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[摘要] 目的 建立超微戊己丸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量测定方法。 方法 采用Kromasail C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为流速1.0mL/min的乙腈-乙腈10%（50：50），测定波长为225nm。 结果 吴茱萸碱和吴茱萸次碱理论板数分别为2681和2067，Y吴茱萸碱=1.96 5×10-7X + 0.07646，r=0.9999）， Y吴茱萸次碱= 3.65 8×10-7X -0.2199，r=0.9999）， 吴茱萸碱与吴茱萸次碱的线性区间分别为10.2～51.0μg/mL以及10.0～50.0μg/mL ，两者平均回收率分别为97.3%和101.4%，其相对标准偏差分别为3.2%和3.9%，最低检测限为0.05μg/mL和0.1μg/mL。 结论 使用高效液相色谱法对超微戊己丸当中的吴茱萸碱以及吴茱萸次碱含量进行检测的精确率较高，重现性好。
[关键词] HPLC；吴茱萸碱；吴茱萸次碱
[中图分类号] R286 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）14-88-03
戊己丸属于纯中药制剂，其处方组成为白芍（炒）、黄连各300g，吴茱萸（制）50g，临床主要用于治疗肝胃疾病、腹泻腹痛、呕吐胃酸，能够达到泄肝火、调和脾胃的效果[1]。戊己丸的传统测定方式是测定当中盐酸小檗碱的含量，首先用酸性甲醇索式和乙醇洗脱氧化铝柱抽取和分解，最后利用紫外分光光度法获得，但除此以外，吴茱萸碱同样是药方中的重要组成部分，但是在中国药典及相关资料中对其测定方法的表述存在空白[2]。当前出现的测定方式包括薄层扫描色谱法、高效液相色谱法等，而吴茱萸碱以及吴茱萸次碱含量的测定尚少见报道，本研究以高效液相色谱法测定超微戊己丸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量，取得了较好的效果，主要研究结果报道如下。
1 仪器与试剂
本次采用的高效液相色谱仪器型号为Agilent1260，紫外检测器。戊己丸相关药材均由省药材公司提供，吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照品均购于省药检所，以上涉及药材均接受满足中国药典一部相关要求，流动相乙腈色谱纯由汇虹试剂公司提供；所用试剂除甲醇、乙腈为色谱纯外，其余为分析纯，水为超纯水[3]。
2 方法
2.1 溶液制备
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取吴茱萸碱1.5mg、吴茱萸次碱1.2mg，置于10mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀，备用。
2.1.2 供试品溶液的制备 取超微戊己丸1.3g于100mL锥型瓶中，加甲醇30mL，精密称定后水浴加热60min，放置使其温度与室温相同，精密称定，补足损失的重量，转移至100mL容量瓶中定容，0.45μm微孔滤膜过滤，封存备用[4]。
2.2 色谱条件及系统适应性实验
KromasailC18分析色谱柱（250mm×4.6mm，微粒直径5μm），流动相为流速1mL/min的乙腈-乙腈10%（50∶50），测定波长为225nm，柱温为31℃。在以上条件下进行吴茱萸碱以及吴茱萸次碱对照品的检测[5]。以上过程中吴茱萸碱保留时间为13.143min，吴茱萸碱理论塔板数为2681，吴茱萸次碱保留时间为16.025min，理论塔板数为2067，分离度大于1.5，对照品和供试品的HPLC图见图1。
图1 吴茱萸碱和吴茱萸次碱混合对照品（A）与供试品（B）的HPLC图
2.3 线性关系
