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[摘要] 目的 摸索三种不同制片方法对乳腺疾病石蜡组织细胞的DNA进行定量分析，探讨三种方法的优劣及其在细胞DNA定量分析过程中的影响。 方法 本实验采用常规制片脱蜡法、常规制片脱蜡酶消法、石蜡组织制备细胞悬液法，分别对80例乳腺疾病的石蜡组织进行Feulgen染色，应用全自动DNA倍体分析仪对DNA染色玻片进行扫描分析。 结果 在三种方法中，常规制片脱蜡法染色结果不理想，常规制片脱蜡酶消法取得了最佳的染色效果，而石蜡组织制备细胞悬液法制备的玻片上部分区域存在一定的细胞重叠现象。 结论 常规制片脱蜡酶消法可用于乳腺疾病石蜡切片的DNA倍体分析。
[关键词] DNA倍体分析；乳腺疾病；制片方法
[中图分类号] R44 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）14-0053-03
乳腺癌是危害妇女健康的最常见的恶性肿瘤之一。乳腺癌前病变尤其是非典型性增生与乳腺癌关系相当密切，以组织细胞学形态为主要根据判断乳腺癌前病变与乳腺原位癌有时相当困难[1-3]。DNA异倍体的形成是一个多因素相互作用的结果，已有很多报道表明，DNA倍体与临床分期、增殖和预后有关。DNA倍体检测与分析的技术方法目前在细胞学领域应用广泛[4-6]，但在乳腺疾病实体组织中的应用国内未见报道。本研究使用三种制片方法对乳腺疾病的石蜡组织进行细胞DNA定量分析，旨在摸索出一种稳定有效的实体组织DNA倍体分析制片方法，为乳腺疾病DNA倍体分析检测提供前提和必要条件。本文将三种制片方法及其质量等作一比较分析。
1 材料与方法
1.1 材料
收集我院2012年10～12月送检乳腺疾病实体组织蜡块并进行筛选分组，分组如下：乳腺增生症20例，乳腺非典型增生疾病20例，乳腺原位癌20例，乳腺浸润性癌蜡块20例。每例病例选取最具代表性的蜡块各一块，共80块蜡块。
1.2 制片
分三组对80个蜡块进行DNA倍体分析前制片工作。
1.2.1 A组（常规制片脱蜡法） 80个蜡块进行常规石蜡切片，使用切片机行2μm厚切片1张。石蜡切片于56℃烤片15 min，二甲苯脱蜡10min，75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇梯度脱水各5 min，蒸馏水清洗后进行。
1.2.2 B组（常规制片脱蜡酶消法） 80个蜡块进行常规石蜡切片，使用切片机行2μm厚切片1张。石蜡切片于56℃烤片15 min，二甲苯脱蜡，75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇梯度脱水各5 min，蒸馏水清洗，蒸馏水中高压修复2 min 30 s，37℃胃蛋白酶消化5min，PBS清洗。
1.2.3 C组（石蜡组织制备细胞悬液法） 80个蜡块进行常规石蜡切片，使用切片机行5 μm厚切片10张。经56℃二甲苯脱蜡20 min，75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇梯度脱水各5 min，加入3 mL胶原酶消化液，置37℃恒温水浴锅中消化30 min并不断用吸管吹打，1 000转/5 min离心沉淀，收集细胞悬液，低渗液低渗15 min，1 000转/5 min离心沉淀，PBS液漂洗2次，1 000转/5 min离心沉淀。80例均制备细胞悬液涂片，镜下观察确保保留完整的细胞核。
1.3 染色
将A、B、C三组玻片置B.S 固定液中固定50 min；流水洗涤1 min；5N盐酸酸解1 h，室温 （25±2）℃；流水洗涤1 min；将切片置Feulgen染液中染色75 min，室温（25± 2）℃[2]；流水洗涤1 min后，蒸馏水中浸洗15 min[7]。
1.4 脱水
玻片置于75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇梯度脱水各5 min。
1.5 封片
将玻片依次置于无水乙醇： 二甲苯（1：1）、100% 二甲苯、100%二甲苯中3 min；再一张张取出，滴加中性树胶进行封片。
