关性。结果表明：试验共筛选到5个与双孢蘑菇质量性状明显相关的标记SRAP151000、SRAP23200、SRAP59650、SRAP510400、ISSR8092100；3个与双孢蘑菇产量性状明显相关的标记SRAP23400 、SRAP2
41200 、SRAP231800。研究获得的分子标记经下一步的验证，有望作为双孢蘑菇的杂交育种过程中高产、优质菌株筛选预测的特异性分子标记。
关键词：双孢蘑菇；栽培菌株；产量；质量；分子标记
DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2018.07.001
Abstract： In this paper， a large scale of SRAP， ISSR and RAPD analyses on DNAs from 206 cultivated strains of Agaricus bisporus collected from around the word were carried out. 15 specific SRAP bands， 3 specific ISSR bands and 2 specific RAPD bands were obtained. 131 strains with three different agronomic traits among 206 strains were analyzed using the above 20 specific bands to study relation between markers and traits. The results showed that there were five markers closely related to quality traits， includingSRAP151000，SRAP23200，SRAP59650，SRAP510400andISSR8092100and three markers closely related to yield traits， includingSRAP23400，SRAP241200andSRAP231800. All the above related markers should be further validated and expected to become the specific molecular markers for screening and predicting of high yield and high quality strains in cross breeding of Agaricus bisporus.
Key words： Agaricus bisporus； cultivated strains； yield； quality； molecular markers
双孢蘑菇（Agaricus bisporus）是世界上人工栽培最广泛、产量最高、消费量最大的食用菌，具有重要的经济价值。我国主栽的商业菌株As2796为福建省农业科学院食用菌研究所自主研发的品种，从选育至今已使用20年，品種更新换代亟须解决。产量、质量性状是食用菌品种的一个重要的性状，通过杂交育种将优良的产、质量性状整合在一起以实现农艺性状的提升是育种工作者常用的育种方法。但常规杂交育种对目的菌株的筛选存在盲目性强、工作量巨大等问题，严重影响了育种筛选的进程，急需定向的遗传筛选手段。近年来发展的DNA分子标记辅助育种技术是食用菌定向育种的一个重要方向。目前，与双孢蘑菇产、质量性状相关的分子标记上，尚无文献报道，所以非常有必要开展这方面的研究。本研究旨在探讨双孢蘑菇产质量紧密相关的分子标记，为缩短育种周期，简化育种工作量，实现定向育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌株 试验收集自世界各地206个双孢蘑菇栽培菌株[1]，由福建省农业科学院食用菌研究所保藏并提供。
1.1.2 试剂与仪器 PCR试剂盒及其他试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。试验SRAP上下游引物[2]、ISSR引物[3]、72条RAPD随机引物及序列[1]由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。试验仪器：电泳设备采用Pharmacia Biotech EPS 600，拍照设备采用BIOV 蓝盾 TM621。
1.2 方法
1.2.1 菌丝的培养 菌种接入常规PDA斜面培养基，24℃培养21 d。PDA培养基配方：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、水1000 mL。
1.2.2 总DNA的提取 基因组DNA提取采用真菌小量DNA提取法，提取方法参照文献＼[2＼]操作。
1.2.3 PCR反应 SRAP、ISSR和RAPD 3种标记的PCR反应体系各组分及含量参照文献＼[3＼]，扩增条件如表1所示。
电泳检测：扩增产物20 μL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。GeneFinder荧光染料染色并拍照。
2 结果与分析
2.1 双孢蘑菇栽培菌株的SRAP指纹图谱分析
先用不同类型的少数菌株进行SRAP引物对的筛选，选出能产生较佳带型和具有较好重复性的引物对：me1em2， me1em5， me2em3， me2em4， me5em9，me5em10。进一步用筛选出的引物对进行双孢蘑菇206个栽培菌株总DNA的SRAP分析，共获得了15条多态性特异条带，部分扩增结果及特异条带如图1所示。 2.2 双孢蘑菇栽培菌株的ISSR指纹图谱分析