精密选取适量的吴茱萸碱和吴茱萸次标准液，进样20μL，观察色谱峰面积，以峰评价面积值X线性回归浓度Y（μg/mL），计算得出：Y吴茱萸碱=1.965×10-7 X + 0.07646，r=0.9999），Y吴茱萸次碱=3.658×10-7X- 0.2199，r=0.9999），两者对照品稀释后依据最高值为基线噪音3倍计算[6]，最终得出吴茱萸碱和吴茱萸次碱的最低检测限分别为0.05μg/mL和0.1μg/mL。
2.4 提取方式
将超微戊己丸细粉末其中1.3g精密测定后放置在100mL锥形瓶中，再置入25mL乙醇精密称定，将20、40min时段超声提取后精密称定，补足失重，混匀，依照样品测定项目下方式计算含量，根据以上步骤继续取样，水浴加热选取20、40、60、90min，继续精确称定，补充消耗溶剂量，混匀，测定含量[7]。以60min加热提取率100%做参照，可计算出吴茱萸次碱20min超声提取率为63%，40min超声提取率为66%。而20min吴茱萸碱水浴提取率为80%，40、90min水浴提取率分别为97%、101%，20、40、90min吴茱萸次碱水浴提取率为80%、97%、101%。以上数据显示吴茱萸碱以及吴茱萸次碱水浴加热60min时能够完整提取。以上溶剂均为乙醇，水浴加热60min时进行样品提取。
2.5 精密度检验
先取1份吴茱萸对照溶液，试验色谱与上述相同，5次反复进样，观察得知吴茱萸碱、吴茱萸次碱平均峰面积为1 360 407μg/mL、533 273μg/mL，相对标准偏差为1.4%以及1.5%，结果表明仪器精密度良好[8]。
2.6 重复性试验
每份为200mg一共选取4份吴茱萸粉末，与溶液制备方式相同处理，在液相色谱仪中加入10μg溶液，在相同的色谱条件下，测得吴茱萸碱相对标准偏差为1.7%、吴茱萸次碱相对标准偏差分别为1.5%，结果表明方法的重复性良好[9]。
2.7 加样回收率检验
得到超微戊己丸粉末样品中吴茱萸碱以及吴茱萸次碱的含量后，继续选择5份粉末，精密加入各自量的100%到吴茱萸碱以及吴茱萸次碱当中，然后测定制备5份回收样品的含量，最终得到吴茱萸碱以及吴茱萸次碱的平均回收率分别为97.3%和101.4%，其相对标准偏差分别为3.2%和3.9%。 3 结果
含量测量结果：将在液相色谱仪中加入对照品溶液和供试品溶液各20μL，记录吴茱萸碱、吴茱萸次碱的色谱峰面积，计算最后结果。见表1。
表1 吴茱萸碱、吴茱萸次碱含量测量结果
批号 吴茱萸碱（mg/mL） 吴茱萸次碱（mg/mL）
011206 0.1759 0.2459
020110 0.1798 0.2577
020109 0.1837 0.2607
4 讨论
高效液相色谱法又可称为高压液相色谱，由于其操作便利，灵敏度高，分离效果好，当前已经成为众多领域尤其是中药领域当中最为重要的分离分析技术之一[10]。本研究戊己丸中的药材吴茱萸又称为茶辣、吴萸、米辣子、臭辣子树、漆辣子、左力纯幽子等，其来源于《本经》[11]，其中记载“主温中下气，止痛，咳逆寒热，除湿，血痹，逐风邪，开腠理。”本草纲目中则记载：“开郁化滞，治吞酸，厥阴痰涎头痛，阴毒腹痛，疝气血痢，喉舌口疮[12]。”，味道苦涩，对于患者能够祛寒止痛、抑制呕吐，同时阴虚火旺者不宜服用。临床主要应用在由阴浊上逆导致的头疼以及胃痛当中，同时对于肝胃虚寒也有较高的临床应用价值[13-14]。
本次测定首先确定了吴茱萸碱的最大吸收波长为225nm，当波长超过230nm时其吸收曲线呈现明显的下降，当波长高于240nm时候强吸收消失；与吴茱萸碱相比，吴茱萸次碱的最高吸收波长以及次强吸收波长分别为345nm以及215nm，当处于220～240nm时处于强吸收肩峰。由于本次要同时检测吴茱萸碱和吴茱萸次碱，因此必须兼顾两者的测定灵敏度，最终选择以225nm进行测定的标准波长。另外通过稳定性试验，发现样品溶液的温度应该设置在18～22℃中，放入容量瓶中妥善保存，在10d内能够基本保证稳定。从提取方式来看，将超微戊己丸碾磨至细粉状，再用超声法提取优于常规回流提取法，选择乙腈-乙腈10%（50∶50）作为流动相，分离效果较好。
[参考文献]
[1] 周臻，盂繁姝，曹高.高效液相色谱法测定左金胃内滞留漂浮型缓释片中吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量[J].中医学报，2012（6）：711-714.
