论文部分内容阅读
摘要
异硫氰酸烯丙酯（allyl isothiocyanate，AITC）是十字花科植物的组成型代谢产物之一，关于其天然抗菌杀虫活性，以及在人类医学、农业、食品等领域的应用已有大量研究。本文重点对AITC的制备、农用活性及残留、安全性及作用机制研究等方面进行综述，以期为AITC在农业中的开发应用提供理论参考和技术支撑。
关键词
异硫氰酸烯丙酯; 抗菌活性; 农用活性; 作用机制
中图分类号：
S 436.6
文獻标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2018324
Research progresses on the anti-microbial activity and
application of allyl isothiocyanate in agriculture
LI Yingbin， CAO Yongsong， LUO Laixin， ZHANG Zhiping， LI Jianqiang
（College of Plant Protection， Beijing Key Laboratory of Seed Disease Testing and
Control （BKL-SDTC）， China Agricultural University， Beijing 100193， China）
Abstract
Allyl isothiocyanate， as an important constructive metabolite from cruciferous plants， has a broad biological activity and has been widely studied and applied in the fields of human medicine， agriculture， food science，et al. This review summarized the agricultural bioactivity and application of allyl isothiocyanate， including the preparation of AITC， agricultural activity， residue， safety and mechanism. The purpose of this paper is to provide more theoretical and technical support for the development and application of AITC in agricultural production.
Key words
allyl isothiocyanate; biological activity; agricultural activity; mechanism of AITC
依赖化学农药控制农作物病虫害具有悠久的历史[1]。熏蒸剂作为合成化学农药的一种，在防控土传、仓储、采后病虫害及食品保鲜等领域具有较为广泛的应用。随着人们消费水平及对食品安全的重视程度的提高，研究开发高效、无毒、无残留的病虫害防治措施及食品保鲜手段备受关注和重视。1937年Walker等报道十字花科芸薹属植物，如芥菜、甘蓝中的硫代葡萄糖苷（glucosinolates，简称GSLs）的降解产物异硫氰酸酯类化合物（isothiocyanates，简称ITCs）具有天然抗菌活性[2]和广谱灭生性[3]，其中异硫氰酸烯丙酯（allyl isothiocyanate，AITC）作为主要降解产物，对多数植物病原真菌[4]、细菌[5]、线虫及昆虫[6]具有活性。同时，对一些人类致病菌，如大肠杆菌Escherichia coli、鼠伤寒沙门氏杆菌Salmonella typhimurium、绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa、副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus、幽门螺旋杆菌Helicobacter pylori、念珠菌属Candida sp.等同样具有生物活性[7]。除此之外，AITC在抗癌、心肌保护及神经保护等方面的效果和作用也受到关注[8-9]。
1 异硫氰酸烯丙酯及其制备工艺
1.1 异硫氰酸烯丙酯概述
异硫氰酸烯丙酯（AITC，俗称为辣根素）是一类广泛存在于辣根、芥菜和山葵等十字花科蔬菜中的天然含硫次生代谢物，是ITCs类物质的主要种类;其在人类医学、食品和农业领域具有重要的应用价值，基于ITCs类物质所申请的部分专利及农药登记报道见表1。
表1 国际上关于ITCs类物质在相关领域申请专利及登记情况
Table 1 Application and registration of ITCs in the world
辣根素的前体为存在于植物液泡中的GSLs物质，一旦将植物组织破碎，GSLs便在黑芥子酶的催化作用下水解[10]。不同十字花科植物GSLs水解产物不同。Jiang等采用GC-MS方法，共检测出我国辣根中含有的9种挥发性ITCs物质，名称及含量分别为异硫氰酸异丙酯（isopropyl isothiocyanate，isopropyl ITC，含量0.1%）、异硫氰酸烯丙酯（AITC，含量78.4%）、异硫氰酸丁酯（butyl isothiocyanate，butyl ITC，含量0.1%）、3-丁烯基异硫氰酸酯（3-butenyl isothiocyanate，3-butenyl ITC，含量1.5%）、2-异硫氰酸戊酯（2-pentyl isothiocyanate，2-pentyl ITC，含量2.1%）、异硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate，phenyl ITC，含量0.1%）、3-（甲基硫代）丙基硫代异氰酸酯（3-methylthiopropyl isothiocyanate，3-methyl ITC，含量0.3%）、异硫氰酸苄酯（benzyl isothiocyanate，benzyl ITC，含量0.1%）、β-异硫氰酸苯乙酯（β-phenylethyl isothiocyanate，β-phenylethyl ITC，含量9.4%）。其中，AITC为我国辣根含有的ITCs类物质的主要成分，其含量高于英格兰辣根、匈牙利辣根和日本辣根（44.3%～55.7%）[11-12]。 1.2 AITC的制备
AITC的化学结构式为CH2=CHCH2N=C=S，分子量99.16，沸点为152℃，凝固点-80℃，密度为1.012 6 g/mL。常温下为淡黄色透明油状液体，具有强烈的挥发性，其制备主要有以下两种途径。
1.2.1 从十字花科植物中提取
