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摘要 [目的]建立HPLC法同时测定功能性饮料中13种食品添加剂含量的分析方法。[方法]样品经稀释过滤后直接进样;流动相为甲醇-0.02 mol/L乙酸铵梯度洗脱。[结果]13种食品添加剂在30 min内能够很好地分离，浓度在1～100 μg/mL具有良好的线性关系（ R 2>0.999）;检出限在0.03～0.78 mg/kg，样品加标回收率在85.2%～103.4%，相对标准偏差（RSD）为0.68%～4.27%。[结论]该方法前处理简单、重复性好、回收率和精密度等满足检验要求，适用于功能性饮料中添加剂的测定。
关键词 功能性饮料;食品添加剂;高效液相色谱
中图分类号 TS 272.7 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）15-0185-03
Abstract [Objective]To establish an analytical method for the simultaneous determination of 13 food additives in functional beverages by HPLC.[Method]The sample was directly injected after dilution and filtration.The mobile phase was gradient elution of methanol -20 mmol/L ammonium acetate， and quantitative analysis by external standard method. [Result]13 kinds of food additives could be separated well within 30 minutes， and the concentration was 1-100 μg/mL with a good linear relationship （ R 2>0.999）.The detection limit was 0.03-0.78 mg/kg， the sample recovery rate was 85.2%-103.4%， and the relative standard deviation （RSD） was 0.68%-4.27%.[Conclusion]The method has the advantages of simple pretreatment， good repeatability， recovery precision and so on， and is suitable for the determination of additives in functional drinks.
Key words Functional drinks;Food additives;High performance liquid chromatography
作者簡介 史立学（1987—），男，甘肃天水人，工程师，硕士，从事食品安全分析与检验检测研究。
收稿日期 2021-03-17
功能性饮料一般是指通过调整饮料中营养素的成分和含量比例，在一定程度上能够调节人体功能的饮料。功能性饮料大多含有维生素、葡萄糖、矿物质以及钾、钠、钙、镁等，成分与人体体液相似，饮用后能迅速被人体吸收，深受人们的青睐。但因某些不法商贩为达到降低成本、保证产品色泽、延长保质期等目的，而致使过量添加相关食品添加剂（主要包括防腐剂、甜味剂、合成色素等）[1-2]。在《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[3]以及《国家食品安全监督抽检实施细则（2021年版）》中对饮料中的各类添加剂的检测和限量有明确要求。
经文献查阅，食品中各类添加剂以及人工合成色素的检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、超高效液相色谱法等[4-11]。其中高效液相色谱法因其灵敏度高、重复性好、检测成本低、结果准确等优点，已成为食品、医药和环境领域广泛使用的分析方法。该试验建立了采用高效液相色谱法同时检测功能性饮料中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、咖啡因、诱惑红、亮蓝、赤藓红B共13种化合物的分析方法，并对功能性饮料中可能添加的甜蜜素、脱氢乙酸进行了干扰试验。
1 材料与方法
1.1 仪器
岛津液相色谱仪（日本岛津），配有PDA检测器;旋涡混匀器（Thermo Scientific）;超声波清洗机（宁波新芝）;分析天平（赛多利斯）;冷冻离心机（Thermo Scientific）;移液枪（Eppendorf）。
1.2 试剂
标准溶液均购置于坛墨质检科技股份有限公司且浓度均为1 000 μg/mL，包括山梨酸、苯甲酸、糖精钠、安赛蜜、甜蜜素、脱氢乙酸、水中8种合成色素混标（柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、赤藓红B）;咖啡因（纯度≥99.8%）购置于中国计量科学研究院;无水乙醇（色谱纯）;超纯水（屈臣氏）;乙酸铵（优级纯）。