1.6 细胞DNA定量分析
三组所有玻片经Feulgen 染色后采用Motic BA600全自动高分辨率细胞DNA图像定量分析系统（全自动DNA倍体分析仪）进行扫描分析。系统硬件由全自动数码显微镜Motic600及摄像头205C组成，对每个标本的单张玻片中约8 000个细胞核进行扫描测定，以标本单张玻片中的正常细胞作为内参，同时进行100多个参数的特征值的处理分析，并根据其不同数值自动完成细胞计数和分类。其中表示DNA含量的DNA指数（DNA Index，DI）为关键参数， DI值的计算方法为：被测细胞的积分光密度（IOD）与正常细胞积分光密度的比值。正常上皮细胞DI 值范围在（1±0.25）之间；当1.25 < DI < 2.5时，可判断为增生或疑似病变的细胞；病变细胞均为DI≥2.5[8]。该系统会自动识别重叠细胞核及玻片中细胞核碎片等不参与诊断的垃圾细胞（染料残留也会偶尔出现，也归于垃圾细胞类），而淋巴细胞和中性粒细胞也会被分析，分类在相应的淋巴细胞组别和粒细胞组别。在临床工作中由细胞技术员在显微镜下对DI≥2.5的所有细胞核进行复核辨别，确保DNA 定量分析检测的准确。
使用ICLASSY软件进行图像分析，观察A、B、C三组玻片中各个样本的细胞成像情况、IOD值、MEAN值等指标。被测细胞的积分光密度（IOD）[9]和平均峰值是判定该实验结果的重要参数，前者决定每个细胞最后的DI值，后者决定标本是否存在标准化偏差。
2 结果
2.1 A组（常规制片脱蜡法）
扫描玻片中细胞数量均达8 000个，镜下细胞核基本为平层，细胞核完整、少见破裂现象，玻片中有红细胞、炎细胞存在。部分细胞染色较深，部分细胞染色较浅，IOD值均偏大，在145～165之间，不符合最佳染色深度观察指标。平均峰值均在1.3以上，不符合最佳染色标准。 2.2 B组（常规制片脱蜡酶消法）
扫描玻片中细胞数量均达8 000个，镜下细胞结构清晰、背景干净，细胞核完整，少量红细胞、炎细胞存在。染色均一， IOD值在120左右，符合最佳染色深度观察范围。平均峰值在0.98～1.2之间，符合最佳染色标准。
2.3 C组（石蜡组织制备细胞悬液法）
玻片细胞集中，滴片范围符合计算机扫片需要，其中3例细胞数量偏少，未达到8 000个细胞。镜下细胞部分区域有重叠凝集现象，但基本为一层，细胞结构清晰、无红细胞干扰，有少量炎细胞存在。染色均一，IOD值在110～130之间，符合最佳染色深度观察范围。平均值在0.98～1.2之间，符合最佳染色标准。
从上述情况分析，B组质量最好，C组其次，A组较差。
3 讨论
早期诊断、早期治疗是防治乳腺癌的关键，近年来围绕乳腺癌的各种研究一直很活跃，大量的乳腺疾病文献指出，单纯依靠形态学特征进行诊断存在两方面的问题[10]：①由于各个病理医师由于经验和认识的不同对同一标本存在不同的主观性，进而得出不同的结论。②经常发现病理分级相同的肿瘤在临床上出现不同的生物学行为和预后。因此，如何更客观地反映肿瘤的生物学行为，已成为肿瘤病理学研究的重要课题。肿瘤遗传学表明，细胞核DNA是细胞的遗传物质，是决定细胞生长、分化、分裂和各种形状的重要因素[11]。正常细胞核DNA含量二倍体形式存在， DNA含量变化多为倍性增加，直接反映肿瘤增殖活性的大小。良性肿瘤多以四倍体等形式增殖，而以异倍体增殖多为恶性肿瘤[12，13]。
本文采用全自动细胞DNA倍体分析来判断预测乳腺疾病进程，是近来研究乳腺癌前病变领域的新手段[14～16]，取得石蜡切片稳定正确的分析结果的基础是摸索出稳定的石蜡切片进行Feulgen染色制片方法，在整个DNA倍体分析过程中，制片及其染色质量会严重影响到报告的诊断质量，对不利因素加以控制，做好质控，对计算机读取结果正确分析判断，才能保证结果的准确性。
