【摘 要】
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目的构建抑制人乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因表达的shALDH2-PLKO.1重组慢病毒质粒,并将重组质粒转染HepG2细胞株,为构建ALDH2基因沉默细胞株及研究ALDH2在酒精致HepG2细胞毒性中的
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目的构建抑制人乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因表达的shALDH2-PLKO.1重组慢病毒质粒,并将重组质粒转染HepG2细胞株,为构建ALDH2基因沉默细胞株及研究ALDH2在酒精致HepG2细胞毒性中的作用奠定基础。方法设计3对ALDH2 sh RNA序列并插入到PLKO.1-GFP载体中,通过测序鉴定。将ALDH2 sh RNA和包装质粒共转染293FT细胞,收集24、48和72 h病毒液进行浓缩,通过梯度稀释法测定病毒液滴度。Western blot和qRTPCR检测转染sh RNA的HepG2细胞ALDH2蛋白和mRNA表达量。MTS比色法检测转染sh RNA的HepG2细胞在酒精染毒后的增殖能力。结果测序结果显示shALDH2-PLKO.1质粒构建成功;滴度测定结果显示包装系统成功包装出病毒颗粒,病毒滴度为:4×107TU/ml;Western blot及qRT-PCR结果显示,与对照组比较,转染了shALDH2-1和shALDH2-3的HepG2细胞蛋白和mRNA表达量明显下调,其中shALDH2-1组抑制率为51%(P=0.046),shALDH2-3组抑制率为72%(P=0.008),差异有统计学意义;MTS结果显示转染sh RNA的HepG2细胞株酒精染毒后细胞增殖能力明显下降。结论成功构建了靶向ALDH2基因的重组慢病毒表达质粒,而且shALDH2-PLKO.1可以有效抑制He PG2细胞中ALDH2基因的表达,为研究ALDH2基因在酒精性肝病和肝癌中的作用机制奠定了基础。
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