[2] 张小梅，梁旭明，杨荣平，等.反相高效液相色谱法测定吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量[J].中国药业，2011，20（9）：29-30.
[3] 鲍天冬，董宇，杨庆，等.高效液相色谱法同时测定制吴茱萸及其提取物中吴茱萸碱、吴茱萸次碱和吴茱萸内酯含量[J].中国实验方剂学杂志，2007（6）：1-3.
[4] 甄攀，张荣山，白雪梅，等.吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的提取条件研究[J].中国药学杂志，2005，40（2）：99-101.
[5] 江星明，蒋芙蓉，李荣东.超微戊己丸与超微超微戊己丸药动学血样处理方法比较研究[J].中国现代药物应用，2011（1）：20-21.
[6] 苏建，刘永利，郭毅，等.多波长HPLC法同时测定四神丸中7个有效成分的含量[J].药物分析杂志，2013（9）：1531-1537.
[7] 盛蓉，宋英，呼梅，等.HPLC法测定吴茱萸碱分散片中吴茱萸碱的含有量及其均匀度[J].中成药，2012（12）：2352-2355.
[8] 刘绍欢，吴亚丽，张召英，等.HPLC测不同产地吴茱萸中吴茱萸碱、吴茱萸次碱及吴茱萸内酯的含量[J].辽宁中医杂志，2012（11）：2254-2255.
[9] 周臻，盂繁姝，曹高.高效液相色谱法测定左金胃内滞留漂浮型缓释片中吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量[J].中医学报，2012（6）：711-714.
[10] 李荣东，史俊，蔡光先，等.HPLC测定超微与常规戊己丸盐酸小檗碱含量的比较[J].现代医药卫生，2010，26（22）：3374-3375.
[11] 李荣东，史俊，蔡光先，等.HPLC测定超微与常规戊己丸中芍药苷含量的比较[J].亚太传统医药，2010，6（8）：23-24.
[12] 史俊，李荣东，蔡光先，等.不同生产工艺的戊己丸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱含质量比较[J].抗感染药学，2010，7（3）：179-181.
[13] 王世永，李小定.吴茱萸中吴茱萸碱和次碱的提取及测定[J].湖北农业科学，2008，47（3）：340-342.
[14] 胡晓艳，陈乐，熊犇，等.HPLC法测定吴茱萸超微速溶饮片中吴茱萸碱、吴茱萸次碱及柠檬苦素的含量[J].中国医药科学，2013，3（1）：108-110.