在双孢蘑菇的ISSR引物初筛中发现，在52℃退火条件下，71个ISSR引物只有19个能产生可鉴别的稳定带型，其余均产生弥散状不可鉴别带型。这19个ISSR引物为807、808、809、810、811、822、825、827、834、835、841、842、852、853、854、855、857、866、868。利用这19个引物对上述10个SRAP标记条带未能区分的传统优质菌株72个和传统高产菌株24个作ISSR分析，获得了3条多态性特异条带，部分扩增结果及特异条带如图2所示。
2.3 双孢蘑菇栽培菌株的RAPD指纹图谱分析
以少数菌株进行RAPD扩增，对72个RAPD随机引物进行初筛，发现26个引物有较佳带型。进一步用26个随机引物对上述ISSR分析中的传统优质菌株72个和传统贴生菌株24个作RAPD分析，在找到新的标记后，再进一步对206个栽培菌株作RAPD分析。在26个引物中共发现2个引物（S258，S402）能稳定体现群内差异，扩增结果获得了2条多态性特异条带，部分的扩增结果及特异条带如图3所示。
2.4 双孢蘑菇栽培菌株DNA标记条带统计
以上述15条SRAP、3条ISSR和2条RAPD标记条带对206个双孢蘑菇栽培菌株相对应的DNA图谱进行分析和统计。15条SRAP、3条ISSR和2条RAPD标记条带名称及代号列于表2。相同引物PCR扩增产物中电泳迁移率一致的标记条带被认为属于同一条带，扩增阳性记录为“1”，扩增阴性记录为“0”，将图形资料转换成“0-1”数据资料，用于软件分析。
2.5 双孢蘑菇产、质量相关的分子标记统计分析
结合菌株的农艺学性状和酯酶同工酶表型，从上述206个菌株中选取具有代表性的131个菌株作为统计分析的样本，这131个菌株中包括了49个传统的优质不高产菌株（同工酶表型G型）、49个传统的高产不优质菌株（同工酶表型H型）及33个优质高产杂交菌株（同工酶表型HG4型，同As2796）。从表3可以看出，与双孢蘑菇质量性状明显相关的标记有SRAP151000、SRAP23200、SRAP59650、SRAP510400、ISSR8092100；与双孢蘑菇产量性状明显相关的标记有SRAP23400、SRAP241200、SRAP231800。
从标记的相关程度上看，在质量性状上，标记SRAP510400和ISSR8092100与双孢蘑菇的质量性状相关度较高。标记SRAP510400与质量性状相关性达96%（47/49），与产量性状相关性为0%（0/49）；标记ISSR8092100与质量性状相关性达82%（40/49），与产量性状相关性为4%（2/49）。
在产量性状上，标记SRAP23400、SRAP241200和SRAP231800与双孢蘑菇的产量性状相关度很高。标记SRAP23400与产量性状的相关性达86%（42/49），与产量性状相关性为2%（1/49）；标记SRAP241200与产量性状的相关性达98%（48/49），与质量性状相关性为2%（1/49）； 标记SRAP231800与产量性状的相关性达76%（37/49），与质量性状相关性为0%（0/49）。
3 讨论
在双孢蘑菇性状相关的分子标记的研究上，学者们在单孢可育性[4]、子实体颜色[5]、分解基质能力[6]、耐热性[7]及丛生变异[8]等性状上开展了研究并取得一些可用的标记。但在产量、质量性状相关的分子标记研究上却鲜有报道。本研究通过大规模的SRAP、ISSR、RAPD的扩增结合菌株的农艺性状的表型，探索可能存在的产、质量性状和相关分子标记的关联性。数据统计结果表明：特定标记与双孢蘑菇产、质量性状具有明显的关联性。从标记在不同的3类菌株扩增的阳（阴）性的情况来看，同一个标记在传统的（非杂交）优质不高产菌株和高产优质杂交菌株中的扩增阳（阴）性率存在差异，这个可能的原因是因为质量性状属于数量性状，其表现为连续变异的性状，决定性状的表型是由为数众多的微效基因所控制，而非单一的基因控制，且多个微效基因对性状的贡献度也会存在差异。对杂交菌株而言，由于遗传物质的重组和重新分配，控制数量性状的微效基因（或因子）在杂交子代中得到不同程度的继承，导致子代出现性状表型上的连续变异。由于本研究所采用的标记为共显性标记，标记扩增结果的阳（阴）性与标记紧密相关的性状的微效基因的有无相关。对于标记SRAP510400，在优质不高产菌株的扩增阳性率为96%（47/49），而在高产优质杂交菌株中的扩增阳性率为33%（11/33），同一标记在同一性状的杂交菌株（高产优质杂交菌株）与非杂交菌株（传统优质不高产菌株）间扩增阳性率的差异可能与杂交过程中的遗传物质重组和重新分配，及该标记所紧密连锁的微效基因对性状的贡献率有关。
本研究利用SRAP、ISSR、RAPD分子標记技术，并采用混合分离个体分析法，通过分组建立差异库并扩大样品数量的方法来消除本底差异的干扰。选择了两类具不同典型性状的双孢蘑菇品系作为分析差异的两个DNA 库，有效地降低了两个DNA 库的本底差异，为研究的可靠性提供了保证。本研究中获得与双孢蘑菇质量性状明显相关的 标 记 SRAP151000、SRAP23200、SRAP59650、SRAP510400、ISSR8092100及与双孢蘑菇产量性状明显相关的标记SRAP23400、SRAP241200、SRAP231800，这些标记有望在双孢蘑菇杂交育种中作为产质量性状的辅助筛选标记。
参考文献：
[1]郭仲杰.双孢蘑菇栽培菌株的农艺学性状与DNA指纹分析[D].福州：福建农林大学，2009.
