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一、前言
2013年初春时节，我学生几个要好的小伙伴相约来到乡下大伯家游玩，大伯家的油菜园一直是他们童年记忆中的乐园。可是这次回去，他们却发现油菜田比往年少了许多生机，仿佛遭受了秋霜的摧残：油菜苗都长的矮矮的，叶子耷拉着没那么舒展，連花儿都开得稀稀拉拉的，而大伯的眉头也布满了愁云。大伯告诉他们，不知为何，近几年田里的油菜长得越来越差，产量也逐年降低；更加让人不解的是，都是同样的种子，同村相隔不远的地里，别人家的油菜却长得正旺呢！到底是什么原因导致了这些现象呢？我学生几个小伙伴们决定查清真相，并帮助大伯解决这一难题。我们在村里的田间仔细观察，发现这一现象并非个案。整个村子里，有大概七、八块油菜田长势明显较差，而相隔不远的其他田块里油菜却生长的很正常。随后，通过对村里的村民进行走访调查，他们发现了一个规律：长势较差的油菜田都是采用了水稻-油菜轮作种植。经过进一步深入询问，他们终于找到了一个疑点：在水稻种植期间，为了防除水田杂草，村民们统一喷洒了一种叫“草克星”的除草剂农药，那会不会是残留在地里的除草剂对油菜苗造成毒害并最终影响其生长呢？
为了弄清真相，他们从几块不同的田地里取了土样带回城里送到环境监测部门进行检测，检测结果表明在油菜生长受到抑制的轮作田里的确存在吡嘧磺隆（“草克星”的化学名称）含量超标的问题。这基本印证了最初的猜想。通过查阅资料，他们进一步了解到“草克星”，即吡嘧磺隆是一种磺酰脲类除草剂，化学成分为5-（4，6-二甲氧基嘧啶基-2-氨基甲酰氨基磺-1-甲基吡唑-4-羧酸（乙酯），可防除莎草、鸭舌草、水芹等多种农田杂草，同时对水稻安全性好，在我国许多地区尤其南方地区有广泛使用。吡嘧磺隆是人工合成的化合物，在自然环境中较难分解，对包括油菜在内的多种敏感作物产生毒害作用，同时它在较低浓度条件下即对鱼、虾类有致死、致畸、抑制发育等不良影响。看来大伯家油菜田里的“元凶”就是“草克星”吡嘧磺隆这种除草剂！原因是找到了，可究竟用什么方法能够解决吡嘧磺隆的毒害问题呢？我们又集体陷入了深深的困惑之中。
经过深入思考与广泛讨论，联系高中生物课本中“共同进化理论”——不同物种间、生物与环境之间在相互影响中不断进化和发展，以及美国科学家从黄石国家公园热泉中发现耐热细菌Taq并从中分离Taq DNA聚合酶的事迹，我们进一步想到微生物是自然界中生长、进化速度最快的类群，在吡嘧磺隆高浓度环境下（如农药厂排污口处），是否会有个别微生物进化出解毒能力呢？如果能够筛选到这种解毒微生物，将会对解决吡嘧磺隆的药害残留有极大帮助。但这是否有实际可操作性呢？
带着这一想法，我们找到科技辅导教师彭老师。彭老师对我们能够善于发现问题、主动联想思考给予了赞赏，同时他告诉我们特定微生物的筛选、分离具有实际可操作性，目前采用较为普遍的方法是富集培养法。最后，彭老师鼓励、支持我对这一课题进行深入的探索研究。
二、材料与方法
1.耐吡嘧磺隆胁迫微生物富集培养
（1）实验材料土样：取自湖南海特农药厂（该厂主要生产磺酰脲类除草剂）吡嘧磺隆生产车间废液底泥、污水处理池及排污口污泥，作为后续富集培养的样品来源。主要实验仪器：高压灭菌锅280S-A、恒温摇床、智能恒温培养箱、超净工作台等。（2）实验方法：通过多次富集培养得到一个能有效厌氧降解丁草胺的硫酸盐还原细菌（SRB）富集物，参照其主要方法配制富集培养基，采用摇瓶富集培养：取10.0 g采集的土样，加入50 mL富集培养液中，培养液吡嘧磺隆初始浓度设定为50 mg/L，置于28℃、180 r/min恒温摇床上培养7 d之后，以2 %的接种量接入新鲜培养液中，每隔一周转接一次，并以10 mg/L为梯度逐渐提高吡嘧磺隆浓度至100 mg/L，连续培养六轮，空白对照组同样连续培养六轮。
2.吡嘧磺隆解毒微生物检验
农药等有机物解毒率的测定可通过高效液相色谱（HPLC）检测处理前后的含量变化而计算得出，计算公式通常为：R=（C0-C）/C0×100%其中R为解毒菌对吡嘧磺隆的解毒率，C0为未接菌对照基础培养液中吡嘧磺隆的初始浓度，C为接菌处理基础培养液中吡嘧磺隆的浓度。