1.3 标准溶液配制
1.3.1
咖啡因标准溶液（1 000 μg/mL）。准确称取咖啡因标准品10 mg（精确至0.1 mg）于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容。
1.3.2 标准系列工作液。
依次吸取1 000 μg/mL各标准溶液1.00 mL，混匀后用水定容至10 mL容量瓶中，制成100 μg/mL标准储备液，然后吸取混合后标准储备液0.10、0.50、1.00、2.00、5.00 mL，用水定容至10 mL，各自制成100、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/mL标准系列工作液，上述操作避光进行。 1.4 色谱条件
色谱柱为InertSustain C18（5 μm×4.6 mm×250 mm）;柱温35 ℃;流动相为甲醇-0.02 mol/L乙酸铵;流速1.0 mL/min;流动相梯度洗脱程序见表1。
1.5 样品处理
准确称取约5 g（精确至0.001 g）试样于50 mL容量瓶中，加水25 mL，涡旋、超声后，用水定容至刻度。混匀后取适量溶液，过0.22 μm滤膜，直接上机分析。标准色谱图见图1。
2 结果与分析
2.1 流动相的梯度优化
由于目标化合物种类较多，等度洗脱很难将其分离，所以采用梯度洗脱以提高分析效率和分离效果，不同比例的流动相对化合物的分离影响显著，尤其是甲醇在流动相中所占比例对化合物保留时间有较大影响[12]。通过优化试验，最终确定以0.02 mol/mL乙酸铵∶甲醇（95∶5）为初始流動相，按照梯度洗脱条件进样，该梯度洗脱程序在30 min内能够较好地对样品进行分离检测。
2.2 检测波长的选择
采用二极管阵列检测器，在190～800 nm对所有目标化合物进行紫外波长扫描，参考国标GB 5009.28—2016和GB 5009.35—2016等标准方法，山梨酸、苯甲酸、糖精钠吸收波长为230 nm，8种合成着色剂吸收波长为254 nm，而咖啡因、安赛蜜、脱氢乙酸、甜蜜素在254 nm波长下均有吸收，通过试验发现，13种目标化合物在254 nm均有吸收，所以最终选择254 nm为吸收波长。
2.3 甜蜜素、脱氢乙酸干扰试验
对于功能性饮料中有可能加入的甜蜜素和脱氢乙酸进行了验证试验，结果表明，二者均能在该方法下与其他添加剂有效分离，不会对检测结果产生影响。
2.4 线性范围和检出限
按“1.4”色谱条件对13种食品添加剂标准溶液进行测定，进样浓度从低到高，以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标绘制工作标准曲线，以3倍信噪比（ S/N ）作为方法的检出限，其线性关系、决定系数和检出限见表2。
2.5 加标回收率和精密度
按“1.5”方法制备18份阴性加标样品，分别加入10、50、100 μg/mL 3个水平进行加标回收试验，计算13种化合物的回收率和精密度，结果表明（表3），13种化合物的平均回收率在85.2%～103.4%，相对标准偏差（RSD）均不大于4.27%，所建方法的回收率和精密度均满足检测要求。
2.6 样品测定
随机抽取市场销售功能性饮料，按照“1.5”方法进行样品处理后上机分析，结果均符合 GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[3]规定的最大允许值，样品色谱图见图2。
3 结论
该试验建立了一种高效液相色谱法同时检测功能性饮料中13种添加剂的分析方法，方法简化了前处理操作，对检测波长、梯度洗脱程序进行了优化，同时排除了甜蜜素和脱氢乙酸的干扰，并随机抽取市售饮料进行检测，结果表明该方法具有前处理简单、分离度高、重复性好等特点，适用于功能性饮料中添加剂的测定。
参考文献
[1] 吴金模.食品添加剂的种类与作用及其安全使用[J].广西轻工业，2009，25（6）：11，16
[2] 陈旋，王梦格.食品添加剂在饮料中的应用及危害浅谈[J].农村经济与科技，2019（14）：32，37.
[3] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品添加剂使用标准：GB 2760—2014[S].北京：中国标准出版社，2015.
[4] 江生，敖菊梅，潘正，等.高效液相色谱法同时快速测定饮料中的12种食品添加剂[J].分析试验室，2017，36（6）：729-731.
[5] 马康，蒋孝雄，赵敏，等.高效液相色谱法同时测定软饮料中20种食品添加剂[J].分析化学，2012，40（11）：1661-1667.
[6] 周佳，禹洁，朱书强，等.饮料及配制酒中11种有机合成色素的低共熔溶剂萃取/高效液相色谱法测定[J].分析测试学报，2019，38（11）：1358-1363.
[7] 武太鹏，张京晨，马康.UPLC-DAD法同时测定预调鸡尾酒中24种水溶性合成色素[J].分析测试学报，2019，38（2）：207-212.
[8] 夏宗艳，徐文远，徐豪，等.超高压液相色谱同时检测食品中8种人工合成色素[J].化工技术与开发，2019，48（1）：52-56.
[9] 尤妍，潘辉国，陈盼盼，等.高效液相色谱法同时测定饮料中5种添加剂[J].食品研究与开发，2016，37（4）：164-166.