[2]陈美元，廖剑华，李洪荣，等.双孢蘑菇栽培菌株遗传多样性的DNA指纹分析[J].中国农学通报，2009，25（4）：149-156.
[3]陈美元，廖剑华，王波，等.中国野生蘑菇属90个菌株遗传多样性的DNA指纹分析[J].食用菌学报，2009，16（1）：11-16.
[4]蔡志欣，陈美元，廖剑华，等.双孢蘑菇不同交配型同核不育单孢的基因组文库构建[J].福建农业学报，2017，32（12）：1327-1331.
[5]蔡志欣，陈美元，廖剑华，等.双孢蘑菇颜色基因分子标记的初步筛选[J].食用菌学报，2014，21（3）：1-5.
[6]李洪荣，陈美元，廖剑华，等.双孢蘑菇分解基质能力退化的同工酶分析[J].食用菌学报，2010，17（2）：52-55.
[7]陈美元.双孢蘑菇耐热相关基因0281的克隆与序列分析[J].福建轻纺，2006（9）：1-5.
[8]陈美元，王泽生，廖剑华，等.双孢蘑菇丛生变异的RAPD分析及差异片段的克隆[J].厦门大学学报（自然科学版），2003（5）：657-660.
（责任编辑：林玲娜）
41200 、SRAP231800。研究获得的分子标记经下一步的验证，有望作为双孢蘑菇的杂交育种过程中高产、优质菌株筛选预测的特异性分子标记。
关键词：双孢蘑菇；栽培菌株；产量；质量；分子标记
DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2018.07.001
Abstract： In this paper， a large scale of SRAP， ISSR and RAPD analyses on DNAs from 206 cultivated strains of Agaricus bisporus collected from around the word were carried out. 15 specific SRAP bands， 3 specific ISSR bands and 2 specific RAPD bands were obtained. 131 strains with three different agronomic traits among 206 strains were analyzed using the above 20 specific bands to study relation between markers and traits. The results showed that there were five markers closely related to quality traits， includingSRAP151000，SRAP23200，SRAP59650，SRAP510400andISSR8092100and three markers closely related to yield traits， includingSRAP23400，SRAP241200andSRAP231800. All the above related markers should be further validated and expected to become the specific molecular markers for screening and predicting of high yield and high quality strains in cross breeding of Agaricus bisporus.
