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摘要： 目的：研究α-硫辛酸（alpha-lipoic acid，ALA）对实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis， EAE）大鼠脊髓组织氧化应激状态的影响。方法：Wistar大鼠36只，按照随机数字表法分为正常对照组（CON组），EAE组、硫辛酸干预组（ALA组），每组各12只。采用kono评分观察各组大鼠的神经功能，采用分光光度法检测EAE大鼠脊髓组织中丙二醛（malondialdehyde， MDA）和还原性谷胱甘肽（glutathione， GSH）的含量，2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯 （2'， 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate， DCFH-DA）探针检测脊髓组织中活性氧自由基（reactive oxygen species， ROS）的变化。结果：与CON组相比，EAE组大鼠神经功能明显下降，大鼠脊髓组织中MDA和ROS的含量明显升高，GSH含量明显下降（P<0.05）;与EAE组相比，α-硫辛酸治疗组大鼠神经功能明显改善，大鼠脊髓组织中MDA和ROS的含量明显下降，GSH含量明显升高（P<0.05）。结论：α-硫辛酸在EAE大鼠中可能通过减轻脊髓组织的氧化应激水平发挥其神经保护作用。
关键词：α-硫辛酸;多发性硬化;氧化应激
近来研究表明，氧化应激在多发性硬化（multiple sclerosis， MS）的发病中有重要的作用，抗氧化剂对MS有治疗作用[1]。α-硫辛酸（alpha-lipoic Acid，ALA）是一种天然强效抗氧化剂，主要的作用机制包括：清除螯合金属离子、自由基、活性氧，再生内源性抗氧化剂等，作为神经保护剂已被应用于神经系统多种疾病的防治。有研究者认为，ALA对氧化应激参与发病的慢性疾病具有治疗潜力[2]。实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠模型是研究人类MS疾病发病机制和筛选治疗药物的理想动物模型[3]。本研究观察ALA对EAE大鼠是否具有神经保护作用，及其对EAE大鼠脊髓组织氧化应激状态的影响。
1 材料和方法
1.1 实验动物 清洁级健康雌性Wistar大鼠30只，7～8周龄，体质量200±20g;清洁级豚鼠3只，雌雄不限，体质量380±30g，购自河北医科大学实验动物中心。
1.2 主要试剂 α-硫辛酸购于美国Sigma公司，佐剂用卡介苗购于北京生物制品研究所，MDA试剂盒、GSH试剂盒和DCFH-DA均由碧云天生物技术有限公司提供。
1.3 动物模型的建立 3只健康豚鼠常规水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，迅速取脊髓全长，并制备豚鼠脊髓匀浆，其比例为脊髓重量与冰盐水体积为1：10。制备好的豚鼠脊髓匀浆与匀浆含6mg/mL卡介苗的等体积的完全福氏佐剂混合，冰上抽打制成完全免疫抗原。分别于大鼠四肢足垫和背部皮下注射制备好的完全免疫抗原（总剂量为0.5mL/只），从而建立EAE大鼠模型。
1.4 实验分组 将Wistar大鼠随机分组，采用随机数字表法，共分为3组，正常对照组（CON组），EAE组和α-硫辛酸治疗组（ALA组），各组均为10只大鼠。ALA组自第一次发病起给予药物（100mg·kg-1·d-1）腹腔注射，连续注射30天。正常对照组和EAE组每日给予0.9%无菌生理盐水腹腔注射，连续注射30天。
1.5 神经功能评分 采用国际通用的Kono评分：1分，动物尾部无力;2分，尾部无力，伴有双前肢或双后肢无力;3分，双前肢或双后肢瘫痪;4分，四肢瘫痪，被动翻身后不能复原;5分濒死状态或死亡。
1.6 ROS检测 在发病第31天取材，大鼠经水合氯醛腹腔注射麻醉后，于冰上迅速分离并留取大鼠的脊髓组织。再用眼科剪将脊髓组织剪成碎块，并制备单细胞悬液。单细胞悬液离心弃上清后，加入DCFH-DA工作液，并于37°C避光孵育30min。利用FACS Aria II流式细胞仪进行检测，每个样本收集1万个细胞。脊髓组织中ROS的含量以DCF的荧光强度来代表。