一些蔬菜如甘蓝中AITC的浓度大概在800～1 000 mg/kg[24]，芥菜种子中含有的AITC浓度最高，约为2 500～5 000 mg/kg。从辣根等十字花科植物中提取AITC的经典方法是水蒸气蒸馏法和超临界CO2流体萃取法。以辣根为例，Wu等[25]比较了水解时间、温度、pH和添加剂抗氧化剂对于AITC前体的水解效果，最终发现采用20 mg/g抗氧化剂叔丁基对苯二酚65℃水解120 min（pH=4）时AITC前体物质水解程度最佳，以二氯甲烷作为萃取溶剂最优，采用超临界CO2液体萃取法产生的AITC产量为6.10%，高于水蒸气蒸馏产率（5.83%）。郑建秋等[26]将粉碎后的芥菜籽加入反应釜容器中，采用50℃、pH为4.0～6.5的酸性水浸泡2 h，催化芥菜籽中的GSLs为异硫氰酸烯丙酯，采用亚临界水萃取技术（2Mpa、120℃）对反应釜中的物质进行萃取，然后分离反应釜中的物质，即得到含异硫氰酸烯丙酯的辣根素粗产物，产物中AITC含量为66.5%，产油率为2.3%。该制备过程不仅绿色安全，且易于操作，反应历程短，萃取率高。
1.2.2 仿生化学合成路径
从十字花科植物中提取辣根素操作复杂，能耗过高，提取效率低，难以规模生产，因此AITC的化学合成备受关注[27]。目前AITC主要通过仿生合成进行制备，其中具有工业化前景的合成途径是以烯丙基卤与硫氰酸盐作为原料，通过液固非均相反应及将溶剂改为乙醇后的均相反应。国外团队如美国、俄罗斯（RUSS2321581）、日本（JP181053）、印度等均有关于AITC的合成工艺[28]。国内王向辉等[29]选用l， 3-二溴丙烷、邻苯二甲酰亚胺钾、硫脲、二硫化碳及取代溴苄为原料，经5步反应合成了8个未见报道的辣根素类化合物。刘学勇等[27]综述了国内外主要的合成工艺，认为李健强、曹永松团队等采用烯丙基胺、二硫化碳和双氧水为主要原料的制备工艺简单，产品收率达90%，含量达到97%，具有较大的产业化生产价值[30]。
2 AITC的农用活性
已报道，AITC具有广谱高效的杀菌、杀线虫、杀虫作用活性（见表2）。同时因其来源于植物且具有很高的安全性，美国环境保护署（US EPA）也许可将其登记为风险较低的生物农药之一[31]。
表2 已报道的AITC具有活性的部分靶标生物
Table 2 Reported target organisms of AITC
2.1 对土传植物病原生物的活性
早期人们发现，芥菜籽、山葵、辣根等植物具有杀菌活性。Angus等发现将甘蓝和芥菜等植物的碎粉深埋至土壤中，可以抑制小麦全蚀病菌Gaeumannomyces graminis var. tritici的生长，并首次将这种方法称为“生物熏蒸”[32]。由于连作或伴随灌溉，土壤中的腐霉Pythium与疫霉Phytophthora等不断在田间土壤环境中累积[33]，对此Weerakoon等[34]以芥菜种子糠（seed meal）改良土壤，建立了一种以“生物介导”的能够长期抑制病原菌积累的策略，有效地控制了苹果园内树苗根腐病的发生[35]。研究揭示其中具有抑菌作用的成分是包括AITC在内的多种ITCs类物质。Mark等[36]研究表明，芥菜中的AITC在24～48 h内即可完全释放到土壤中。
作者团队的黄小威[37]、王彦柠等[38]研究表明，在熏蒸条件下AITC对供试的禾谷镰刀菌Fusarium graminearum、立枯丝核菌Rhizoctonia solani等10余种植物病原真菌及瓜果腐霉Pythium aphanidermatum、辣椒疫霉Phytophthora capsici等卵菌的菌丝生长具有显著的抑制作用，其EC50分布在0.94～24.64 μg/mL之间;对其中12种病原真菌的孢子萌发亦具有显著抑制作用，EC50分布在0.26～0.69 μg/mL之间;试验证实，AITC能够导致供试土传病原真菌及卵菌菌落扩展速度减慢，气生菌丝稀薄、孢子萌发率降低，病原细菌菌落数量减少、生长速度减缓，对常见的植物病原菌呈现出广谱、高效的抑菌活性，为辣根素熏蒸防控田间主要土传病害提供了理论支持。
由大丽轮枝菌Verticillium dahliae引起的棉花黄萎病是一种重要的土传植物维管束病害，严重影响棉花产量[39]。作者团队的李慧[40]前期研究表明，20%辣根素水乳剂1 500倍稀释液不仅对棉花黄萎病菌菌丝生长具有显著的抑制作用，同时对棉花种子出苗和幼苗生长具有安全性。刘政等[39]采用滴灌与覆膜施药的方式，连续两年对20%辣根素水乳剂防控棉花黄萎病的田间效果进行研究，提出了该药剂防控棉花黄萎病的使用技术规程，且在合作试验地区合计辐射应用面积达到1.4万hm2。
2.2 对果蔬地上部病虫害靶标生物的活性
王彦柠等[38]研究表明，AITC对番茄溃疡病菌Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis、十字花科黑腐病菌Xanthomonas campestris pv. campestris等5种植物病原细菌的生长具有显著抑制作用，EC50分布在0.81～8.61 μg/mL之间。
北京市近几年来大力推广使用AITC，建立了以蔬菜无病虫育苗、产前消毒预防、产中综合防控和产后残体无害处理有机结合的“全程绿色防控”技术体系。目前，北京市蔬菜病虫全程绿色防控示范基地数量达到20 个，覆盖了全市10 个区（县），有效减少了病虫危害程度和化学农药用量[41]。示范试验证实，20% 辣根素水乳剂对烟粉虱有很好的速效性，药后3 d防效达到70.9%，且成本低廉，操作简便[42];采用滴灌施药方法，发现其对土壤真菌中的镰刀菌杀灭效果达到100%，对腐霉、曲霉、青霉等杀灭效果显著;设施草莓土壤经過辣根素消毒处理整个生长期内的植株成活率明显提高[43]。天津市津南区植保部门通过滴灌系统把辣根素注入土地后覆盖上一层密闭的厚膜，熏蒸处理3 d即可有效杀灭多种病虫，按照操作规程定植蔬菜，一季不用再除草、除虫，还能保证蔬菜的品质[44]。王晓青等在生菜定植前7 d采用20%辣根素水乳剂以随水滴灌方式对连续种植3年以上菌核病发生严重的生菜地进行土壤熏蒸处理，定植后7 d使用抗重茬菌剂或使用寡雄腐霉灌根处理，对生菜菌核病防治效果可达到80%左右[45]。 2.3 对作物储藏期病虫害靶标的生物活性
