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为培育转基因抗马铃薯卷叶病毒的新材料，采用二次连接法将存在于克隆载体pLR56中的马铃薯卷叶病毒56KD蛋白基因及3′端非编码区构建对双元载体系统的中间表达载体质粒pROK Ⅱ中，采用三亲融合法和直接导入法转化根瘤农杆菌LBA4404。PCR法检测，实验表明，二次连接法效果优于一次连接法，两种连接法对比，二次连接法更适用于大分子质粒的重组。直接导入法比三亲融合法更简便，二者转化效率没有显著差异。实验构建完成马铃薯卷叶病毒45KD蛋白基因及3′端非编码植物转化载体，建立了高效、简便的植物转化载体的构建方法。