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摘 要：黄梁木是华南地区重要的速生用材树种，其快速的次生生长主要取决于包括形成层细胞在内的维管组织细胞的发育进程。为了精准获取维管组织形成层细胞与高质量RNA，该研究以黄梁木幼苗为材料，通过石蜡切片与激光显微切割（LMD）结合的方法，成功获得形成层、木质部和韧皮部细胞。结果表明：优化石蜡切片流程，以卡诺/丙酮作为固定剂（丙酮浓度10%～50%），100%正丁醇作为脱水剂和透明剂，之后经过梯度渗蜡、包埋、切片、脱蜡后可获得形态完整的组织切片且保证了组织细胞RNA的完整性。调试LMD参数，放大倍数为10×～20×;激光能量为42～44;切割孔径为4～13;切割速度为16～25;最终获得的这3种细胞的RNA完整性（RIN）均大于5.0，即形成层细胞RIN=5.0，韧皮部细胞RIN=6.6和木质部细胞RIN=7.9，满足后续RNA-seq分析。该研究通过优化石蜡切片和LMD参数，成功建立了黄梁木幼苗茎段维管组织细胞的激光显微切割技术体系，为进一步揭示林木树种维管组织分裂与分化的调控机制奠定基础。
关键词：黄梁木，激光显微切割（LMD），石蜡切片，维管组织，RNA完整性
中图分类号：Q944.5
文献标识码：A
文章编号：1000-3142（2021）08-1226-11
Abstract： Neolamarckia cadamba is one of the most important fast-growing trees for wood production in South China， and its secondary growth depends on the development process of vascular tissue cells including formative cells. In order to obtain the vascular tissue accurately and high quality RNA of N. cadamba， we presented an optimal method to provide high-quality paraffin section for vascular tissues， in which carnoy/acetone was used as fixative （acetone concentration was 10%-50%） and 100% n-Butanol was used as the dehydrating and infiltration agent， followed by gradient infiltration paraffin， embedding， sectioning and dewaxing. Meanwhile， LMD parameters were set with magnification between 10× and 20×， power between 42 and 44， aperture between 4 and 13 and speed between 16 and 25 for acquisition of vascular cells in N. cadamba. Utilizing this protocol， high quality of RNAs were extracted， with RIN （RNA integrity number） value of 5.0， 6.6 and 7.9 in cambium cells， phloem cells and xylem cells， respectively. These RNAs can be used for subsequent RNA-seq analysis. Accordingly， the vascular tissue cells capture system by LMD was established in N. cadamba， which would be of value for revealing the regulatory mechanism of vascular tissue division and differentiation in N. cadamba， and provide a reference for capturing vascular cell in other forest tree species.