AITC因具有强烈的挥发性以及高效的抗微生物活性，且对多种食源性致病菌具有杀灭活性，研究者认为可将AITC开发成一种新型的包装策略，如作为“抗菌香囊（anti-microbial sachets）”防控由Aspergillus flavus引起的储藏期花生黄曲霉素的污染[46]。Tracz等采用AITC对储藏期玉米粒密闭熏蒸处理48 h后进行通风处理，检测了玉米粒中AITC的残留量。结果表明，通风24 h后，玉米籽粒中可检测到44.5%的AITC，继续密封保存30 d后籽粒中仍有15.5%的AITC被检测出，说明在储藏过程中，玉米粒可以作为AITC的吸收维持载体，通过缓释的方式逐渐散发到空气中，对储藏期玉米由5种真菌产生的12种毒素都具有显著的抑制效果[47]。Nazareth等研究表明，AITC可降低储藏期面粉中由寄生曲霉Aspergillus parasiticus产生的黄曲霉毒素（aflatoxin）及早熟禾镰刀菌Fusarium poae产生的白僵菌素（beauvericin）和恩镰孢菌素（enniatin）的积累[48]。除此之外，也有学者采用AITC对莴苣、苹果、番茄、草莓、黑莓、悬钩子等蔬果储藏期病害进行防控研究[49-51]。在杀虫方面，AITC也具有安全高效性且与磷化氢等无交互抗药性[52]，可作为一种针对储藏期害虫防控的有效策略。
2.4 对杂草的生物活性
Ren等[53]采用AITC进行番茄地土壤熏蒸处理，发现其不但可以有效杀灭土壤环境中的病原真菌、细菌及线虫等，同时对土壤中的杂草（LC50=17.3～47.7 mg/kg）也具有很好的杀灭活性。Matteo等也发现，十字花科作物粗提取物对大穗看麦娘Alopecurus myosuroides具有优异的生物活性[54]。Bangarwa等研究发现[55]，AITC作为除草剂控制苋科植物、马唐的效果与甲基溴相当。2018年申请的美国专利（US201801225077A1）中也表明，ITCs类特别适用于对杂草的抑制。
3 AITC残留和安全性
3.1 AITC残留分析方法
Tracz等[47]研究AITC防控储藏期由Aspergillus parasiticus，Fusarium tricinctum，F.verticillioides以及Alternaria alternata引起的玉米毒素产生水平时，优化了AITC在玉米粒中的残留分析条件，包括1）样品制备：将一定质量的玉米粒浸泡在甲醇中，40℃水浴中振荡30 min后再超声处理10 min，20℃ 4 000 r/min离心5 min后收集上清液，过0.22 μm滤膜;2）检测方法及条件：采用HPLC的方法，检测器为安捷伦二极管阵列检测器（LC-DAD），检测波长为236 nm，分离柱为Gemini C18（4.6 mm×150 mm，孔径3 μm），流动相为水∶乙腈（V∶V=60∶40），流速為0.8 mL/min。
吴华等[56]建立了20%AITC在几种仓库贮藏品中的毛细管气相色谱残留分析方法。该方法以二氯甲烷为提取溶剂，采用毛细管气相色谱-火焰离子化检测仪进行测定（与国标GB29980-2013中规定的检测器一致），发现辣根素在贮藏品中的消解动态符合一级动力学方程，其半衰期为28～75 d，其降解过程主要是酶解、水解、光解。Ugolini等[57]采用固相微萃取技术，以气相色谱火焰离子化检测器进行测定AITC在草莓果实中的残留。
3.2 AITC安全性评价
3.2.1 对人体的安全性
1999年AITC免除了注册化学品的注册授权和限制，并且在日本作为一种商品化的天然抗菌剂或防腐剂添加到食品中[58];2006年美国规定AITC可作为一种“公认安全食品”添加到食品储藏罐中，用来延长食品保质期和抗腐败;2011年美国食品药品监督管理局规定AITC可作为一种食品添加剂直接加入食品中使用，而且被认为有利于人体健康[1，46];欧洲国家也明确了AITC作为食品防腐剂和食品添加剂具有安全性[59]。
Otoni等采用AITC防控由Aspergillus flavus引起的储藏期花生黄曲霉素的污染，在前15 d约92.4%的AITC已经降解，30 d后无AITC可检出[46]。Ugolini采用0.1 mg/L AITC处理草莓果实4 h后，可使灰霉病发生降低47.4%～91.5%，且对果实的营养品质等无影响，储藏7 d后AITC残留量低于1 mg/kg[57]。Santos等采用300 μL/kg的AITC对储藏期密封保存的玉米粒真菌毒素的产生进行防控，结果表明，储藏150 d后，AITC对玉米种子的发芽势、含水量、容重以及电导率等生理指标均无影响[60]。Wu等[25]采用AITC处理稻米，其残留量低于5 μg/g。欧盟委员会规定，AITC日摄取量（tolerable daily intake， TDI）最高为每千克体重0.06 mg[61]。研究表明，一定时间后AITC残留基本检测不到或含量极低，表明采用AITC进行食品保鲜或病害防控，不太可能导致储藏产品中的残留问题，也不太可能会对人类健康产生威胁。美国国家环境保护局（United States Environmental Protection Agency）官方数据表明，AITC安全性高，对婴幼儿等也无不良反应（https：∥www.epa.gov/）。
3.2.2 对非靶标生物的安全性
Zaborski等采用100 mg/L的AITC作驱避剂收集土壤中的蚯蚓，其收集效果与200 mg/L的福尔马林相比无显著差异，且对蚯蚓具有更小的毒性，因此认为将AITC引入土壤环境中是安全的[62]。Borek等[63]测定了AITC在6种不同土壤中的半衰期，为20～60 h，且随着土壤水分的降低和温度的升高，AITC降解速度加快。Isagro美国公司联合美国多所大学的研究人员针对以AITC为原料登记的土壤熏蒸剂“DOMINUS”进行了严格的测试，说明其在土壤中能快速降解，在作物种植前施用，土壤中不会残留，是一款环境友好型的产品[64]。Wu等认为AITC对非靶标生物具有极低的毒性，因此也易被农户接受[65]。 研究报道[36，66]表明，土壤中的有益微生物如Trichoderma spp.等对AITC不敏感，展现出很强的忍耐性。Weerakoon等也发现AITC处理过的土壤环境中，T.hamatum和T.virens仍然是主要群体[34]。美国EPA官方数据表明AITC对环境友好，对非靶标生物（除部分昆虫如蜜蜂外）无毒性作用[67]。
4 AITC的农药登记与产业化应用
4.1 AITC剂型研发
由于AITC分子量很小，化学性质活泼，常温下具有很强的挥发性和刺激性，给使用带来了不便。彭家华采用分子包结络合法，制备了AITC微胶囊剂。该微胶囊剂有一定的缓释作用且利用率可提高到80%左右[68]。中国农业大学李健强团队选用高吸附性惰性材料等载体和助剂制备了多种用途的AITC剂型：包括水乳剂，颗粒剂，缓释型颗粒剂，缓释型纸片、塑料、块、袋等。
4.2 AITC施药器械及方式
辣根素是新型植物源药剂，作为土壤处理剂可有效杀灭多种土壤微生物，防控多种土传病害。施药时可根据土传病害发生严重程度选择随水滴灌施用或在播种前或移栽前采用起垄覆膜密封后，进行土壤熏蒸。
常用施药器械有烟雾施药机、远程机动喷雾器等高效施药器。目前，由北京市果类蔬菜创新团队病虫防控研究室联合设施设备研究室研发的辣根素土壤消毒专用施药机械已面世，该设备基本具备液态药剂土壤注射施用功能，机具采用履带式行走，稳定性高;可根据行走速度精准设定施药量;可根据消毒需要调节施药深度;采用多重防堵防漏措施，具有很高的施药安全性（http：∥www.bjny.gov.cn/）。当然，由于AITC具有强烈的刺激性，进行消毒时，操作人员应该进行自身防护，如佩戴护目镜、防毒面具等。