我们的三组试验均在同一实验室同一实验条件下完成。对三个不同分组的形态学及特征参数进行分别比较。首先进行形态学观察其细胞核形态是否完整、是否存在多数重叠等现象，其次根据细胞的积分光密度（IOD值）以确定正常二倍体峰的位置。不同组分的细胞IOD值不同，如粒细胞峰的IOD通常会比正常二倍体峰IOD稍低一些，根据这一点，可以判断正常二倍体峰是否标准化正确。标本操作指南中推荐IOD值在110左右，偏差20%的视为无效玻片，需进行重新扫描或重新制片。再次根据平均峰值，平均峰值通常在0.98～1.02这个范围，标准化正常的值偏差应该在2%以内，如果标准化的值偏出这个范围，做分析时就必须要注意。
A组（常规制片脱蜡法）采用常规石蜡制片脱蜡方法制片，经Feulgen染色后进行计算机处理分析，但因未作任何特殊处理，细胞膜上及DNA外包裹蛋白较厚，染料无法渗透均匀，故染色后细胞深浅不均一，计算机扫描处理后数据不佳，IOD值及MEAN值均不在推荐范围内，造成分析软件无法进行DNA倍体分析的现象。该组最大的优点是制作简便，只需在常规制作石蜡切片时多切一张用于DNA倍体分析即可，但鉴于其染色效果不理想，不推荐采用此种制片方法。
B组（常规制片脱蜡酶消法）制片质量最佳。该组也是采用常规石蜡制片脱蜡方法制片，但其进行了高压修复，高压修复一般用于甲醛固定石蜡包埋后组织的免疫组化中，加热使抗原性物质分子运动加剧，使抗原暴露，达到修复的目的[17]。本研究使用高压修复后经胃蛋白酶消化，可使组织表白中细胞排列密集，特别是出现重叠的细胞经消化后出现更多裸核的效果，但该方法必须严格掌握胃蛋白酶的工作浓度和工作时间，否则出现细胞消化过度，细胞出现空泡的现象实验即宣告失败。故活检组织需在消化前在显微镜下观察标本形态以调节消化的时间和浓度，灵活掌握。另不同实验室组织的消化时间也不会完全一致，应自行摸索消化最佳时间。但该组玻片经Feulgen染色后效果最佳，染色均一，细胞核平层不破裂，红细胞较少，进行后期DNA倍体分析后得到最稳定可靠的分析数据。
C组（石蜡组织制备细胞悬液法）制作的片子细胞结构清晰，胶原消化液消化黏液，低渗液破坏红细胞，玻片背景较干净， 但部分区域有重叠凝集现象，部分腺上皮细胞出现皱缩情况。该组手工滴片稳定性较差，操作步骤较A、B组稍多。因胶原消化液为进口试剂，临床使用需增加科室制片成本。该组特点是可完全消除红细胞，样本上细胞量可根据滴片时的肉眼所见自行掌握，并可反复制作多张玻片。
综上所述，B组（常规制片脱蜡酶消法）制片方法可用于乳腺疾病石蜡切片的DNA倍体分析，我们进一步的研究将探讨从正常乳腺组织到乳腺癌进程中DNA倍体改变情况以及这种改变在肿瘤组织分化中起到的作用，为乳腺癌前病变与乳腺癌发生的临床诊疗提供一个新的思路。
4 致谢
感谢科主任和同事们在本文实验过程中给予的指导，这篇论文的每个实验细节和每个数据，都离不开同事们的帮助。
[参考文献]
[1] Cole K，Tabernero M，Anderson KS. Biologic characteristics of premalignant breast disease[J]. Cancer Biomark，2010，9（1-6）：177-192.
[2] Wagner PL，Kitabayashi N，Chen YT. Clonal relationship between closely approximated low-grade ductal and lobular lesions in thebreast： a molecular study of 10 cases[J]. Am J Clin Pathol，2009，132（6）：871-876. [3] Buerger H，Simon R，Schafer KL，et al. Genetic relation of lobular carcinoma in situ，ductal carcinoma in situ，and associated invasive carcinoma of the breast[J]. Mol Pathol，2000，53：118-121.
[4] Kashyap V. Microphotometric nuclear DNA analysis of atypical squamous cells of the uterine cervix[J]. Indian J Pathol Microbiol，2012， 55（2）：267-268.