Key words： Neolamarckia cadamba， laser microdissection （LMD）， paraffin section， vascular tissue， RNA integrity
维管组织由木质部和韧皮部组成，它们在初生生长期间从原形成层产生，在次生生长期间从形成层中不断产生（Campbell & Turner，2016）。维管系统延伸到整个植物体，提供机械支撑和资源运输（Zhu et al.，2019）。增殖的形成层细胞是分化木质部（木材）和韧皮部细胞的来源，形成层活性导致茎的增粗和生物量的增加（Elo et al.，2009）。因为大多数植物生物量由形成层产生，所以对形成层的获得和研究可望进一步了解林木树种的发育机制并进行生物量遗传改良。黄梁木（Neolamarckia cadamba）是一种大型落叶速生热带树种，分布在南亚和东南亚。在9 a内平均高度达到17 m，胸径25 cm（Zayed et al.，2014）。它也是胶合板工业、纸浆和纸张生产的最佳原材料之一。因为黄梁木具有快速增長的特点，所以在1972年的世界林业大会被称为“奇迹之树”（Ouyang et al.，2013）。目前对林木速生性状机理尚不清楚。如何获得高质量的维管组织特异细胞是了解林木发育机制的前提。因为韧皮部、形成层与木质部组织紧密相连，难以用肉眼精细分离这3种组织，所以需要寻找一种能够精确分离组织细胞的方法获得这3种不同类型的维管组织，为林木快速生长机理研究奠定基础。 激光显微切割技术（laser microdissection，LMD）是一种从异质细胞群中分离目标细胞的有效技术。在显微可视化下利用激光直接从组织切片获得感兴趣的细胞，用于随后对其DNA、RNA和蛋白质的研究（Gousset et al.，2019）。LMD技术最初是为动物组织开发的，但目前通过体系优化在植物应用也较多。LMD常与冷冻切片和石蜡切片相结合，收获的细胞可以提取DNA、RNA和蛋白质，用于分析来自各种细胞类型的基因组特征、基因表达和蛋白质谱。冷冻切片由于制片流程简单，可减少RNA损失并提高质量，其与LMD结合已成为一种分离植物细胞并用于RNA-seq分析的常用手段。利用该组合方式已成功分离柑橘表皮组织、挪威云杉韧皮部与木质部不同类型细胞、大麦胚乳细胞等，并获得适合高通量测序分析的高质量RNA（Matas et al.，2010; Blokhina et al.，2017;Brandt et al.，2018）。然而，冷冻切片因为难以稳定植物组织细胞中的液泡，以及冷冻、解冻可引起组织完整性的丧失，所以使得靶细胞的鉴定变得比较困难（Kerk et al.，2003; Nelson et al.，2006）。石蜡切片能更好地保留细胞结构，故与LMD结合被广泛应用于草本植物细胞材料分离，如玉米籽粒早期胚乳细胞、拟南芥胚胎表皮细胞、大麦谷粒胚乳传递细胞和珠心突起、水稻根部不同类型细胞等的分离（Kaspar et al.，2010;Shiono et al.，2014; Sakai et al.，2018; Zhang et al.，2018）。基于LMD植物组织RNA分离过程的困难一般是植物细胞细胞壁的存在，次生细胞壁的木质化，完全分化的细胞存在大的液泡以及大的细胞间隙（Nakazono et al.，2003; Jyske et al.，2015）。因此，需要保持收获的组织及细胞具有结构完整性和稳定的细胞内容物，这使得LMD应用于植物细胞，特别是木本植物成为挑战。目前，LMD结合石蜡切片应用在木本植物的相关报道较少，主要是木本植物的非木质化组织，例如柑橘珠心胚起始细胞、苹果芽分生组织等（贾慧慧，2016;Verma et al.，2019）。不同物种、同一物种不同组织的LMD体系存在一定的差别，主要体现在切片方式（冷冻切片或石蜡切片）及LMD参数上。因此，为了获得黄梁木3种不同类型的维管组织（形成层、韧皮部和木质部）及其高质量RNA供后续分析，需要在前人建立的不同植物LMD体系基础上进一步优化。
本研究主要从固定剂、脱水剂和透明剂等方面优化了黄梁木石蜡切片流程，对LMD的放大倍数、激光能量、切割孔径和切割速度等参数进行调试，以期获得黄梁木维管组织3种不同类型的细胞（形成层细胞、韧皮部细胞和木质部细胞）与高质量RNA，建立适合黄梁木维管组织的LMD体系，为后续进行3种不同类型细胞发育的转录组分析提供材料，也为进一步挖掘参与黄梁木维管组织发育的关键基因，探究林木树种速生性状和木材品质遗传改良奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