4.3 AITC的农药登记
以AITC为原料进行的农药登记，最早是美国约旦农业公司2000年登记的“Dazitol”。它是一种由辣椒素及相关物质（有效含量为0.42%）和异硫氰酸烯丙酯（有效含量为3.7%）组成的混合物，用于土壤处理可有效杀灭或抑制土壤中的线虫、有害昆虫、病原菌及杂草[69]。目前Dazitol正式登记的国家或地区有智利、约旦、阿联酋、科威特、美国、希腊、土耳其、摩洛哥、黎巴嫩、以色列、墨西哥、哥伦比亚、巴西、阿根廷、泰国、秘鲁、埃及、西班牙、伊拉克等（http：∥www.ynlagensu.com/userlist/lclmsw/text-9449.html）。除此之外，Isagro美国公司2014年登记的以AITC为活性成分的“Dominus”产品（https：∥www.isagro.com/prodotti/fumiganti.html）是第一款可同时用于传统及有机耕种的土壤生物熏蒸剂，对土壤中的真菌、线虫、杂草和昆虫具有广谱防治功效，其登记类别为“以天然物质为基础的生物农药”[65]。2017年，Mardel Rose Belotinsky TriCal公司登记了AITC与氯化苦的复配制剂投入市场（http：∥www.trical.com/）。
2018年，以AITC为有效成分的我国自创品牌“70%辣根素原药”（登记证号：PD20181601）和“20%辣根素水乳剂”（登记证号：PD20181600）由云南联创利民生物工程有限公司获得首家农药登记，用于防治番茄根结线虫。
4.4 AITC替代溴甲烷的应用
溴甲烷作为一种熏蒸类杀虫剂由来已久[70]。1932年法国首先使用，1937年后广泛使用于植物检疫熏蒸处理，我国于1953年开始用于熏蒸棉籽，后逐渐用于陆地或船舱中的熏蒸灭虫及仓储期杀虫[71]。根据《蒙特利尔议定书》哥本哈根修正案，发达国家和发展中国家分别于2005年和2015年淘汰使用溴甲烷。为了淘汰溴甲烷，各国科学家都在努力寻找安全、经济、有效的替代品，并取得了一些进展，如磷化氢、威百亩、氯化苦等[56]。但随着用药历史的延长，多个国家出现了包括玉米象、谷蠹、赤拟谷盗、嗜虫书虱等在内的至少11种储藏物害虫表现出对磷化氢，溴甲烷等的抗性[72-75]，因此，寻找新型的安全、高效、可替代溴甲烷和磷化氢的新型化学品迫在眉睫。
曹坳程等[69，78]早在2006年提出AITC是一种安全、环境相容性好的熏蒸剂，是溴甲烷的潜在替代品。近年来，国内越来越多的团队通过大量的田间实践，证明AITC具有广阔的应用前景。
为实现中国政府的履约目标，由环境保护部和农业部共同组织实施了农业行业甲基溴淘汰项目，举办了“2015年农业行业甲基溴淘汰与土壤消毒技术培训班”，由北京市植保站作为执行和技术指导单位，联合中国农业科学院、中国农业大学、山东省农业环境保护和农村能源总站以及多个企业在山东、河北等省市开展辣根素土壤消毒试验，为溴甲烷替代药剂的开发和应用提供试验数据，推动溴甲烷淘汰项目顺利实施[76]。
国内以云南联创利民生物工程有限公司为代表的企业，大力开展以AITC为有效成分的农药制剂开发，在马铃薯病害综合防治、棉花黄萎病、草莓根腐病、蔬菜根结线虫等主要作物种传、土传病虫害，以及大宗蔬菜黄瓜、番茄等蔬菜多种地上部病蟲害治理中取得了良好的防控效果。目前，国内中国农业大学以及云南农业大学等高校也积极采用AITC防控魔芋细菌性软腐病、具有连作障碍的三七根腐病以及食用百合根及鳞茎腐烂病[77]等，取得了阶段性进展。
5 AITC的作用机制
吴华等对AITC在医学领域抗肿瘤、抗癌的活性，以及其对仓储害虫、病原微生物、线虫、杂草等农业有害生物的活性研究进行了综述[79]。本文结合文献报道重点对AITC的作用机制进行评述。
5.1 诱导线虫细胞压力
Saini等用AITC处理秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans，采用RT-qPCR方法研究了AITC对其热激蛋白基因HSP70表达的影响。结果发现，低浓度AITC（
异硫氰酸烯丙酯（allyl isothiocyanate，AITC）是十字花科植物的组成型代谢产物之一，关于其天然抗菌杀虫活性，以及在人类医学、农业、食品等领域的应用已有大量研究。本文重点对AITC的制备、农用活性及残留、安全性及作用机制研究等方面进行综述，以期为AITC在农业中的开发应用提供理论参考和技术支撑。
关键词
异硫氰酸烯丙酯; 抗菌活性; 农用活性; 作用机制
中图分类号：
S 436.6
文獻标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2018324
Research progresses on the anti-microbial activity and
application of allyl isothiocyanate in agriculture
LI Yingbin， CAO Yongsong， LUO Laixin， ZHANG Zhiping， LI Jianqiang
（College of Plant Protection， Beijing Key Laboratory of Seed Disease Testing and
Control （BKL-SDTC）， China Agricultural University， Beijing 100193， China）
Abstract
Allyl isothiocyanate， as an important constructive metabolite from cruciferous plants， has a broad biological activity and has been widely studied and applied in the fields of human medicine， agriculture， food science，et al. This review summarized the agricultural bioactivity and application of allyl isothiocyanate， including the preparation of AITC， agricultural activity， residue， safety and mechanism. The purpose of this paper is to provide more theoretical and technical support for the development and application of AITC in agricultural production.