1.7 MDA及GSH检测 各组动物均在发病第31天取材，大鼠经水合氯醛腹腔注射麻醉后，，冰盘上取脊髓，液氮速冻后-80°C保存，用于检测MDA和GSH含量，实验步骤按照试剂盒说明书进行。
1.8 统计学处理 各项数值均用X±s表示。利用SPSS13.0软件对数据进行统计分析，多组间均数的比较选用单因素方差分析，两组间均数比较选用LSD检验。P<0.05作为差异有统计学意义的标准。
2 结果
2.1大鼠神经功能评分 自免疫开始每天对大鼠的神经功能进行评分，共记录30天。对各组大鼠的平均每日神经功能评分比较。CON组大鼠平均每日神经功能缺损评分为0;EAE组为1.68±0.14，出现明显的神经功能缺损（P<0.05）;ALA组为0.62±0.01， 与EAE组相比，ALA显著改善了EAE大鼠的神经功能（P<0.05）。
2.2 大鼠脊髓组织MDA、GSH和ROS的含量 如表 1所示，与CON组相比，EAE组大鼠脊髓组织中MDA明显升高（P<0.05），ROS水平明显升高（P<0.05），GSH含量明显下降（P<0.05）; 与EAE组相比，ALA组脊髓组织中，MDA显著降低（P<0.05），ROS水平明显下降（P<0.05），GSH含量明显增加（P<0.05）。
表1 α-硫辛酸对脊髓组织中MDA、GSH和ROS的影响
与CON组相比较，P<0.05，#与EAE组相比较，P<0.05 3. 讨论
近年来研究发现氧化应激参与了MS的发展过程。过多的氧自由基对蛋白质、脂质膜、DNA等结构造成损伤，造成细胞功能异常甚至死亡。目前的研究认为，MS中轴索损害的机制与胞浆中线粒体钙超载、ROS的聚集、线粒体功能障碍等导致细胞死亡的因素有关。临床上MS病人脂质和DNA的氧化程度与中枢神经系统损害的程度密切相关。MS中，ROS来源于活化的炎症细胞，ROS生成后，进一步增强了单核细胞的聚集和迁移，形成炎症反应和氧化应激的恶性循环，在脱髓鞘和轴索损伤中有重要作用。抗氧化应激有可能是治疗MS的有效策略[4]。
α-硫辛酸（alpha-lipoic Acid，ALA）是一种强抗氧化剂，兼具脂溶性和水溶性，能够通过血脑屏障而发挥对中枢神经系统的保护作用。目前认为，ALA的神经保护作用机制主要有：螯合金属离子、清除自由基及活性氧和再生内源性抗氧化剂。ALA具有抗氧化应激、保护线粒体、调节神经递质的含量、保护认知功能、保护血脑屏障、抑制中枢神经系统炎症反应等作用。α-硫辛酸作为神经保护剂，在糖尿病多发周围神经病等多种神经系统疾病的治疗中已经广泛应用，对帕金森、阿尔兹海默病、缺血再灌注损伤等疾病也有显著的保护作用[5]。
本研究发现，EAE组大鼠出现明显的神经功能缺损，表明模型建立成功。取脊髓组织进行分子生物学检测发现，EAE大鼠脊髓组织中MDA、ROS含量增高，GSH含量下降，与既往的研究结果一致。α-硫辛酸治疗可明显改善神经功能，降低脂质过氧化物MDA和ROS的含量，升高机体抗氧化物GSH的含量。表明在EAE大鼠模型中，α-硫辛酸具有神经保护、减轻氧化应激的作用。
综上所述，α-硫辛酸有通过减轻EAE大鼠脊髓组织的氧化应激，发挥了对EAE大鼠的神经保护作用。本研究为进一步探讨多发性硬化的发病机制和临床上多发性硬化治疗药物的研发提供了实验依据。
参考文献：
[1]Runia TF， van Pelt-Gravesteijn ED， Hintzen RQ. Recent gains in clinical multiple sclerosis research [J]. CNS Neurol Disord Drug Targets， 2012， 11（5）： 497-505
[2]Gold R， Kieseier BC. Therapy of immune neuropathies with intra
venous immunoglobulins [J]. J Neurol， 2006， 253 Suppl 5： V59-63
[3]李波，刘瑞春， 檀国军，等. 小剂量豚鼠脊髓匀浆诱导Wistar大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎模型的建立 [J]. 脑与神经疾病杂志， 2009， 17（5）： 367-369
