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[摘要] 目的 从人胎盘中分离纯化Ⅳ型胶原蛋白，为制备其抗体提供抗原。 方法 选择人胎盘为提取原料，用胃蛋白酶消化、氯化钠盐析、凝胶化、超速离心、离子交换层析等方法，提取纯化Ⅳ型胶原蛋白。采用SDS-PAGE对提取的Ⅳ型胶原蛋白进行鉴定。 结果 胃蛋白酶消化法，使获得胶原蛋白的胶原链部分断裂，凝胶化方法可预先分离出组织中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白，保留了Ⅳ、Ⅴ胶原蛋白，DEAE-Sephrose 层析图表明，层析柱吸附的蛋白经洗脱得一主峰，经SDS-PAGE 证实提取的Ⅳ型胶原蛋白的分子量80Kd和40Kd两条带。 结论 从人胎盘中提取的Ⅳ型胶原蛋白纯度高，符合Ⅳ型胶原的特征。提取材料广泛、实验条件简便，结果可靠。
[关键词] Ⅳ型胶原蛋白；凝胶化；提取；纯化
[中图分类号] TQ464.7 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）19-56-02
Ⅳ型胶原（collagen type Ⅳ，Col Ⅳ）主要存在于各器官的基底膜中，是基底膜的微量成分[1]；是维持组织结构和调节细胞和细胞间相互作用的重要成分。近年来研究表明，许多增生性的疾病其Col Ⅳ含量与病变程度呈正相关；特别是在肝硬化诊断和分型方面，Col Ⅳ含量的检测更为重要[2-4]。目前，国内由于缺乏Col Ⅳ纯品，使其抗体制备受到限制，对其研究和检测技术发展受到影响。
本研究旨在探讨整合几种Col Ⅳ的纯化方法，建立以酶消化、超速离心、离子交换层析等技术联合应用，从人胎盘中分离提纯Col Ⅳ程序的可行性，为其抗体制备提供高品质抗原。
1 材料与方法
1.1 主要仪器
LP型低压层析系统（BIO-RAD）、AKTA prime plus蛋白分析仪（GE）、CP100WX超速离心机（HITACHI）、tff超滤浓缩仪（MILLIPORE）、DYY-8C电泳仪（北京六一仪器厂）。
1.2 主要试剂
胃蛋白酶（1∶80000，生工）、EDTA、胃蛋白酶抑制素、磺酰苯甲烷、N-马来乙酰胺（优级纯，生工）及相关转印试剂等。
1.3 提纯
选取新鲜正常分娩胎盘一个，置于-20℃冰箱内冷冻12h，粉碎机粉碎组织，采用含4mM EDTA，2mM氟化磺酰苯甲烷，10mM N-马来乙酰亚胺，1μg/mL胃蛋白酶酶抑制素的蒸馏水制备匀浆，3000pm，5min离心，反复3次。用上述溶液洗涤24h，冷冻干燥。溶解干燥组织于0.5M HAC含有0.5mg/mL胃蛋白酶溶液中，4℃搅拌36h；100 000×g超速离心1h收集上清；上清于37℃保温10h，10000×g离心；上清对1.5M Nacl/0.5M HAC透析，100 000×g超速离心取上清，沉淀溶于1.0M NaCl/0.05M Tris-HCl缓冲液中100 000×g超离1h，上清加NaCl至4.5M，100 000×g超离1h，沉淀溶解于0.1M HAC 100 000离心1h，沉淀溶解于0.1 M NaCl/0.05M Tris-Hcl缓冲液中，pH 7.4并透析100 000×g超离1h，收集上清。此上清为含有Col Ⅳ粗品。
DEAE-sepharose层析柱：取DEAE-sepharose 30mL，填装于20×1.5层析柱内，预先使用5mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）200mL平衡柱；将Col Ⅳ粗品经超滤浓缩至浓度为0.5mg/mL，取20mL应用于DEAE-sepharose柱，上样速度为1mL/min，用Tris-HCl缓冲液洗柱，收集流出峰（1mL/管）。230mn监测吸收峰回复基线。用含0.1M Nacl上述缓冲液洗脱，收集洗脱峰（1mL/管）。分别超滤浓缩收集的液体至浓度为0.5mg/mL。
SDS-PAGE：分离胶8%（W/V），浓缩胶1%（w/v），样品缓冲液（0.5mol/L Tris，3% SDS，10%甘油，0.01溴酚蓝，pH6.8）。分别取流出峰和洗脱峰各20μL，加等量样品缓冲液混匀，取20μL上样，250V恒压，电泳2h，考马斯亮蓝（250）染色。