Key words
allyl isothiocyanate; biological activity; agricultural activity; mechanism of AITC
依赖化学农药控制农作物病虫害具有悠久的历史[1]。熏蒸剂作为合成化学农药的一种，在防控土传、仓储、采后病虫害及食品保鲜等领域具有较为广泛的应用。随着人们消费水平及对食品安全的重视程度的提高，研究开发高效、无毒、无残留的病虫害防治措施及食品保鲜手段备受关注和重视。1937年Walker等报道十字花科芸薹属植物，如芥菜、甘蓝中的硫代葡萄糖苷（glucosinolates，简称GSLs）的降解产物异硫氰酸酯类化合物（isothiocyanates，简称ITCs）具有天然抗菌活性[2]和广谱灭生性[3]，其中异硫氰酸烯丙酯（allyl isothiocyanate，AITC）作为主要降解产物，对多数植物病原真菌[4]、细菌[5]、线虫及昆虫[6]具有活性。同时，对一些人类致病菌，如大肠杆菌Escherichia coli、鼠伤寒沙门氏杆菌Salmonella typhimurium、绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa、副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus、幽门螺旋杆菌Helicobacter pylori、念珠菌属Candida sp.等同样具有生物活性[7]。除此之外，AITC在抗癌、心肌保护及神经保护等方面的效果和作用也受到关注[8-9]。
1 异硫氰酸烯丙酯及其制备工艺
1.1 异硫氰酸烯丙酯概述
异硫氰酸烯丙酯（AITC，俗称为辣根素）是一类广泛存在于辣根、芥菜和山葵等十字花科蔬菜中的天然含硫次生代谢物，是ITCs类物质的主要种类;其在人类医学、食品和农业领域具有重要的应用价值，基于ITCs类物质所申请的部分专利及农药登记报道见表1。
表1 国际上关于ITCs类物质在相关领域申请专利及登记情况
Table 1 Application and registration of ITCs in the world
辣根素的前体为存在于植物液泡中的GSLs物质，一旦将植物组织破碎，GSLs便在黑芥子酶的催化作用下水解[10]。不同十字花科植物GSLs水解产物不同。Jiang等采用GC-MS方法，共检测出我国辣根中含有的9种挥发性ITCs物质，名称及含量分别为异硫氰酸异丙酯（isopropyl isothiocyanate，isopropyl ITC，含量0.1%）、异硫氰酸烯丙酯（AITC，含量78.4%）、异硫氰酸丁酯（butyl isothiocyanate，butyl ITC，含量0.1%）、3-丁烯基异硫氰酸酯（3-butenyl isothiocyanate，3-butenyl ITC，含量1.5%）、2-异硫氰酸戊酯（2-pentyl isothiocyanate，2-pentyl ITC，含量2.1%）、异硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate，phenyl ITC，含量0.1%）、3-（甲基硫代）丙基硫代异氰酸酯（3-methylthiopropyl isothiocyanate，3-methyl ITC，含量0.3%）、异硫氰酸苄酯（benzyl isothiocyanate，benzyl ITC，含量0.1%）、β-异硫氰酸苯乙酯（β-phenylethyl isothiocyanate，β-phenylethyl ITC，含量9.4%）。其中，AITC为我国辣根含有的ITCs类物质的主要成分，其含量高于英格兰辣根、匈牙利辣根和日本辣根（44.3%～55.7%）[11-12]。 1.2 AITC的制备
AITC的化学结构式为CH2=CHCH2N=C=S，分子量99.16，沸点为152℃，凝固点-80℃，密度为1.012 6 g/mL。常温下为淡黄色透明油状液体，具有强烈的挥发性，其制备主要有以下两种途径。
1.2.1 从十字花科植物中提取
一些蔬菜如甘蓝中AITC的浓度大概在800～1 000 mg/kg[24]，芥菜种子中含有的AITC浓度最高，约为2 500～5 000 mg/kg。从辣根等十字花科植物中提取AITC的经典方法是水蒸气蒸馏法和超临界CO2流体萃取法。以辣根为例，Wu等[25]比较了水解时间、温度、pH和添加剂抗氧化剂对于AITC前体的水解效果，最终发现采用20 mg/g抗氧化剂叔丁基对苯二酚65℃水解120 min（pH=4）时AITC前体物质水解程度最佳，以二氯甲烷作为萃取溶剂最优，采用超临界CO2液体萃取法产生的AITC产量为6.10%，高于水蒸气蒸馏产率（5.83%）。郑建秋等[26]将粉碎后的芥菜籽加入反应釜容器中，采用50℃、pH为4.0～6.5的酸性水浸泡2 h，催化芥菜籽中的GSLs为异硫氰酸烯丙酯，采用亚临界水萃取技术（2Mpa、120℃）对反应釜中的物质进行萃取，然后分离反应釜中的物质，即得到含异硫氰酸烯丙酯的辣根素粗产物，产物中AITC含量为66.5%，产油率为2.3%。该制备过程不仅绿色安全，且易于操作，反应历程短，萃取率高。
1.2.2 仿生化学合成路径