Key words： Agaricus bisporus； cultivated strains； yield； quality； molecular markers
双孢蘑菇（Agaricus bisporus）是世界上人工栽培最广泛、产量最高、消费量最大的食用菌，具有重要的经济价值。我国主栽的商业菌株As2796为福建省农业科学院食用菌研究所自主研发的品种，从选育至今已使用20年，品種更新换代亟须解决。产量、质量性状是食用菌品种的一个重要的性状，通过杂交育种将优良的产、质量性状整合在一起以实现农艺性状的提升是育种工作者常用的育种方法。但常规杂交育种对目的菌株的筛选存在盲目性强、工作量巨大等问题，严重影响了育种筛选的进程，急需定向的遗传筛选手段。近年来发展的DNA分子标记辅助育种技术是食用菌定向育种的一个重要方向。目前，与双孢蘑菇产、质量性状相关的分子标记上，尚无文献报道，所以非常有必要开展这方面的研究。本研究旨在探讨双孢蘑菇产质量紧密相关的分子标记，为缩短育种周期，简化育种工作量，实现定向育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌株 试验收集自世界各地206个双孢蘑菇栽培菌株[1]，由福建省农业科学院食用菌研究所保藏并提供。
1.1.2 试剂与仪器 PCR试剂盒及其他试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。试验SRAP上下游引物[2]、ISSR引物[3]、72条RAPD随机引物及序列[1]由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。试验仪器：电泳设备采用Pharmacia Biotech EPS 600，拍照设备采用BIOV 蓝盾 TM621。
1.2 方法
1.2.1 菌丝的培养 菌种接入常规PDA斜面培养基，24℃培养21 d。PDA培养基配方：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、水1000 mL。
1.2.2 总DNA的提取 基因组DNA提取采用真菌小量DNA提取法，提取方法参照文献＼[2＼]操作。
1.2.3 PCR反应 SRAP、ISSR和RAPD 3种标记的PCR反应体系各组分及含量参照文献＼[3＼]，扩增条件如表1所示。
电泳检测：扩增产物20 μL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。GeneFinder荧光染料染色并拍照。
2 结果与分析
2.1 双孢蘑菇栽培菌株的SRAP指纹图谱分析
先用不同类型的少数菌株进行SRAP引物对的筛选，选出能产生较佳带型和具有较好重复性的引物对：me1em2， me1em5， me2em3， me2em4， me5em9，me5em10。进一步用筛选出的引物对进行双孢蘑菇206个栽培菌株总DNA的SRAP分析，共获得了15条多态性特异条带，部分扩增结果及特异条带如图1所示。 2.2 双孢蘑菇栽培菌株的ISSR指纹图谱分析
在双孢蘑菇的ISSR引物初筛中发现，在52℃退火条件下，71个ISSR引物只有19个能产生可鉴别的稳定带型，其余均产生弥散状不可鉴别带型。这19个ISSR引物为807、808、809、810、811、822、825、827、834、835、841、842、852、853、854、855、857、866、868。利用这19个引物对上述10个SRAP标记条带未能区分的传统优质菌株72个和传统高产菌株24个作ISSR分析，获得了3条多态性特异条带，部分扩增结果及特异条带如图2所示。
2.3 双孢蘑菇栽培菌株的RAPD指纹图谱分析
以少数菌株进行RAPD扩增，对72个RAPD随机引物进行初筛，发现26个引物有较佳带型。进一步用26个随机引物对上述ISSR分析中的传统优质菌株72个和传统贴生菌株24个作RAPD分析，在找到新的标记后，再进一步对206个栽培菌株作RAPD分析。在26个引物中共发现2个引物（S258，S402）能稳定体现群内差异，扩增结果获得了2条多态性特异条带，部分的扩增结果及特异条带如图3所示。
2.4 双孢蘑菇栽培菌株DNA标记条带统计
以上述15条SRAP、3条ISSR和2条RAPD标记条带对206个双孢蘑菇栽培菌株相对应的DNA图谱进行分析和统计。15条SRAP、3条ISSR和2条RAPD标记条带名称及代号列于表2。相同引物PCR扩增产物中电泳迁移率一致的标记条带被认为属于同一条带，扩增阳性记录为“1”，扩增阴性记录为“0”，将图形资料转换成“0-1”数据资料，用于软件分析。
2.5 双孢蘑菇产、质量相关的分子标记统计分析