2 结果
2.1 DEAE-sepharose柱层析
Ⅳ型胶原蛋白粗品，应用于离子交换柱，流出峰1和洗脱峰2（见图1），流出峰较大，洗脱峰小，两峰面积之比为1∶2 = 2.8∶1.6。
2.2 SDS-PAGE
峰1和峰2经SDS-PAGE电泳后，峰1主要条带为120KD、90KD、30KD和低于20KD杂带；峰2，主要2条带80KD和40KD，少量低于40KD条带。见图2。
3 讨论
胶原蛋白是由3条肽链（αl、α2、α3）呈螺旋形缠绕而成的绳索状分子，人Ⅳ型胶原蛋白αl、α2链基因均定位于21q22.3位点，长度都为36kb，均由30个外显子组成[5]。Ⅳ型胶原蛋白主要存在于组织器官相应结构的基底膜中，总体含量较低，故而在Ⅳ型胶原蛋白的提取，及其抗体制备方面有着一定的困难。
本研究选用人胎盘为提取原料，首先使用4种不同的蛋白酶抑制剂混合反复清洗，其目的在于去除组织中的血清成份，同时减少蛋白酶对胶原蛋白的分解作用[6]。
而后，采用胶原蛋白溶液在中性条件下置于37℃下保温4～16h的凝胶化方法。通过该方法可使Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原发生凝胶化，而Ⅳ、Ⅴ型胶原仍可呈溶解状态[7]。我们经过反复摸索，采用保温10h后，经离心分离取上清，获得含有Ⅳ、Ⅴ型胶原溶液。在这种分离过程中虽可能有部分Ⅳ、Ⅴ型胶原同时出现凝集，而使得目的胶原部分丢失，但却可预先去除Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原，为进一步采用盐抽提方法分离Ⅳ型胶原提供了方便，进而可获取纯度更高的Ⅳ型胶原。 离子交换层析方法可以进一步去除其他杂型胶原蛋白及非胶原成分，较好地提高胶原的纯度[8]。本研究采用DEAE-Sephrose离子交换层析，进一步纯化了样品，层析图中见单一洗脱峰，与永井裕等的报道一致。
SDS-PAGE广泛应用于蛋白提纯后成分的鉴定[9-11]。研究显示，Ⅳ型胶原由分子量至少为40KD的两种胶原链组成[12]。我们采用胃蛋白酶消化，使Ⅳ型胶原部分交联链断裂。SDS-PAGE结果可见40KD，80KD两条蛋白带，这与王荣春等[12]报道的结果相同。
综上所述，采用上述方法可获得纯度较高的Ⅳ型胶原，从而为制备Ⅳ型胶原蛋白抗体提供了抗原，也为临床抗体检测方法的广泛应用提供了借鉴。
[参考文献]
[1] 单长民，孙业盈，杨军厚，等.胶原蛋白及其相关疾病[J].生物学教学，2013，38（4）：4-5.
[2] 黄书明，张建忠，包海燕，等.慢性肝病患者血清MMP-13、TIMP-1和相关指标的检测及其临床应用价值分析[J].现代检验医学杂志，2013， 8（1）：34-37.
[3] 朱武，刘玉泉，谢万华，等.多项指标联合检测对乙型肝炎后肝硬化诊断治疗中的观察分析[J].检验医学与临床，2013，10（7）：819-823.
[4] 李知轩，赵玉珍，郝美娜，等.肝硬化患者声强定量与血清纤维化指标的相关性研究[J].中国超声医学杂志，2013，29（3）：242-244.
[5] 沈宜，范维珂.Ⅳ型胶原与肝纤维化[J].重庆医科大学学报，1999，24（3）：323-327.
[6] 永井裕，新本大三郎.胶原蛋白实验方法[M].上海：上海中医学院出版社，1992：39-49.
[7] Jamilan B，Harvinder K.Properties of gelatins from skins lf fish black tilapia and red tilapia[J].Food Chemistry，2002，77（1）：81-84
[8] 杜红丽，马新.鸡软骨Ⅱ型胶原蛋白的提纯与鉴定[J].中外医疗，2011，30（7）：52-53.
[9] 宁志刚，王富友，崔运利，等.可溶性猪软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取与鉴定[J].重庆医学，2011，40（10）：954-958.
