目的建立一种快速、灵敏、特异的SYBR GreenⅠ实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(rRT-PCR)方法,以期用于检测柯萨奇病毒A2、A4和A5型。方法根据3种病毒vp1基因保守序列设计特异性引物,建立并优化SYBR GreenⅠrRT-PCR方法。分别构建3种病毒的vp1部分基因的重组质粒作为病毒的体外转录标准品,分别以100~109和102~105倍稀释的标准品、其他6种肠道病毒、两种呼吸道RNA病毒及以临床诊断为手足口病的临床标本为模板,经过优化SYBR GreenⅠrRT-PCR反应条件,建立标准曲线和溶解曲线对其灵敏度、重复性、特异性进行评价,分析其临床应用中的效果。结果成功建立了3种柯萨奇病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量rRT-PCR方法及定量标准曲线,方法的灵敏度为101copies/μl质粒标准品,变异系数均<2%,与柯萨奇病毒A组6、10、16型,肠道病毒EV71型,诺如病毒,轮状病毒,麻疹病毒和乙型流感病毒均无交叉反应。检测84份手足口病临床标本,阳性率分别为36.9%(CVA4)、8.33%(CVA5)和7.14%(CVA2),经测序验证符合率为100%。结论建立的检测柯萨奇病毒A2、A4和A5型的SYBR GreenⅠrRT-PCR方法具有良好的灵敏度、重复性和特异性,可用于手足口病病原体的分型检测。