结合菌株的农艺学性状和酯酶同工酶表型，从上述206个菌株中选取具有代表性的131个菌株作为统计分析的样本，这131个菌株中包括了49个传统的优质不高产菌株（同工酶表型G型）、49个传统的高产不优质菌株（同工酶表型H型）及33个优质高产杂交菌株（同工酶表型HG4型，同As2796）。从表3可以看出，与双孢蘑菇质量性状明显相关的标记有SRAP151000、SRAP23200、SRAP59650、SRAP510400、ISSR8092100；与双孢蘑菇产量性状明显相关的标记有SRAP23400、SRAP241200、SRAP231800。
从标记的相关程度上看，在质量性状上，标记SRAP510400和ISSR8092100与双孢蘑菇的质量性状相关度较高。标记SRAP510400与质量性状相关性达96%（47/49），与产量性状相关性为0%（0/49）；标记ISSR8092100与质量性状相关性达82%（40/49），与产量性状相关性为4%（2/49）。
在产量性状上，标记SRAP23400、SRAP241200和SRAP231800与双孢蘑菇的产量性状相关度很高。标记SRAP23400与产量性状的相关性达86%（42/49），与产量性状相关性为2%（1/49）；标记SRAP241200与产量性状的相关性达98%（48/49），与质量性状相关性为2%（1/49）； 标记SRAP231800与产量性状的相关性达76%（37/49），与质量性状相关性为0%（0/49）。
3 讨论
在双孢蘑菇性状相关的分子标记的研究上，学者们在单孢可育性[4]、子实体颜色[5]、分解基质能力[6]、耐热性[7]及丛生变异[8]等性状上开展了研究并取得一些可用的标记。但在产量、质量性状相关的分子标记研究上却鲜有报道。本研究通过大规模的SRAP、ISSR、RAPD的扩增结合菌株的农艺性状的表型，探索可能存在的产、质量性状和相关分子标记的关联性。数据统计结果表明：特定标记与双孢蘑菇产、质量性状具有明显的关联性。从标记在不同的3类菌株扩增的阳（阴）性的情况来看，同一个标记在传统的（非杂交）优质不高产菌株和高产优质杂交菌株中的扩增阳（阴）性率存在差异，这个可能的原因是因为质量性状属于数量性状，其表现为连续变异的性状，决定性状的表型是由为数众多的微效基因所控制，而非单一的基因控制，且多个微效基因对性状的贡献度也会存在差异。对杂交菌株而言，由于遗传物质的重组和重新分配，控制数量性状的微效基因（或因子）在杂交子代中得到不同程度的继承，导致子代出现性状表型上的连续变异。由于本研究所采用的标记为共显性标记，标记扩增结果的阳（阴）性与标记紧密相关的性状的微效基因的有无相关。对于标记SRAP510400，在优质不高产菌株的扩增阳性率为96%（47/49），而在高产优质杂交菌株中的扩增阳性率为33%（11/33），同一标记在同一性状的杂交菌株（高产优质杂交菌株）与非杂交菌株（传统优质不高产菌株）间扩增阳性率的差异可能与杂交过程中的遗传物质重组和重新分配，及该标记所紧密连锁的微效基因对性状的贡献率有关。
本研究利用SRAP、ISSR、RAPD分子標记技术，并采用混合分离个体分析法，通过分组建立差异库并扩大样品数量的方法来消除本底差异的干扰。选择了两类具不同典型性状的双孢蘑菇品系作为分析差异的两个DNA 库，有效地降低了两个DNA 库的本底差异，为研究的可靠性提供了保证。本研究中获得与双孢蘑菇质量性状明显相关的 标 记 SRAP151000、SRAP23200、SRAP59650、SRAP510400、ISSR8092100及与双孢蘑菇产量性状明显相关的标记SRAP23400、SRAP241200、SRAP231800，这些标记有望在双孢蘑菇杂交育种中作为产质量性状的辅助筛选标记。
参考文献：
[1]郭仲杰.双孢蘑菇栽培菌株的农艺学性状与DNA指纹分析[D].福州：福建农林大学，2009.
[2]陈美元，廖剑华，李洪荣，等.双孢蘑菇栽培菌株遗传多样性的DNA指纹分析[J].中国农学通报，2009，25（4）：149-156.
[3]陈美元，廖剑华，王波，等.中国野生蘑菇属90个菌株遗传多样性的DNA指纹分析[J].食用菌学报，2009，16（1）：11-16.
[4]蔡志欣，陈美元，廖剑华，等.双孢蘑菇不同交配型同核不育单孢的基因组文库构建[J].福建农业学报，2017，32（12）：1327-1331.
[5]蔡志欣，陈美元，廖剑华，等.双孢蘑菇颜色基因分子标记的初步筛选[J].食用菌学报，2014，21（3）：1-5.
[6]李洪荣，陈美元，廖剑华，等.双孢蘑菇分解基质能力退化的同工酶分析[J].食用菌学报，2010，17（2）：52-55.
[7]陈美元.双孢蘑菇耐热相关基因0281的克隆与序列分析[J].福建轻纺，2006（9）：1-5.
[8]陈美元，王泽生，廖剑华，等.双孢蘑菇丛生变异的RAPD分析及差异片段的克隆[J].厦门大学学报（自然科学版），2003（5）：657-660.
（责任编辑：林玲娜）