[10] 莎丽娜，李振飞，韩天翔.羊软骨Ⅱ型胶原蛋白提取中脱钙、脱脂工艺的改进[J].内蒙古农业大学学报， 2012，33（4）：136-139.
[11] 焦坤，莎丽翊.羊肩胛软骨中Ⅱ型胶原蛋白的提取、鉴定及溶解度分析[J].肉类工业，2012（5）：23-26.
[12] 王荣春，徐德昌.胶原蛋白和Ⅵ型胶原蛋白的结构概述[J].生物信息学，2004，2（4）：30-33.
（收稿日期：2013-07-03）
[关键词] Ⅳ型胶原蛋白；凝胶化；提取；纯化
[中图分类号] TQ464.7 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）19-56-02
Ⅳ型胶原（collagen type Ⅳ，Col Ⅳ）主要存在于各器官的基底膜中，是基底膜的微量成分[1]；是维持组织结构和调节细胞和细胞间相互作用的重要成分。近年来研究表明，许多增生性的疾病其Col Ⅳ含量与病变程度呈正相关；特别是在肝硬化诊断和分型方面，Col Ⅳ含量的检测更为重要[2-4]。目前，国内由于缺乏Col Ⅳ纯品，使其抗体制备受到限制，对其研究和检测技术发展受到影响。
本研究旨在探讨整合几种Col Ⅳ的纯化方法，建立以酶消化、超速离心、离子交换层析等技术联合应用，从人胎盘中分离提纯Col Ⅳ程序的可行性，为其抗体制备提供高品质抗原。
1 材料与方法
1.1 主要仪器
LP型低压层析系统（BIO-RAD）、AKTA prime plus蛋白分析仪（GE）、CP100WX超速离心机（HITACHI）、tff超滤浓缩仪（MILLIPORE）、DYY-8C电泳仪（北京六一仪器厂）。
1.2 主要试剂
胃蛋白酶（1∶80000，生工）、EDTA、胃蛋白酶抑制素、磺酰苯甲烷、N-马来乙酰胺（优级纯，生工）及相关转印试剂等。
1.3 提纯
选取新鲜正常分娩胎盘一个，置于-20℃冰箱内冷冻12h，粉碎机粉碎组织，采用含4mM EDTA，2mM氟化磺酰苯甲烷，10mM N-马来乙酰亚胺，1μg/mL胃蛋白酶酶抑制素的蒸馏水制备匀浆，3000pm，5min离心，反复3次。用上述溶液洗涤24h，冷冻干燥。溶解干燥组织于0.5M HAC含有0.5mg/mL胃蛋白酶溶液中，4℃搅拌36h；100 000×g超速离心1h收集上清；上清于37℃保温10h，10000×g离心；上清对1.5M Nacl/0.5M HAC透析，100 000×g超速离心取上清，沉淀溶于1.0M NaCl/0.05M Tris-HCl缓冲液中100 000×g超离1h，上清加NaCl至4.5M，100 000×g超离1h，沉淀溶解于0.1M HAC 100 000离心1h，沉淀溶解于0.1 M NaCl/0.05M Tris-Hcl缓冲液中，pH 7.4并透析100 000×g超离1h，收集上清。此上清为含有Col Ⅳ粗品。
DEAE-sepharose层析柱：取DEAE-sepharose 30mL，填装于20×1.5层析柱内，预先使用5mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）200mL平衡柱；将Col Ⅳ粗品经超滤浓缩至浓度为0.5mg/mL，取20mL应用于DEAE-sepharose柱，上样速度为1mL/min，用Tris-HCl缓冲液洗柱，收集流出峰（1mL/管）。230mn监测吸收峰回复基线。用含0.1M Nacl上述缓冲液洗脱，收集洗脱峰（1mL/管）。分别超滤浓缩收集的液体至浓度为0.5mg/mL。
SDS-PAGE：分离胶8%（W/V），浓缩胶1%（w/v），样品缓冲液（0.5mol/L Tris，3% SDS，10%甘油，0.01溴酚蓝，pH6.8）。分别取流出峰和洗脱峰各20μL，加等量样品缓冲液混匀，取20μL上样，250V恒压，电泳2h，考马斯亮蓝（250）染色。
2 结果
2.1 DEAE-sepharose柱层析
Ⅳ型胶原蛋白粗品，应用于离子交换柱，流出峰1和洗脱峰2（见图1），流出峰较大，洗脱峰小，两峰面积之比为1∶2 = 2.8∶1.6。
2.2 SDS-PAGE