从十字花科植物中提取辣根素操作复杂，能耗过高，提取效率低，难以规模生产，因此AITC的化学合成备受关注[27]。目前AITC主要通过仿生合成进行制备，其中具有工业化前景的合成途径是以烯丙基卤与硫氰酸盐作为原料，通过液固非均相反应及将溶剂改为乙醇后的均相反应。国外团队如美国、俄罗斯（RUSS2321581）、日本（JP181053）、印度等均有关于AITC的合成工艺[28]。国内王向辉等[29]选用l， 3-二溴丙烷、邻苯二甲酰亚胺钾、硫脲、二硫化碳及取代溴苄为原料，经5步反应合成了8个未见报道的辣根素类化合物。刘学勇等[27]综述了国内外主要的合成工艺，认为李健强、曹永松团队等采用烯丙基胺、二硫化碳和双氧水为主要原料的制备工艺简单，产品收率达90%，含量达到97%，具有较大的产业化生产价值[30]。
2 AITC的农用活性
已报道，AITC具有广谱高效的杀菌、杀线虫、杀虫作用活性（见表2）。同时因其来源于植物且具有很高的安全性，美国环境保护署（US EPA）也许可将其登记为风险较低的生物农药之一[31]。
表2 已报道的AITC具有活性的部分靶标生物
Table 2 Reported target organisms of AITC
2.1 对土传植物病原生物的活性
早期人们发现，芥菜籽、山葵、辣根等植物具有杀菌活性。Angus等发现将甘蓝和芥菜等植物的碎粉深埋至土壤中，可以抑制小麦全蚀病菌Gaeumannomyces graminis var. tritici的生长，并首次将这种方法称为“生物熏蒸”[32]。由于连作或伴随灌溉，土壤中的腐霉Pythium与疫霉Phytophthora等不断在田间土壤环境中累积[33]，对此Weerakoon等[34]以芥菜种子糠（seed meal）改良土壤，建立了一种以“生物介导”的能够长期抑制病原菌积累的策略，有效地控制了苹果园内树苗根腐病的发生[35]。研究揭示其中具有抑菌作用的成分是包括AITC在内的多种ITCs类物质。Mark等[36]研究表明，芥菜中的AITC在24～48 h内即可完全释放到土壤中。
作者团队的黄小威[37]、王彦柠等[38]研究表明，在熏蒸条件下AITC对供试的禾谷镰刀菌Fusarium graminearum、立枯丝核菌Rhizoctonia solani等10余种植物病原真菌及瓜果腐霉Pythium aphanidermatum、辣椒疫霉Phytophthora capsici等卵菌的菌丝生长具有显著的抑制作用，其EC50分布在0.94～24.64 μg/mL之间;对其中12种病原真菌的孢子萌发亦具有显著抑制作用，EC50分布在0.26～0.69 μg/mL之间;试验证实，AITC能够导致供试土传病原真菌及卵菌菌落扩展速度减慢，气生菌丝稀薄、孢子萌发率降低，病原细菌菌落数量减少、生长速度减缓，对常见的植物病原菌呈现出广谱、高效的抑菌活性，为辣根素熏蒸防控田间主要土传病害提供了理论支持。
由大丽轮枝菌Verticillium dahliae引起的棉花黄萎病是一种重要的土传植物维管束病害，严重影响棉花产量[39]。作者团队的李慧[40]前期研究表明，20%辣根素水乳剂1 500倍稀释液不仅对棉花黄萎病菌菌丝生长具有显著的抑制作用，同时对棉花种子出苗和幼苗生长具有安全性。刘政等[39]采用滴灌与覆膜施药的方式，连续两年对20%辣根素水乳剂防控棉花黄萎病的田间效果进行研究，提出了该药剂防控棉花黄萎病的使用技术规程，且在合作试验地区合计辐射应用面积达到1.4万hm2。
2.2 对果蔬地上部病虫害靶标生物的活性
王彦柠等[38]研究表明，AITC对番茄溃疡病菌Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis、十字花科黑腐病菌Xanthomonas campestris pv. campestris等5种植物病原细菌的生长具有显著抑制作用，EC50分布在0.81～8.61 μg/mL之间。
北京市近几年来大力推广使用AITC，建立了以蔬菜无病虫育苗、产前消毒预防、产中综合防控和产后残体无害处理有机结合的“全程绿色防控”技术体系。目前，北京市蔬菜病虫全程绿色防控示范基地数量达到20 个，覆盖了全市10 个区（县），有效减少了病虫危害程度和化学农药用量[41]。示范试验证实，20% 辣根素水乳剂对烟粉虱有很好的速效性，药后3 d防效达到70.9%，且成本低廉，操作简便[42];采用滴灌施药方法，发现其对土壤真菌中的镰刀菌杀灭效果达到100%，对腐霉、曲霉、青霉等杀灭效果显著;设施草莓土壤经過辣根素消毒处理整个生长期内的植株成活率明显提高[43]。天津市津南区植保部门通过滴灌系统把辣根素注入土地后覆盖上一层密闭的厚膜，熏蒸处理3 d即可有效杀灭多种病虫，按照操作规程定植蔬菜，一季不用再除草、除虫，还能保证蔬菜的品质[44]。王晓青等在生菜定植前7 d采用20%辣根素水乳剂以随水滴灌方式对连续种植3年以上菌核病发生严重的生菜地进行土壤熏蒸处理，定植后7 d使用抗重茬菌剂或使用寡雄腐霉灌根处理，对生菜菌核病防治效果可达到80%左右[45]。 2.3 对作物储藏期病虫害靶标的生物活性
AITC因具有强烈的挥发性以及高效的抗微生物活性，且对多种食源性致病菌具有杀灭活性，研究者认为可将AITC开发成一种新型的包装策略，如作为“抗菌香囊（anti-microbial sachets）”防控由Aspergillus flavus引起的储藏期花生黄曲霉素的污染[46]。Tracz等采用AITC对储藏期玉米粒密闭熏蒸处理48 h后进行通风处理，检测了玉米粒中AITC的残留量。结果表明，通风24 h后，玉米籽粒中可检测到44.5%的AITC，继续密封保存30 d后籽粒中仍有15.5%的AITC被检测出，说明在储藏过程中，玉米粒可以作为AITC的吸收维持载体，通过缓释的方式逐渐散发到空气中，对储藏期玉米由5种真菌产生的12种毒素都具有显著的抑制效果[47]。Nazareth等研究表明，AITC可降低储藏期面粉中由寄生曲霉Aspergillus parasiticus产生的黄曲霉毒素（aflatoxin）及早熟禾镰刀菌Fusarium poae产生的白僵菌素（beauvericin）和恩镰孢菌素（enniatin）的积累[48]。除此之外，也有学者采用AITC对莴苣、苹果、番茄、草莓、黑莓、悬钩子等蔬果储藏期病害进行防控研究[49-51]。在杀虫方面，AITC也具有安全高效性且与磷化氢等无交互抗药性[52]，可作为一种针对储藏期害虫防控的有效策略。