（1）实验材料：主要仪器：高压灭菌锅280S-A、恒温摇床、智能恒温培养箱、超净工作台、高效液相色谱仪LC-20AT等。实验药品：97%吡嘧磺隆原药，安徽丰乐农化有限公司；分析纯二甲基亚砜，国药集团；色谱纯甲醇，TEDIA；色谱纯二氯甲烷，TEDIA等药品。（2）实验方法：农药等有机物的浓度可通过色谱或质谱技术来测定。钟亚兰等（2010）研究了高聚物液相色谱的分离模式，本实验参照他们运用高效液相色谱表征高聚物的方法对吡嘧磺隆的量的变化进行测定，检验耐高浓度吡嘧磺隆胁迫微生物中可对其产生解毒微的生物是否存在。在富集培养最后一次转接前及经历7d培养后，各取培养物1.5 mL，用高速离心机以12000 r/min离心5 min，上清液经0.22 ?M水相滤膜过滤，取滤液检测。
3.解毒菌的分离与纯化
（1）实验材料：主要仪器：高压灭菌锅280S-A、恒温摇床、智能恒温培养箱、超净工作台、移液器等。实验药品：97%吡嘧磺隆原药、分析纯二甲基亚砜、色谱纯甲醇等药品。（2）实验方法：参照已有方法，采用十倍稀释法将富集液稀释，再用平板倾注法分离单菌，具体操作如下：取8根洁净试管分别加入9 mL ddH2O，121℃灭菌30 min，冷却至常温；第一根试管中加入1 mL富集液，充分混匀，此为富集液稀释10倍后的浓度，记为10-1；取该试管溶液1 mL转入第二支试管中，充分混匀，此为富集液10-2浓度；依此类推，又分别得到10-3～10-8浓度的富集液；对每一梯度浓度稀释液各取100 ?L加入到2个灭菌的培养皿中，其中一个培养皿倒入0.5cm厚的牛肉膏蛋白胨培养基，另一培养皿倒入0.5cm厚的PSA培养基，在超净台的台面上水平混匀稀释液和培养基，冷却凝固后，置于28℃恒温培养箱中倒置培养，牛肉膏蛋白胨平板培养3 d观察菌落，PSA平板培养5 d观察菌落。将单菌落挑出，在相应平板上用四线法划线纯化菌株。
4.单菌解毒试验
为了进一步确定分离纯化得到的不同菌落中，究竟是哪一种或几种微生物对吡嘧磺隆有分解解毒作用，实验设置了单菌解毒试验进行验证。
2013年初春时节，我学生几个要好的小伙伴相约来到乡下大伯家游玩，大伯家的油菜园一直是他们童年记忆中的乐园。可是这次回去，他们却发现油菜田比往年少了许多生机，仿佛遭受了秋霜的摧残：油菜苗都长的矮矮的，叶子耷拉着没那么舒展，連花儿都开得稀稀拉拉的，而大伯的眉头也布满了愁云。大伯告诉他们，不知为何，近几年田里的油菜长得越来越差，产量也逐年降低；更加让人不解的是，都是同样的种子，同村相隔不远的地里，别人家的油菜却长得正旺呢！到底是什么原因导致了这些现象呢？我学生几个小伙伴们决定查清真相，并帮助大伯解决这一难题。我们在村里的田间仔细观察，发现这一现象并非个案。整个村子里，有大概七、八块油菜田长势明显较差，而相隔不远的其他田块里油菜却生长的很正常。随后，通过对村里的村民进行走访调查，他们发现了一个规律：长势较差的油菜田都是采用了水稻-油菜轮作种植。经过进一步深入询问，他们终于找到了一个疑点：在水稻种植期间，为了防除水田杂草，村民们统一喷洒了一种叫“草克星”的除草剂农药，那会不会是残留在地里的除草剂对油菜苗造成毒害并最终影响其生长呢？
为了弄清真相，他们从几块不同的田地里取了土样带回城里送到环境监测部门进行检测，检测结果表明在油菜生长受到抑制的轮作田里的确存在吡嘧磺隆（“草克星”的化学名称）含量超标的问题。这基本印证了最初的猜想。通过查阅资料，他们进一步了解到“草克星”，即吡嘧磺隆是一种磺酰脲类除草剂，化学成分为5-（4，6-二甲氧基嘧啶基-2-氨基甲酰氨基磺-1-甲基吡唑-4-羧酸（乙酯），可防除莎草、鸭舌草、水芹等多种农田杂草，同时对水稻安全性好，在我国许多地区尤其南方地区有广泛使用。吡嘧磺隆是人工合成的化合物，在自然环境中较难分解，对包括油菜在内的多种敏感作物产生毒害作用，同时它在较低浓度条件下即对鱼、虾类有致死、致畸、抑制发育等不良影响。看来大伯家油菜田里的“元凶”就是“草克星”吡嘧磺隆这种除草剂！原因是找到了，可究竟用什么方法能够解决吡嘧磺隆的毒害问题呢？我们又集体陷入了深深的困惑之中。