[5] Remmerbach TW，Weidenbach H，Pomjanski N，et al. Cytologicand DNA-cytometric early diagnosis of oral cancer[J]. Anal Cell Pathol，2001，22（4）：211-221.
[6] Sorbe B. Predictive and prognostic factors in definition of risk groups in endometrial carcinoma[J]. ISRN Obstet Gynecol，2012：325790.
[7] Kjellstrand P. Mechanisms of the Feulgen acid hydrolysis[J]. J Microsc，1980，119：391-396.
[8] 孟芝兰，程雪梅，朱晨雁. 全自动DNA 定量分析系统在宫颈癌及癌前病变筛查中的应用价值[J]. 诊断病理学杂志，2012，19（1）：15-17.
[9] 汪薇，王诗航. 光密度值测定在实验医学研究中的应用及意义[J]. 解剖科学进展. 2006，12（3）： 286.
[10] Ottesen GL，Christensen IJ，Larsen JK. Flow cytometric DNA analysis of breast cancers with predominance of carcinoma in situ： a comparison of the premalignant and malignant components[J]. Clin Cancer Res，1995，1（8）：881-888.
[11] Barrett MT，Lenkiewicz E，Evers L. Clonal evolution and therapeutic resistance in solid tumors[J]. Front Pharmacol，2013；4：2.
[12] Jacobs KB，Yeager M，Zhou W. Detectable clonal mosaicism and its relationship to aging and cancer[J]. Nat Genet，2012，44（6）：651-658.
[13] Ottesen GL，Christensen IJ，Larsen JK. DNA aneuploidy in early breast cancer[J]. Briffsh Journal of Cancer，1995，72：832-839
[14] Ermiah E，Abdalla F，Buhmeida A. Prognostic significance of DNA image cytometry in Libyan breast cancer[J]. Oncology，2012，83（3）：165-176.
[15] Pinto AE，André S，Soares J. Short-term significance of DNA ploidy and cell proliferation in breast carcinoma： a multivariate analysis of prognostic markers in a series of 308 patients[J]. J Clin Pathol，1999，52（8）：604-611.
[16] Ottesen GL. Carcinoma in situ of the female breast. A clinico-pathological，munohistological，and DNA ploidy study[J]. APMIS Suppl，2003，108：66-67.
[17] 王映梅. 高压抗原修复方法在免疫组化染色的应用比较[J]. 细胞与分子免疫学杂志，2012，28（10）：1098-1099.
（收稿日期：2013-01-08）
[关键词] DNA倍体分析；乳腺疾病；制片方法
[中图分类号] R44 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）14-0053-03
乳腺癌是危害妇女健康的最常见的恶性肿瘤之一。乳腺癌前病变尤其是非典型性增生与乳腺癌关系相当密切，以组织细胞学形态为主要根据判断乳腺癌前病变与乳腺原位癌有时相当困难[1-3]。DNA异倍体的形成是一个多因素相互作用的结果，已有很多报道表明，DNA倍体与临床分期、增殖和预后有关。DNA倍体检测与分析的技术方法目前在细胞学领域应用广泛[4-6]，但在乳腺疾病实体组织中的应用国内未见报道。本研究使用三种制片方法对乳腺疾病的石蜡组织进行细胞DNA定量分析，旨在摸索出一种稳定有效的实体组织DNA倍体分析制片方法，为乳腺疾病DNA倍体分析检测提供前提和必要条件。本文将三种制片方法及其质量等作一比较分析。