2.4 对杂草的生物活性
Ren等[53]采用AITC进行番茄地土壤熏蒸处理，发现其不但可以有效杀灭土壤环境中的病原真菌、细菌及线虫等，同时对土壤中的杂草（LC50=17.3～47.7 mg/kg）也具有很好的杀灭活性。Matteo等也发现，十字花科作物粗提取物对大穗看麦娘Alopecurus myosuroides具有优异的生物活性[54]。Bangarwa等研究发现[55]，AITC作为除草剂控制苋科植物、马唐的效果与甲基溴相当。2018年申请的美国专利（US201801225077A1）中也表明，ITCs类特别适用于对杂草的抑制。
3 AITC残留和安全性
3.1 AITC残留分析方法
Tracz等[47]研究AITC防控储藏期由Aspergillus parasiticus，Fusarium tricinctum，F.verticillioides以及Alternaria alternata引起的玉米毒素产生水平时，优化了AITC在玉米粒中的残留分析条件，包括1）样品制备：将一定质量的玉米粒浸泡在甲醇中，40℃水浴中振荡30 min后再超声处理10 min，20℃ 4 000 r/min离心5 min后收集上清液，过0.22 μm滤膜;2）检测方法及条件：采用HPLC的方法，检测器为安捷伦二极管阵列检测器（LC-DAD），检测波长为236 nm，分离柱为Gemini C18（4.6 mm×150 mm，孔径3 μm），流动相为水∶乙腈（V∶V=60∶40），流速為0.8 mL/min。
吴华等[56]建立了20%AITC在几种仓库贮藏品中的毛细管气相色谱残留分析方法。该方法以二氯甲烷为提取溶剂，采用毛细管气相色谱-火焰离子化检测仪进行测定（与国标GB29980-2013中规定的检测器一致），发现辣根素在贮藏品中的消解动态符合一级动力学方程，其半衰期为28～75 d，其降解过程主要是酶解、水解、光解。Ugolini等[57]采用固相微萃取技术，以气相色谱火焰离子化检测器进行测定AITC在草莓果实中的残留。
3.2 AITC安全性评价
3.2.1 对人体的安全性
1999年AITC免除了注册化学品的注册授权和限制，并且在日本作为一种商品化的天然抗菌剂或防腐剂添加到食品中[58];2006年美国规定AITC可作为一种“公认安全食品”添加到食品储藏罐中，用来延长食品保质期和抗腐败;2011年美国食品药品监督管理局规定AITC可作为一种食品添加剂直接加入食品中使用，而且被认为有利于人体健康[1，46];欧洲国家也明确了AITC作为食品防腐剂和食品添加剂具有安全性[59]。
Otoni等采用AITC防控由Aspergillus flavus引起的储藏期花生黄曲霉素的污染，在前15 d约92.4%的AITC已经降解，30 d后无AITC可检出[46]。Ugolini采用0.1 mg/L AITC处理草莓果实4 h后，可使灰霉病发生降低47.4%～91.5%，且对果实的营养品质等无影响，储藏7 d后AITC残留量低于1 mg/kg[57]。Santos等采用300 μL/kg的AITC对储藏期密封保存的玉米粒真菌毒素的产生进行防控，结果表明，储藏150 d后，AITC对玉米种子的发芽势、含水量、容重以及电导率等生理指标均无影响[60]。Wu等[25]采用AITC处理稻米，其残留量低于5 μg/g。欧盟委员会规定，AITC日摄取量（tolerable daily intake， TDI）最高为每千克体重0.06 mg[61]。研究表明，一定时间后AITC残留基本检测不到或含量极低，表明采用AITC进行食品保鲜或病害防控，不太可能导致储藏产品中的残留问题，也不太可能会对人类健康产生威胁。美国国家环境保护局（United States Environmental Protection Agency）官方数据表明，AITC安全性高，对婴幼儿等也无不良反应（https：∥www.epa.gov/）。
3.2.2 对非靶标生物的安全性
Zaborski等采用100 mg/L的AITC作驱避剂收集土壤中的蚯蚓，其收集效果与200 mg/L的福尔马林相比无显著差异，且对蚯蚓具有更小的毒性，因此认为将AITC引入土壤环境中是安全的[62]。Borek等[63]测定了AITC在6种不同土壤中的半衰期，为20～60 h，且随着土壤水分的降低和温度的升高，AITC降解速度加快。Isagro美国公司联合美国多所大学的研究人员针对以AITC为原料登记的土壤熏蒸剂“DOMINUS”进行了严格的测试，说明其在土壤中能快速降解，在作物种植前施用，土壤中不会残留，是一款环境友好型的产品[64]。Wu等认为AITC对非靶标生物具有极低的毒性，因此也易被农户接受[65]。 研究报道[36，66]表明，土壤中的有益微生物如Trichoderma spp.等对AITC不敏感，展现出很强的忍耐性。Weerakoon等也发现AITC处理过的土壤环境中，T.hamatum和T.virens仍然是主要群体[34]。美国EPA官方数据表明AITC对环境友好，对非靶标生物（除部分昆虫如蜜蜂外）无毒性作用[67]。