[4]Acar A， Ugur Cevik M， Evliyaoglu O， et al. Evaluation of serum oxidant/antioxidant balance in multiple sclerosis [J]. Acta Neurol Belg， 2012， 112（3）： 275-280
[5]Valdecantos MP， Perez-Matute P， Quintero P， et al. Vitamin C， resveratrol and lipoic acid actions on isolated rat liver mitochondria： all antioxidants but different [J]. Redox Rep， 2010， 15（5）： 207-216
关键词：α-硫辛酸;多发性硬化;氧化应激
近来研究表明，氧化应激在多发性硬化（multiple sclerosis， MS）的发病中有重要的作用，抗氧化剂对MS有治疗作用[1]。α-硫辛酸（alpha-lipoic Acid，ALA）是一种天然强效抗氧化剂，主要的作用机制包括：清除螯合金属离子、自由基、活性氧，再生内源性抗氧化剂等，作为神经保护剂已被应用于神经系统多种疾病的防治。有研究者认为，ALA对氧化应激参与发病的慢性疾病具有治疗潜力[2]。实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠模型是研究人类MS疾病发病机制和筛选治疗药物的理想动物模型[3]。本研究观察ALA对EAE大鼠是否具有神经保护作用，及其对EAE大鼠脊髓组织氧化应激状态的影响。
1 材料和方法
1.1 实验动物 清洁级健康雌性Wistar大鼠30只，7～8周龄，体质量200±20g;清洁级豚鼠3只，雌雄不限，体质量380±30g，购自河北医科大学实验动物中心。
1.2 主要试剂 α-硫辛酸购于美国Sigma公司，佐剂用卡介苗购于北京生物制品研究所，MDA试剂盒、GSH试剂盒和DCFH-DA均由碧云天生物技术有限公司提供。
1.3 动物模型的建立 3只健康豚鼠常规水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，迅速取脊髓全长，并制备豚鼠脊髓匀浆，其比例为脊髓重量与冰盐水体积为1：10。制备好的豚鼠脊髓匀浆与匀浆含6mg/mL卡介苗的等体积的完全福氏佐剂混合，冰上抽打制成完全免疫抗原。分别于大鼠四肢足垫和背部皮下注射制备好的完全免疫抗原（总剂量为0.5mL/只），从而建立EAE大鼠模型。
1.4 实验分组 将Wistar大鼠随机分组，采用随机数字表法，共分为3组，正常对照组（CON组），EAE组和α-硫辛酸治疗组（ALA组），各组均为10只大鼠。ALA组自第一次发病起给予药物（100mg·kg-1·d-1）腹腔注射，连续注射30天。正常对照组和EAE组每日给予0.9%无菌生理盐水腹腔注射，连续注射30天。
1.5 神经功能评分 采用国际通用的Kono评分：1分，动物尾部无力;2分，尾部无力，伴有双前肢或双后肢无力;3分，双前肢或双后肢瘫痪;4分，四肢瘫痪，被动翻身后不能复原;5分濒死状态或死亡。
1.6 ROS检测 在发病第31天取材，大鼠经水合氯醛腹腔注射麻醉后，于冰上迅速分离并留取大鼠的脊髓组织。再用眼科剪将脊髓组织剪成碎块，并制备单细胞悬液。单细胞悬液离心弃上清后，加入DCFH-DA工作液，并于37°C避光孵育30min。利用FACS Aria II流式细胞仪进行检测，每个样本收集1万个细胞。脊髓组织中ROS的含量以DCF的荧光强度来代表。
1.7 MDA及GSH检测 各组动物均在发病第31天取材，大鼠经水合氯醛腹腔注射麻醉后，，冰盘上取脊髓，液氮速冻后-80°C保存，用于检测MDA和GSH含量，实验步骤按照试剂盒说明书进行。
1.8 统计学处理 各项数值均用X±s表示。利用SPSS13.0软件对数据进行统计分析，多组间均数的比较选用单因素方差分析，两组间均数比较选用LSD检验。P<0.05作为差异有统计学意义的标准。
2 结果
2.1大鼠神经功能评分 自免疫开始每天对大鼠的神经功能进行评分，共记录30天。对各组大鼠的平均每日神经功能评分比较。CON组大鼠平均每日神经功能缺损评分为0;EAE组为1.68±0.14，出现明显的神经功能缺损（P<0.05）;ALA组为0.62±0.01， 与EAE组相比，ALA显著改善了EAE大鼠的神经功能（P<0.05）。