1 材料与方法
1.1 材料
收集我院2012年10～12月送检乳腺疾病实体组织蜡块并进行筛选分组，分组如下：乳腺增生症20例，乳腺非典型增生疾病20例，乳腺原位癌20例，乳腺浸润性癌蜡块20例。每例病例选取最具代表性的蜡块各一块，共80块蜡块。
1.2 制片
分三组对80个蜡块进行DNA倍体分析前制片工作。
1.2.1 A组（常规制片脱蜡法） 80个蜡块进行常规石蜡切片，使用切片机行2μm厚切片1张。石蜡切片于56℃烤片15 min，二甲苯脱蜡10min，75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇梯度脱水各5 min，蒸馏水清洗后进行。
1.2.2 B组（常规制片脱蜡酶消法） 80个蜡块进行常规石蜡切片，使用切片机行2μm厚切片1张。石蜡切片于56℃烤片15 min，二甲苯脱蜡，75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇梯度脱水各5 min，蒸馏水清洗，蒸馏水中高压修复2 min 30 s，37℃胃蛋白酶消化5min，PBS清洗。
1.2.3 C组（石蜡组织制备细胞悬液法） 80个蜡块进行常规石蜡切片，使用切片机行5 μm厚切片10张。经56℃二甲苯脱蜡20 min，75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇梯度脱水各5 min，加入3 mL胶原酶消化液，置37℃恒温水浴锅中消化30 min并不断用吸管吹打，1 000转/5 min离心沉淀，收集细胞悬液，低渗液低渗15 min，1 000转/5 min离心沉淀，PBS液漂洗2次，1 000转/5 min离心沉淀。80例均制备细胞悬液涂片，镜下观察确保保留完整的细胞核。
1.3 染色
将A、B、C三组玻片置B.S 固定液中固定50 min；流水洗涤1 min；5N盐酸酸解1 h，室温 （25±2）℃；流水洗涤1 min；将切片置Feulgen染液中染色75 min，室温（25± 2）℃[2]；流水洗涤1 min后，蒸馏水中浸洗15 min[7]。
1.4 脱水
玻片置于75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇梯度脱水各5 min。
1.5 封片
将玻片依次置于无水乙醇： 二甲苯（1：1）、100% 二甲苯、100%二甲苯中3 min；再一张张取出，滴加中性树胶进行封片。
1.6 细胞DNA定量分析
三组所有玻片经Feulgen 染色后采用Motic BA600全自动高分辨率细胞DNA图像定量分析系统（全自动DNA倍体分析仪）进行扫描分析。系统硬件由全自动数码显微镜Motic600及摄像头205C组成，对每个标本的单张玻片中约8 000个细胞核进行扫描测定，以标本单张玻片中的正常细胞作为内参，同时进行100多个参数的特征值的处理分析，并根据其不同数值自动完成细胞计数和分类。其中表示DNA含量的DNA指数（DNA Index，DI）为关键参数， DI值的计算方法为：被测细胞的积分光密度（IOD）与正常细胞积分光密度的比值。正常上皮细胞DI 值范围在（1±0.25）之间；当1.25 < DI < 2.5时，可判断为增生或疑似病变的细胞；病变细胞均为DI≥2.5[8]。该系统会自动识别重叠细胞核及玻片中细胞核碎片等不参与诊断的垃圾细胞（染料残留也会偶尔出现，也归于垃圾细胞类），而淋巴细胞和中性粒细胞也会被分析，分类在相应的淋巴细胞组别和粒细胞组别。在临床工作中由细胞技术员在显微镜下对DI≥2.5的所有细胞核进行复核辨别，确保DNA 定量分析检测的准确。
使用ICLASSY软件进行图像分析，观察A、B、C三组玻片中各个样本的细胞成像情况、IOD值、MEAN值等指标。被测细胞的积分光密度（IOD）[9]和平均峰值是判定该实验结果的重要参数，前者决定每个细胞最后的DI值，后者决定标本是否存在标准化偏差。
2 结果
2.1 A组（常规制片脱蜡法）
扫描玻片中细胞数量均达8 000个，镜下细胞核基本为平层，细胞核完整、少见破裂现象，玻片中有红细胞、炎细胞存在。部分细胞染色较深，部分细胞染色较浅，IOD值均偏大，在145～165之间，不符合最佳染色深度观察指标。平均峰值均在1.3以上，不符合最佳染色标准。 2.2 B组（常规制片脱蜡酶消法）
扫描玻片中细胞数量均达8 000个，镜下细胞结构清晰、背景干净，细胞核完整，少量红细胞、炎细胞存在。染色均一， IOD值在120左右，符合最佳染色深度观察范围。平均峰值在0.98～1.2之间，符合最佳染色标准。