[10] 刘胜男，张国庆，王素方，等.高效液相色谱法同时测定果蔬汁饮料中20种禁限用食品添加剂[J].轻工学报，2016，31（4）：23-29.
[11] 罗亮，姚帮本，吴巧.高效液相色谱法测定食品中5种防腐剂和甜味剂[J].安徽农业科学，2016，44（10）：95-97.
[12] 鲁娜，杜丽平.HPLC法高效检测果汁饮料中10种添加剂[J].现代食品，2020（6）：181-183.
关键词 功能性饮料;食品添加剂;高效液相色谱
中图分类号 TS 272.7 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）15-0185-03
Abstract [Objective]To establish an analytical method for the simultaneous determination of 13 food additives in functional beverages by HPLC.[Method]The sample was directly injected after dilution and filtration.The mobile phase was gradient elution of methanol -20 mmol/L ammonium acetate， and quantitative analysis by external standard method. [Result]13 kinds of food additives could be separated well within 30 minutes， and the concentration was 1-100 μg/mL with a good linear relationship （ R 2>0.999）.The detection limit was 0.03-0.78 mg/kg， the sample recovery rate was 85.2%-103.4%， and the relative standard deviation （RSD） was 0.68%-4.27%.[Conclusion]The method has the advantages of simple pretreatment， good repeatability， recovery precision and so on， and is suitable for the determination of additives in functional drinks.
Key words Functional drinks;Food additives;High performance liquid chromatography
作者簡介 史立学（1987—），男，甘肃天水人，工程师，硕士，从事食品安全分析与检验检测研究。
收稿日期 2021-03-17
功能性饮料一般是指通过调整饮料中营养素的成分和含量比例，在一定程度上能够调节人体功能的饮料。功能性饮料大多含有维生素、葡萄糖、矿物质以及钾、钠、钙、镁等，成分与人体体液相似，饮用后能迅速被人体吸收，深受人们的青睐。但因某些不法商贩为达到降低成本、保证产品色泽、延长保质期等目的，而致使过量添加相关食品添加剂（主要包括防腐剂、甜味剂、合成色素等）[1-2]。在《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[3]以及《国家食品安全监督抽检实施细则（2021年版）》中对饮料中的各类添加剂的检测和限量有明确要求。
经文献查阅，食品中各类添加剂以及人工合成色素的检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、超高效液相色谱法等[4-11]。其中高效液相色谱法因其灵敏度高、重复性好、检测成本低、结果准确等优点，已成为食品、医药和环境领域广泛使用的分析方法。该试验建立了采用高效液相色谱法同时检测功能性饮料中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、咖啡因、诱惑红、亮蓝、赤藓红B共13种化合物的分析方法，并对功能性饮料中可能添加的甜蜜素、脱氢乙酸进行了干扰试验。
1 材料与方法
1.1 仪器
岛津液相色谱仪（日本岛津），配有PDA检测器;旋涡混匀器（Thermo Scientific）;超声波清洗机（宁波新芝）;分析天平（赛多利斯）;冷冻离心机（Thermo Scientific）;移液枪（Eppendorf）。
1.2 试剂
标准溶液均购置于坛墨质检科技股份有限公司且浓度均为1 000 μg/mL，包括山梨酸、苯甲酸、糖精钠、安赛蜜、甜蜜素、脱氢乙酸、水中8种合成色素混标（柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、赤藓红B）;咖啡因（纯度≥99.8%）购置于中国计量科学研究院;无水乙醇（色谱纯）;超纯水（屈臣氏）;乙酸铵（优级纯）。
1.3 标准溶液配制
1.3.1