峰1和峰2经SDS-PAGE电泳后，峰1主要条带为120KD、90KD、30KD和低于20KD杂带；峰2，主要2条带80KD和40KD，少量低于40KD条带。见图2。
3 讨论
胶原蛋白是由3条肽链（αl、α2、α3）呈螺旋形缠绕而成的绳索状分子，人Ⅳ型胶原蛋白αl、α2链基因均定位于21q22.3位点，长度都为36kb，均由30个外显子组成[5]。Ⅳ型胶原蛋白主要存在于组织器官相应结构的基底膜中，总体含量较低，故而在Ⅳ型胶原蛋白的提取，及其抗体制备方面有着一定的困难。
本研究选用人胎盘为提取原料，首先使用4种不同的蛋白酶抑制剂混合反复清洗，其目的在于去除组织中的血清成份，同时减少蛋白酶对胶原蛋白的分解作用[6]。
而后，采用胶原蛋白溶液在中性条件下置于37℃下保温4～16h的凝胶化方法。通过该方法可使Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原发生凝胶化，而Ⅳ、Ⅴ型胶原仍可呈溶解状态[7]。我们经过反复摸索，采用保温10h后，经离心分离取上清，获得含有Ⅳ、Ⅴ型胶原溶液。在这种分离过程中虽可能有部分Ⅳ、Ⅴ型胶原同时出现凝集，而使得目的胶原部分丢失，但却可预先去除Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原，为进一步采用盐抽提方法分离Ⅳ型胶原提供了方便，进而可获取纯度更高的Ⅳ型胶原。 离子交换层析方法可以进一步去除其他杂型胶原蛋白及非胶原成分，较好地提高胶原的纯度[8]。本研究采用DEAE-Sephrose离子交换层析，进一步纯化了样品，层析图中见单一洗脱峰，与永井裕等的报道一致。
SDS-PAGE广泛应用于蛋白提纯后成分的鉴定[9-11]。研究显示，Ⅳ型胶原由分子量至少为40KD的两种胶原链组成[12]。我们采用胃蛋白酶消化，使Ⅳ型胶原部分交联链断裂。SDS-PAGE结果可见40KD，80KD两条蛋白带，这与王荣春等[12]报道的结果相同。
综上所述，采用上述方法可获得纯度较高的Ⅳ型胶原，从而为制备Ⅳ型胶原蛋白抗体提供了抗原，也为临床抗体检测方法的广泛应用提供了借鉴。
[参考文献]
[1] 单长民，孙业盈，杨军厚，等.胶原蛋白及其相关疾病[J].生物学教学，2013，38（4）：4-5.
[2] 黄书明，张建忠，包海燕，等.慢性肝病患者血清MMP-13、TIMP-1和相关指标的检测及其临床应用价值分析[J].现代检验医学杂志，2013， 8（1）：34-37.
[3] 朱武，刘玉泉，谢万华，等.多项指标联合检测对乙型肝炎后肝硬化诊断治疗中的观察分析[J].检验医学与临床，2013，10（7）：819-823.
[4] 李知轩，赵玉珍，郝美娜，等.肝硬化患者声强定量与血清纤维化指标的相关性研究[J].中国超声医学杂志，2013，29（3）：242-244.
[5] 沈宜，范维珂.Ⅳ型胶原与肝纤维化[J].重庆医科大学学报，1999，24（3）：323-327.
[6] 永井裕，新本大三郎.胶原蛋白实验方法[M].上海：上海中医学院出版社，1992：39-49.
[7] Jamilan B，Harvinder K.Properties of gelatins from skins lf fish black tilapia and red tilapia[J].Food Chemistry，2002，77（1）：81-84
[8] 杜红丽，马新.鸡软骨Ⅱ型胶原蛋白的提纯与鉴定[J].中外医疗，2011，30（7）：52-53.
[9] 宁志刚，王富友，崔运利，等.可溶性猪软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取与鉴定[J].重庆医学，2011，40（10）：954-958.
[10] 莎丽娜，李振飞，韩天翔.羊软骨Ⅱ型胶原蛋白提取中脱钙、脱脂工艺的改进[J].内蒙古农业大学学报， 2012，33（4）：136-139.
[11] 焦坤，莎丽翊.羊肩胛软骨中Ⅱ型胶原蛋白的提取、鉴定及溶解度分析[J].肉类工业，2012（5）：23-26.
[12] 王荣春，徐德昌.胶原蛋白和Ⅵ型胶原蛋白的结构概述[J].生物信息学，2004，2（4）：30-33.
（收稿日期：2013-07-03）