（收稿日期：2014-04-26）
[关键词] HPLC；吴茱萸碱；吴茱萸次碱
[中图分类号] R286 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）14-88-03
戊己丸属于纯中药制剂，其处方组成为白芍（炒）、黄连各300g，吴茱萸（制）50g，临床主要用于治疗肝胃疾病、腹泻腹痛、呕吐胃酸，能够达到泄肝火、调和脾胃的效果[1]。戊己丸的传统测定方式是测定当中盐酸小檗碱的含量，首先用酸性甲醇索式和乙醇洗脱氧化铝柱抽取和分解，最后利用紫外分光光度法获得，但除此以外，吴茱萸碱同样是药方中的重要组成部分，但是在中国药典及相关资料中对其测定方法的表述存在空白[2]。当前出现的测定方式包括薄层扫描色谱法、高效液相色谱法等，而吴茱萸碱以及吴茱萸次碱含量的测定尚少见报道，本研究以高效液相色谱法测定超微戊己丸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量，取得了较好的效果，主要研究结果报道如下。
1 仪器与试剂
本次采用的高效液相色谱仪器型号为Agilent1260，紫外检测器。戊己丸相关药材均由省药材公司提供，吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照品均购于省药检所，以上涉及药材均接受满足中国药典一部相关要求，流动相乙腈色谱纯由汇虹试剂公司提供；所用试剂除甲醇、乙腈为色谱纯外，其余为分析纯，水为超纯水[3]。
2 方法
2.1 溶液制备
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取吴茱萸碱1.5mg、吴茱萸次碱1.2mg，置于10mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀，备用。
2.1.2 供试品溶液的制备 取超微戊己丸1.3g于100mL锥型瓶中，加甲醇30mL，精密称定后水浴加热60min，放置使其温度与室温相同，精密称定，补足损失的重量，转移至100mL容量瓶中定容，0.45μm微孔滤膜过滤，封存备用[4]。
2.2 色谱条件及系统适应性实验
KromasailC18分析色谱柱（250mm×4.6mm，微粒直径5μm），流动相为流速1mL/min的乙腈-乙腈10%（50∶50），测定波长为225nm，柱温为31℃。在以上条件下进行吴茱萸碱以及吴茱萸次碱对照品的检测[5]。以上过程中吴茱萸碱保留时间为13.143min，吴茱萸碱理论塔板数为2681，吴茱萸次碱保留时间为16.025min，理论塔板数为2067，分离度大于1.5，对照品和供试品的HPLC图见图1。
图1 吴茱萸碱和吴茱萸次碱混合对照品（A）与供试品（B）的HPLC图
2.3 线性关系
精密选取适量的吴茱萸碱和吴茱萸次标准液，进样20μL，观察色谱峰面积，以峰评价面积值X线性回归浓度Y（μg/mL），计算得出：Y吴茱萸碱=1.965×10-7 X + 0.07646，r=0.9999），Y吴茱萸次碱=3.658×10-7X- 0.2199，r=0.9999），两者对照品稀释后依据最高值为基线噪音3倍计算[6]，最终得出吴茱萸碱和吴茱萸次碱的最低检测限分别为0.05μg/mL和0.1μg/mL。
2.4 提取方式
将超微戊己丸细粉末其中1.3g精密测定后放置在100mL锥形瓶中，再置入25mL乙醇精密称定，将20、40min时段超声提取后精密称定，补足失重，混匀，依照样品测定项目下方式计算含量，根据以上步骤继续取样，水浴加热选取20、40、60、90min，继续精确称定，补充消耗溶剂量，混匀，测定含量[7]。以60min加热提取率100%做参照，可计算出吴茱萸次碱20min超声提取率为63%，40min超声提取率为66%。而20min吴茱萸碱水浴提取率为80%，40、90min水浴提取率分别为97%、101%，20、40、90min吴茱萸次碱水浴提取率为80%、97%、101%。以上数据显示吴茱萸碱以及吴茱萸次碱水浴加热60min时能够完整提取。以上溶剂均为乙醇，水浴加热60min时进行样品提取。
2.5 精密度检验