2.3 C组（石蜡组织制备细胞悬液法）
玻片细胞集中，滴片范围符合计算机扫片需要，其中3例细胞数量偏少，未达到8 000个细胞。镜下细胞部分区域有重叠凝集现象，但基本为一层，细胞结构清晰、无红细胞干扰，有少量炎细胞存在。染色均一，IOD值在110～130之间，符合最佳染色深度观察范围。平均值在0.98～1.2之间，符合最佳染色标准。
从上述情况分析，B组质量最好，C组其次，A组较差。
3 讨论
早期诊断、早期治疗是防治乳腺癌的关键，近年来围绕乳腺癌的各种研究一直很活跃，大量的乳腺疾病文献指出，单纯依靠形态学特征进行诊断存在两方面的问题[10]：①由于各个病理医师由于经验和认识的不同对同一标本存在不同的主观性，进而得出不同的结论。②经常发现病理分级相同的肿瘤在临床上出现不同的生物学行为和预后。因此，如何更客观地反映肿瘤的生物学行为，已成为肿瘤病理学研究的重要课题。肿瘤遗传学表明，细胞核DNA是细胞的遗传物质，是决定细胞生长、分化、分裂和各种形状的重要因素[11]。正常细胞核DNA含量二倍体形式存在， DNA含量变化多为倍性增加，直接反映肿瘤增殖活性的大小。良性肿瘤多以四倍体等形式增殖，而以异倍体增殖多为恶性肿瘤[12，13]。
本文采用全自动细胞DNA倍体分析来判断预测乳腺疾病进程，是近来研究乳腺癌前病变领域的新手段[14～16]，取得石蜡切片稳定正确的分析结果的基础是摸索出稳定的石蜡切片进行Feulgen染色制片方法，在整个DNA倍体分析过程中，制片及其染色质量会严重影响到报告的诊断质量，对不利因素加以控制，做好质控，对计算机读取结果正确分析判断，才能保证结果的准确性。
我们的三组试验均在同一实验室同一实验条件下完成。对三个不同分组的形态学及特征参数进行分别比较。首先进行形态学观察其细胞核形态是否完整、是否存在多数重叠等现象，其次根据细胞的积分光密度（IOD值）以确定正常二倍体峰的位置。不同组分的细胞IOD值不同，如粒细胞峰的IOD通常会比正常二倍体峰IOD稍低一些，根据这一点，可以判断正常二倍体峰是否标准化正确。标本操作指南中推荐IOD值在110左右，偏差20%的视为无效玻片，需进行重新扫描或重新制片。再次根据平均峰值，平均峰值通常在0.98～1.02这个范围，标准化正常的值偏差应该在2%以内，如果标准化的值偏出这个范围，做分析时就必须要注意。
A组（常规制片脱蜡法）采用常规石蜡制片脱蜡方法制片，经Feulgen染色后进行计算机处理分析，但因未作任何特殊处理，细胞膜上及DNA外包裹蛋白较厚，染料无法渗透均匀，故染色后细胞深浅不均一，计算机扫描处理后数据不佳，IOD值及MEAN值均不在推荐范围内，造成分析软件无法进行DNA倍体分析的现象。该组最大的优点是制作简便，只需在常规制作石蜡切片时多切一张用于DNA倍体分析即可，但鉴于其染色效果不理想，不推荐采用此种制片方法。
B组（常规制片脱蜡酶消法）制片质量最佳。该组也是采用常规石蜡制片脱蜡方法制片，但其进行了高压修复，高压修复一般用于甲醛固定石蜡包埋后组织的免疫组化中，加热使抗原性物质分子运动加剧，使抗原暴露，达到修复的目的[17]。本研究使用高压修复后经胃蛋白酶消化，可使组织表白中细胞排列密集，特别是出现重叠的细胞经消化后出现更多裸核的效果，但该方法必须严格掌握胃蛋白酶的工作浓度和工作时间，否则出现细胞消化过度，细胞出现空泡的现象实验即宣告失败。故活检组织需在消化前在显微镜下观察标本形态以调节消化的时间和浓度，灵活掌握。另不同实验室组织的消化时间也不会完全一致，应自行摸索消化最佳时间。但该组玻片经Feulgen染色后效果最佳，染色均一，细胞核平层不破裂，红细胞较少，进行后期DNA倍体分析后得到最稳定可靠的分析数据。
C组（石蜡组织制备细胞悬液法）制作的片子细胞结构清晰，胶原消化液消化黏液，低渗液破坏红细胞，玻片背景较干净， 但部分区域有重叠凝集现象，部分腺上皮细胞出现皱缩情况。该组手工滴片稳定性较差，操作步骤较A、B组稍多。因胶原消化液为进口试剂，临床使用需增加科室制片成本。该组特点是可完全消除红细胞，样本上细胞量可根据滴片时的肉眼所见自行掌握，并可反复制作多张玻片。
综上所述，B组（常规制片脱蜡酶消法）制片方法可用于乳腺疾病石蜡切片的DNA倍体分析，我们进一步的研究将探讨从正常乳腺组织到乳腺癌进程中DNA倍体改变情况以及这种改变在肿瘤组织分化中起到的作用，为乳腺癌前病变与乳腺癌发生的临床诊疗提供一个新的思路。
4 致谢
感谢科主任和同事们在本文实验过程中给予的指导，这篇论文的每个实验细节和每个数据，都离不开同事们的帮助。
[参考文献]
[1] Cole K，Tabernero M，Anderson KS. Biologic characteristics of premalignant breast disease[J]. Cancer Biomark，2010，9（1-6）：177-192.