咖啡因标准溶液（1 000 μg/mL）。准确称取咖啡因标准品10 mg（精确至0.1 mg）于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容。
1.3.2 标准系列工作液。
依次吸取1 000 μg/mL各标准溶液1.00 mL，混匀后用水定容至10 mL容量瓶中，制成100 μg/mL标准储备液，然后吸取混合后标准储备液0.10、0.50、1.00、2.00、5.00 mL，用水定容至10 mL，各自制成100、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/mL标准系列工作液，上述操作避光进行。 1.4 色谱条件
色谱柱为InertSustain C18（5 μm×4.6 mm×250 mm）;柱温35 ℃;流动相为甲醇-0.02 mol/L乙酸铵;流速1.0 mL/min;流动相梯度洗脱程序见表1。
1.5 样品处理
准确称取约5 g（精确至0.001 g）试样于50 mL容量瓶中，加水25 mL，涡旋、超声后，用水定容至刻度。混匀后取适量溶液，过0.22 μm滤膜，直接上机分析。标准色谱图见图1。
2 结果与分析
2.1 流动相的梯度优化
由于目标化合物种类较多，等度洗脱很难将其分离，所以采用梯度洗脱以提高分析效率和分离效果，不同比例的流动相对化合物的分离影响显著，尤其是甲醇在流动相中所占比例对化合物保留时间有较大影响[12]。通过优化试验，最终确定以0.02 mol/mL乙酸铵∶甲醇（95∶5）为初始流動相，按照梯度洗脱条件进样，该梯度洗脱程序在30 min内能够较好地对样品进行分离检测。
2.2 检测波长的选择
采用二极管阵列检测器，在190～800 nm对所有目标化合物进行紫外波长扫描，参考国标GB 5009.28—2016和GB 5009.35—2016等标准方法，山梨酸、苯甲酸、糖精钠吸收波长为230 nm，8种合成着色剂吸收波长为254 nm，而咖啡因、安赛蜜、脱氢乙酸、甜蜜素在254 nm波长下均有吸收，通过试验发现，13种目标化合物在254 nm均有吸收，所以最终选择254 nm为吸收波长。
2.3 甜蜜素、脱氢乙酸干扰试验
对于功能性饮料中有可能加入的甜蜜素和脱氢乙酸进行了验证试验，结果表明，二者均能在该方法下与其他添加剂有效分离，不会对检测结果产生影响。
2.4 线性范围和检出限
按“1.4”色谱条件对13种食品添加剂标准溶液进行测定，进样浓度从低到高，以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标绘制工作标准曲线，以3倍信噪比（ S/N ）作为方法的检出限，其线性关系、决定系数和检出限见表2。
2.5 加标回收率和精密度
按“1.5”方法制备18份阴性加标样品，分别加入10、50、100 μg/mL 3个水平进行加标回收试验，计算13种化合物的回收率和精密度，结果表明（表3），13种化合物的平均回收率在85.2%～103.4%，相对标准偏差（RSD）均不大于4.27%，所建方法的回收率和精密度均满足检测要求。
2.6 样品测定
随机抽取市场销售功能性饮料，按照“1.5”方法进行样品处理后上机分析，结果均符合 GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[3]规定的最大允许值，样品色谱图见图2。
3 结论
该试验建立了一种高效液相色谱法同时检测功能性饮料中13种添加剂的分析方法，方法简化了前处理操作，对检测波长、梯度洗脱程序进行了优化，同时排除了甜蜜素和脱氢乙酸的干扰，并随机抽取市售饮料进行检测，结果表明该方法具有前处理简单、分离度高、重复性好等特点，适用于功能性饮料中添加剂的测定。
参考文献
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[5] 马康，蒋孝雄，赵敏，等.高效液相色谱法同时测定软饮料中20种食品添加剂[J].分析化学，2012，40（11）：1661-1667.
[6] 周佳，禹洁，朱书强，等.饮料及配制酒中11种有机合成色素的低共熔溶剂萃取/高效液相色谱法测定[J].分析测试学报，2019，38（11）：1358-1363.
[7] 武太鹏，张京晨，马康.UPLC-DAD法同时测定预调鸡尾酒中24种水溶性合成色素[J].分析测试学报，2019，38（2）：207-212.
[8] 夏宗艳，徐文远，徐豪，等.超高压液相色谱同时检测食品中8种人工合成色素[J].化工技术与开发，2019，48（1）：52-56.
[9] 尤妍，潘辉国，陈盼盼，等.高效液相色谱法同时测定饮料中5种添加剂[J].食品研究与开发，2016，37（4）：164-166.
[10] 刘胜男，张国庆，王素方，等.高效液相色谱法同时测定果蔬汁饮料中20种禁限用食品添加剂[J].轻工学报，2016，31（4）：23-29.
[11] 罗亮，姚帮本，吴巧.高效液相色谱法测定食品中5种防腐剂和甜味剂[J].安徽农业科学，2016，44（10）：95-97.
[12] 鲁娜，杜丽平.HPLC法高效检测果汁饮料中10种添加剂[J].现代食品，2020（6）：181-183.