2.2 大鼠脊髓组织MDA、GSH和ROS的含量 如表 1所示，与CON组相比，EAE组大鼠脊髓组织中MDA明显升高（P<0.05），ROS水平明显升高（P<0.05），GSH含量明显下降（P<0.05）; 与EAE组相比，ALA组脊髓组织中，MDA显著降低（P<0.05），ROS水平明显下降（P<0.05），GSH含量明显增加（P<0.05）。
表1 α-硫辛酸对脊髓组织中MDA、GSH和ROS的影响
与CON组相比较，P<0.05，#与EAE组相比较，P<0.05 3. 讨论
近年来研究发现氧化应激参与了MS的发展过程。过多的氧自由基对蛋白质、脂质膜、DNA等结构造成损伤，造成细胞功能异常甚至死亡。目前的研究认为，MS中轴索损害的机制与胞浆中线粒体钙超载、ROS的聚集、线粒体功能障碍等导致细胞死亡的因素有关。临床上MS病人脂质和DNA的氧化程度与中枢神经系统损害的程度密切相关。MS中，ROS来源于活化的炎症细胞，ROS生成后，进一步增强了单核细胞的聚集和迁移，形成炎症反应和氧化应激的恶性循环，在脱髓鞘和轴索损伤中有重要作用。抗氧化应激有可能是治疗MS的有效策略[4]。
α-硫辛酸（alpha-lipoic Acid，ALA）是一种强抗氧化剂，兼具脂溶性和水溶性，能够通过血脑屏障而发挥对中枢神经系统的保护作用。目前认为，ALA的神经保护作用机制主要有：螯合金属离子、清除自由基及活性氧和再生内源性抗氧化剂。ALA具有抗氧化应激、保护线粒体、调节神经递质的含量、保护认知功能、保护血脑屏障、抑制中枢神经系统炎症反应等作用。α-硫辛酸作为神经保护剂，在糖尿病多发周围神经病等多种神经系统疾病的治疗中已经广泛应用，对帕金森、阿尔兹海默病、缺血再灌注损伤等疾病也有显著的保护作用[5]。
本研究发现，EAE组大鼠出现明显的神经功能缺损，表明模型建立成功。取脊髓组织进行分子生物学检测发现，EAE大鼠脊髓组织中MDA、ROS含量增高，GSH含量下降，与既往的研究结果一致。α-硫辛酸治疗可明显改善神经功能，降低脂质过氧化物MDA和ROS的含量，升高机体抗氧化物GSH的含量。表明在EAE大鼠模型中，α-硫辛酸具有神经保护、减轻氧化应激的作用。
综上所述，α-硫辛酸有通过减轻EAE大鼠脊髓组织的氧化应激，发挥了对EAE大鼠的神经保护作用。本研究为进一步探讨多发性硬化的发病机制和临床上多发性硬化治疗药物的研发提供了实验依据。
参考文献：
[1]Runia TF， van Pelt-Gravesteijn ED， Hintzen RQ. Recent gains in clinical multiple sclerosis research [J]. CNS Neurol Disord Drug Targets， 2012， 11（5）： 497-505
[2]Gold R， Kieseier BC. Therapy of immune neuropathies with intra
venous immunoglobulins [J]. J Neurol， 2006， 253 Suppl 5： V59-63
[3]李波，刘瑞春， 檀国军，等. 小剂量豚鼠脊髓匀浆诱导Wistar大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎模型的建立 [J]. 脑与神经疾病杂志， 2009， 17（5）： 367-369
[4]Acar A， Ugur Cevik M， Evliyaoglu O， et al. Evaluation of serum oxidant/antioxidant balance in multiple sclerosis [J]. Acta Neurol Belg， 2012， 112（3）： 275-280
[5]Valdecantos MP， Perez-Matute P， Quintero P， et al. Vitamin C， resveratrol and lipoic acid actions on isolated rat liver mitochondria： all antioxidants but different [J]. Redox Rep， 2010， 15（5）： 207-216