先取1份吴茱萸对照溶液，试验色谱与上述相同，5次反复进样，观察得知吴茱萸碱、吴茱萸次碱平均峰面积为1 360 407μg/mL、533 273μg/mL，相对标准偏差为1.4%以及1.5%，结果表明仪器精密度良好[8]。
2.6 重复性试验
每份为200mg一共选取4份吴茱萸粉末，与溶液制备方式相同处理，在液相色谱仪中加入10μg溶液，在相同的色谱条件下，测得吴茱萸碱相对标准偏差为1.7%、吴茱萸次碱相对标准偏差分别为1.5%，结果表明方法的重复性良好[9]。
2.7 加样回收率检验
得到超微戊己丸粉末样品中吴茱萸碱以及吴茱萸次碱的含量后，继续选择5份粉末，精密加入各自量的100%到吴茱萸碱以及吴茱萸次碱当中，然后测定制备5份回收样品的含量，最终得到吴茱萸碱以及吴茱萸次碱的平均回收率分别为97.3%和101.4%，其相对标准偏差分别为3.2%和3.9%。 3 结果
含量测量结果：将在液相色谱仪中加入对照品溶液和供试品溶液各20μL，记录吴茱萸碱、吴茱萸次碱的色谱峰面积，计算最后结果。见表1。
表1 吴茱萸碱、吴茱萸次碱含量测量结果
批号 吴茱萸碱（mg/mL） 吴茱萸次碱（mg/mL）
011206 0.1759 0.2459
020110 0.1798 0.2577
020109 0.1837 0.2607
4 讨论
高效液相色谱法又可称为高压液相色谱，由于其操作便利，灵敏度高，分离效果好，当前已经成为众多领域尤其是中药领域当中最为重要的分离分析技术之一[10]。本研究戊己丸中的药材吴茱萸又称为茶辣、吴萸、米辣子、臭辣子树、漆辣子、左力纯幽子等，其来源于《本经》[11]，其中记载“主温中下气，止痛，咳逆寒热，除湿，血痹，逐风邪，开腠理。”本草纲目中则记载：“开郁化滞，治吞酸，厥阴痰涎头痛，阴毒腹痛，疝气血痢，喉舌口疮[12]。”，味道苦涩，对于患者能够祛寒止痛、抑制呕吐，同时阴虚火旺者不宜服用。临床主要应用在由阴浊上逆导致的头疼以及胃痛当中，同时对于肝胃虚寒也有较高的临床应用价值[13-14]。
本次测定首先确定了吴茱萸碱的最大吸收波长为225nm，当波长超过230nm时其吸收曲线呈现明显的下降，当波长高于240nm时候强吸收消失；与吴茱萸碱相比，吴茱萸次碱的最高吸收波长以及次强吸收波长分别为345nm以及215nm，当处于220～240nm时处于强吸收肩峰。由于本次要同时检测吴茱萸碱和吴茱萸次碱，因此必须兼顾两者的测定灵敏度，最终选择以225nm进行测定的标准波长。另外通过稳定性试验，发现样品溶液的温度应该设置在18～22℃中，放入容量瓶中妥善保存，在10d内能够基本保证稳定。从提取方式来看，将超微戊己丸碾磨至细粉状，再用超声法提取优于常规回流提取法，选择乙腈-乙腈10%（50∶50）作为流动相，分离效果较好。
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[8] 刘绍欢，吴亚丽，张召英，等.HPLC测不同产地吴茱萸中吴茱萸碱、吴茱萸次碱及吴茱萸内酯的含量[J].辽宁中医杂志，2012（11）：2254-2255.
[9] 周臻，盂繁姝，曹高.高效液相色谱法测定左金胃内滞留漂浮型缓释片中吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量[J].中医学报，2012（6）：711-714.
[10] 李荣东，史俊，蔡光先，等.HPLC测定超微与常规戊己丸盐酸小檗碱含量的比较[J].现代医药卫生，2010，26（22）：3374-3375.
[11] 李荣东，史俊，蔡光先，等.HPLC测定超微与常规戊己丸中芍药苷含量的比较[J].亚太传统医药，2010，6（8）：23-24.
[12] 史俊，李荣东，蔡光先，等.不同生产工艺的戊己丸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱含质量比较[J].抗感染药学，2010，7（3）：179-181.
[13] 王世永，李小定.吴茱萸中吴茱萸碱和次碱的提取及测定[J].湖北农业科学，2008，47（3）：340-342.
[14] 胡晓艳，陈乐，熊犇，等.HPLC法测定吴茱萸超微速溶饮片中吴茱萸碱、吴茱萸次碱及柠檬苦素的含量[J].中国医药科学，2013，3（1）：108-110.
（收稿日期：2014-04-26）