经过深入思考与广泛讨论，联系高中生物课本中“共同进化理论”——不同物种间、生物与环境之间在相互影响中不断进化和发展，以及美国科学家从黄石国家公园热泉中发现耐热细菌Taq并从中分离Taq DNA聚合酶的事迹，我们进一步想到微生物是自然界中生长、进化速度最快的类群，在吡嘧磺隆高浓度环境下（如农药厂排污口处），是否会有个别微生物进化出解毒能力呢？如果能够筛选到这种解毒微生物，将会对解决吡嘧磺隆的药害残留有极大帮助。但这是否有实际可操作性呢？
带着这一想法，我们找到科技辅导教师彭老师。彭老师对我们能够善于发现问题、主动联想思考给予了赞赏，同时他告诉我们特定微生物的筛选、分离具有实际可操作性，目前采用较为普遍的方法是富集培养法。最后，彭老师鼓励、支持我对这一课题进行深入的探索研究。
二、材料与方法
1.耐吡嘧磺隆胁迫微生物富集培养
（1）实验材料土样：取自湖南海特农药厂（该厂主要生产磺酰脲类除草剂）吡嘧磺隆生产车间废液底泥、污水处理池及排污口污泥，作为后续富集培养的样品来源。主要实验仪器：高压灭菌锅280S-A、恒温摇床、智能恒温培养箱、超净工作台等。（2）实验方法：通过多次富集培养得到一个能有效厌氧降解丁草胺的硫酸盐还原细菌（SRB）富集物，参照其主要方法配制富集培养基，采用摇瓶富集培养：取10.0 g采集的土样，加入50 mL富集培养液中，培养液吡嘧磺隆初始浓度设定为50 mg/L，置于28℃、180 r/min恒温摇床上培养7 d之后，以2 %的接种量接入新鲜培养液中，每隔一周转接一次，并以10 mg/L为梯度逐渐提高吡嘧磺隆浓度至100 mg/L，连续培养六轮，空白对照组同样连续培养六轮。
2.吡嘧磺隆解毒微生物检验
农药等有机物解毒率的测定可通过高效液相色谱（HPLC）检测处理前后的含量变化而计算得出，计算公式通常为：R=（C0-C）/C0×100%其中R为解毒菌对吡嘧磺隆的解毒率，C0为未接菌对照基础培养液中吡嘧磺隆的初始浓度，C为接菌处理基础培养液中吡嘧磺隆的浓度。
（1）实验材料：主要仪器：高压灭菌锅280S-A、恒温摇床、智能恒温培养箱、超净工作台、高效液相色谱仪LC-20AT等。实验药品：97%吡嘧磺隆原药，安徽丰乐农化有限公司；分析纯二甲基亚砜，国药集团；色谱纯甲醇，TEDIA；色谱纯二氯甲烷，TEDIA等药品。（2）实验方法：农药等有机物的浓度可通过色谱或质谱技术来测定。钟亚兰等（2010）研究了高聚物液相色谱的分离模式，本实验参照他们运用高效液相色谱表征高聚物的方法对吡嘧磺隆的量的变化进行测定，检验耐高浓度吡嘧磺隆胁迫微生物中可对其产生解毒微的生物是否存在。在富集培养最后一次转接前及经历7d培养后，各取培养物1.5 mL，用高速离心机以12000 r/min离心5 min，上清液经0.22 ?M水相滤膜过滤，取滤液检测。
3.解毒菌的分离与纯化
（1）实验材料：主要仪器：高压灭菌锅280S-A、恒温摇床、智能恒温培养箱、超净工作台、移液器等。实验药品：97%吡嘧磺隆原药、分析纯二甲基亚砜、色谱纯甲醇等药品。（2）实验方法：参照已有方法，采用十倍稀释法将富集液稀释，再用平板倾注法分离单菌，具体操作如下：取8根洁净试管分别加入9 mL ddH2O，121℃灭菌30 min，冷却至常温；第一根试管中加入1 mL富集液，充分混匀，此为富集液稀释10倍后的浓度，记为10-1；取该试管溶液1 mL转入第二支试管中，充分混匀，此为富集液10-2浓度；依此类推，又分别得到10-3～10-8浓度的富集液；对每一梯度浓度稀释液各取100 ?L加入到2个灭菌的培养皿中，其中一个培养皿倒入0.5cm厚的牛肉膏蛋白胨培养基，另一培养皿倒入0.5cm厚的PSA培养基，在超净台的台面上水平混匀稀释液和培养基，冷却凝固后，置于28℃恒温培养箱中倒置培养，牛肉膏蛋白胨平板培养3 d观察菌落，PSA平板培养5 d观察菌落。将单菌落挑出，在相应平板上用四线法划线纯化菌株。
4.单菌解毒试验
为了进一步确定分离纯化得到的不同菌落中，究竟是哪一种或几种微生物对吡嘧磺隆有分解解毒作用，实验设置了单菌解毒试验进行验证。