4 AITC的农药登记与产业化应用
4.1 AITC剂型研发
由于AITC分子量很小，化学性质活泼，常温下具有很强的挥发性和刺激性，给使用带来了不便。彭家华采用分子包结络合法，制备了AITC微胶囊剂。该微胶囊剂有一定的缓释作用且利用率可提高到80%左右[68]。中国农业大学李健强团队选用高吸附性惰性材料等载体和助剂制备了多种用途的AITC剂型：包括水乳剂，颗粒剂，缓释型颗粒剂，缓释型纸片、塑料、块、袋等。
4.2 AITC施药器械及方式
辣根素是新型植物源药剂，作为土壤处理剂可有效杀灭多种土壤微生物，防控多种土传病害。施药时可根据土传病害发生严重程度选择随水滴灌施用或在播种前或移栽前采用起垄覆膜密封后，进行土壤熏蒸。
常用施药器械有烟雾施药机、远程机动喷雾器等高效施药器。目前，由北京市果类蔬菜创新团队病虫防控研究室联合设施设备研究室研发的辣根素土壤消毒专用施药机械已面世，该设备基本具备液态药剂土壤注射施用功能，机具采用履带式行走，稳定性高;可根据行走速度精准设定施药量;可根据消毒需要调节施药深度;采用多重防堵防漏措施，具有很高的施药安全性（http：∥www.bjny.gov.cn/）。当然，由于AITC具有强烈的刺激性，进行消毒时，操作人员应该进行自身防护，如佩戴护目镜、防毒面具等。
4.3 AITC的农药登记
以AITC为原料进行的农药登记，最早是美国约旦农业公司2000年登记的“Dazitol”。它是一种由辣椒素及相关物质（有效含量为0.42%）和异硫氰酸烯丙酯（有效含量为3.7%）组成的混合物，用于土壤处理可有效杀灭或抑制土壤中的线虫、有害昆虫、病原菌及杂草[69]。目前Dazitol正式登记的国家或地区有智利、约旦、阿联酋、科威特、美国、希腊、土耳其、摩洛哥、黎巴嫩、以色列、墨西哥、哥伦比亚、巴西、阿根廷、泰国、秘鲁、埃及、西班牙、伊拉克等（http：∥www.ynlagensu.com/userlist/lclmsw/text-9449.html）。除此之外，Isagro美国公司2014年登记的以AITC为活性成分的“Dominus”产品（https：∥www.isagro.com/prodotti/fumiganti.html）是第一款可同时用于传统及有机耕种的土壤生物熏蒸剂，对土壤中的真菌、线虫、杂草和昆虫具有广谱防治功效，其登记类别为“以天然物质为基础的生物农药”[65]。2017年，Mardel Rose Belotinsky TriCal公司登记了AITC与氯化苦的复配制剂投入市场（http：∥www.trical.com/）。
2018年，以AITC为有效成分的我国自创品牌“70%辣根素原药”（登记证号：PD20181601）和“20%辣根素水乳剂”（登记证号：PD20181600）由云南联创利民生物工程有限公司获得首家农药登记，用于防治番茄根结线虫。
4.4 AITC替代溴甲烷的应用
溴甲烷作为一种熏蒸类杀虫剂由来已久[70]。1932年法国首先使用，1937年后广泛使用于植物检疫熏蒸处理，我国于1953年开始用于熏蒸棉籽，后逐渐用于陆地或船舱中的熏蒸灭虫及仓储期杀虫[71]。根据《蒙特利尔议定书》哥本哈根修正案，发达国家和发展中国家分别于2005年和2015年淘汰使用溴甲烷。为了淘汰溴甲烷，各国科学家都在努力寻找安全、经济、有效的替代品，并取得了一些进展，如磷化氢、威百亩、氯化苦等[56]。但随着用药历史的延长，多个国家出现了包括玉米象、谷蠹、赤拟谷盗、嗜虫书虱等在内的至少11种储藏物害虫表现出对磷化氢，溴甲烷等的抗性[72-75]，因此，寻找新型的安全、高效、可替代溴甲烷和磷化氢的新型化学品迫在眉睫。
曹坳程等[69，78]早在2006年提出AITC是一种安全、环境相容性好的熏蒸剂，是溴甲烷的潜在替代品。近年来，国内越来越多的团队通过大量的田间实践，证明AITC具有广阔的应用前景。
为实现中国政府的履约目标，由环境保护部和农业部共同组织实施了农业行业甲基溴淘汰项目，举办了“2015年农业行业甲基溴淘汰与土壤消毒技术培训班”，由北京市植保站作为执行和技术指导单位，联合中国农业科学院、中国农业大学、山东省农业环境保护和农村能源总站以及多个企业在山东、河北等省市开展辣根素土壤消毒试验，为溴甲烷替代药剂的开发和应用提供试验数据，推动溴甲烷淘汰项目顺利实施[76]。
国内以云南联创利民生物工程有限公司为代表的企业，大力开展以AITC为有效成分的农药制剂开发，在马铃薯病害综合防治、棉花黄萎病、草莓根腐病、蔬菜根结线虫等主要作物种传、土传病虫害，以及大宗蔬菜黄瓜、番茄等蔬菜多种地上部病蟲害治理中取得了良好的防控效果。目前，国内中国农业大学以及云南农业大学等高校也积极采用AITC防控魔芋细菌性软腐病、具有连作障碍的三七根腐病以及食用百合根及鳞茎腐烂病[77]等，取得了阶段性进展。
5 AITC的作用机制
吴华等对AITC在医学领域抗肿瘤、抗癌的活性，以及其对仓储害虫、病原微生物、线虫、杂草等农业有害生物的活性研究进行了综述[79]。本文结合文献报道重点对AITC的作用机制进行评述。
5.1 诱导线虫细胞压力
Saini等用AITC处理秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans，采用RT-qPCR方法研究了AITC对其热激蛋白基因HSP70表达的影响。结果发现，低浓度AITC（