[2] Wagner PL，Kitabayashi N，Chen YT. Clonal relationship between closely approximated low-grade ductal and lobular lesions in thebreast： a molecular study of 10 cases[J]. Am J Clin Pathol，2009，132（6）：871-876. [3] Buerger H，Simon R，Schafer KL，et al. Genetic relation of lobular carcinoma in situ，ductal carcinoma in situ，and associated invasive carcinoma of the breast[J]. Mol Pathol，2000，53：118-121.
[4] Kashyap V. Microphotometric nuclear DNA analysis of atypical squamous cells of the uterine cervix[J]. Indian J Pathol Microbiol，2012， 55（2）：267-268.
[5] Remmerbach TW，Weidenbach H，Pomjanski N，et al. Cytologicand DNA-cytometric early diagnosis of oral cancer[J]. Anal Cell Pathol，2001，22（4）：211-221.
[6] Sorbe B. Predictive and prognostic factors in definition of risk groups in endometrial carcinoma[J]. ISRN Obstet Gynecol，2012：325790.
[7] Kjellstrand P. Mechanisms of the Feulgen acid hydrolysis[J]. J Microsc，1980，119：391-396.
[8] 孟芝兰，程雪梅，朱晨雁. 全自动DNA 定量分析系统在宫颈癌及癌前病变筛查中的应用价值[J]. 诊断病理学杂志，2012，19（1）：15-17.
[9] 汪薇，王诗航. 光密度值测定在实验医学研究中的应用及意义[J]. 解剖科学进展. 2006，12（3）： 286.
[10] Ottesen GL，Christensen IJ，Larsen JK. Flow cytometric DNA analysis of breast cancers with predominance of carcinoma in situ： a comparison of the premalignant and malignant components[J]. Clin Cancer Res，1995，1（8）：881-888.
[11] Barrett MT，Lenkiewicz E，Evers L. Clonal evolution and therapeutic resistance in solid tumors[J]. Front Pharmacol，2013；4：2.
[12] Jacobs KB，Yeager M，Zhou W. Detectable clonal mosaicism and its relationship to aging and cancer[J]. Nat Genet，2012，44（6）：651-658.
[13] Ottesen GL，Christensen IJ，Larsen JK. DNA aneuploidy in early breast cancer[J]. Briffsh Journal of Cancer，1995，72：832-839
[14] Ermiah E，Abdalla F，Buhmeida A. Prognostic significance of DNA image cytometry in Libyan breast cancer[J]. Oncology，2012，83（3）：165-176.
[15] Pinto AE，André S，Soares J. Short-term significance of DNA ploidy and cell proliferation in breast carcinoma： a multivariate analysis of prognostic markers in a series of 308 patients[J]. J Clin Pathol，1999，52（8）：604-611.
[16] Ottesen GL. Carcinoma in situ of the female breast. A clinico-pathological，munohistological，and DNA ploidy study[J]. APMIS Suppl，2003，108：66-67.
[17] 王映梅. 高压抗原修复方法在免疫组化染色的应用比较[J]. 细胞与分子免疫学杂志，2012，28（10）：1098-1099.
（收稿日期：2013-01-08）