供试材料黄梁木种子采自华南农业大学校园内10年生黄梁木母树，成熟种子经无菌水浸泡，于120 r·min-1 的恒温摇床上40 ℃温育过夜，之后经75%乙醇中浸泡30 s进行表面灭菌，无菌水冲洗3次后用5%次氯酸钠浸泡15 min，无菌水中冲洗3次。将经过灭菌处理的种子在无菌滤纸上吸干，并植入MS基础培养基（Li et al.，2019）。40 d后可获得第一代小植株，选出其中1棵小植株接种于增殖培养基（MS+0.1 mg·L-1 NAA+1 mg·L-1 6-BA）培养，以获得遗传背景一致的植物作为实验材料。30 d后，切取无性扩繁的幼嫩侧芽（含茎段）接种于生根培养基（MS+0.1 mg·L-1 NAA），诱导生根，从而形成完整植株。经过炼苗处理后的植株移栽到浸润的泥炭土中。待苗高50 cm左右（约4个月），取其第二茎节作为后续实验材料。
1.2 石蜡切片
1.2.1 固定 取生长旺盛的黄梁木第2茎节，剪除叶片，用锋利的单面刀片切成2～3 mm的小茎段，单面刀片提前高压灭菌并用RNaseZap（购自Thermo Fisher Scientific公司）擦拭，去除RNases污染，立即投入含有固定液的15 mL RNA-free 离心管中，固定剂提前预冷备用。固定剂处理见表1。固定后，将每种处理取3个小茎段在通风橱风干10 min，放入1.5 mL RNA-free离心管，液氮速冻，进行磨样和RNA提取，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。
1.2.2 脱水 固定后，进行组织脱水处理。脱水剂选用乙醇和正丁醇。根据脱水剂不同所选择的脱水梯度、脱水温度以及脱水时间也不同（表2）。根据脱水效果来选用最优的脱水剂及脱水步骤。
1.2.3 透明 脱水后，进行组织透明处理。透明剂种类、透明梯度、透明温度以及透明时间如表3所示。透明后，将每种处理取3个小茎段在通风橱风干10 min，放入1.5 mL RNA-free离心管，液氮速冻，进行磨样和RNA提取，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。
1.2.4 渗蜡 渗蜡是石蜡逐步替代透明剂的过程，通过梯度处理和温度及时间控制，最终石蜡渗透整个组织，为石蜡包埋和后续切片奠定基础。渗蜡步骤如下：（1）透明剂与石蜡按照1∶1的比例（50%正丁醇/50%石蜡或50%异丙醇/50%石蜡）65 ℃处理1 h;（2）100%的纯蜡65 ℃处理1～1.5 h;（3）100%的纯蜡65 ℃处理2～2.5 h，2次。
1.2.5 包埋、切片与脱蜡 将含有样品的石蜡迅速倒入用牛皮纸折叠好的包埋盒内，牛皮纸提前高压灭菌且用RNaseZap擦拭，去除RNases污染;用干净且高温的镊子将样品在包埋盒里定位，待石蜡冷却凝固后，放入4 ℃冰箱保存。用单面刀片将包埋好的蜡块修成规整的矩形，粘在小木块上，上机切片，切片厚度14 μm。切片使用到的毛刷、镊子、刀片等均经过高压灭菌和RNaseZap擦拭，去除RNases污染;石蠟切片机，烤片机等先用70%乙醇灭菌，再用RNaseZap擦拭。切好的蜡带放在42 ℃ DEPC水（1%焦炭酸二乙酯）上伸展，用载玻片将蜡带从DEPC水中取出，平展在玻片上，并放在烤片机42 ℃烘烤，直到水分蒸发完全。将烘干后的组织玻片经过2次二甲苯脱蜡，每次10 min;脱蜡完成后，将组织玻片于通风橱中至二甲苯完全挥发，并进行形态学观察。 1.3 激光显微切割
使用Leica AS LMD 7000对靶细胞进行切割收集，在激光显微切割前用RNaseZap对承载玻片和收集管的载物台进行擦拭。对放大倍数（magnification）、激光能量（power）、切割速度（speed）、激光切割孔径（aperture）、脉冲频率（pulse frequency）和发射强度（head current）等参数进行调试，建立黄梁木幼苗茎段维管组织细胞最佳切割参数。
2 结果与分析
2.1 不同固定剂处理结果
固定剂的选择是目标产物获得的关键。本研究选择3种固定剂对材料进行固定处理，丙酮固定剂处理后的RNA凝胶电泳图见图1。由图1：A可知，RNA有28S、18S两条带且无杂带;而卡诺和FAA处理，RNA无带，RNA可能完全降解或该处理不能提取出RNA。由图1：B可知，丙酮固定剂处理后茎段组织形态，组织细胞皱缩严重，中间髓部向内凹陷;卡诺处理后边缘细胞稍微向内皱缩，细胞整体形态较好;FAA处理后，细胞形态与对照组相似。保证固定后组织细胞形态和RNA完整性，是石蜡切片最关键的步骤。因此，选择丙酮为固定剂，分别用70%乙醇和70%卡诺稀释丙酮，进行后续脱水和透明。
2.2 不同脱水、透明剂组合处理结果
脱水剂是与水能在任何比例下均匀混合的有机溶剂。由于有机溶剂用于交换植物组织中的水，化学脱水也可能损害LMD样品（Polster et al.，2006）。透明是脱水和浸蜡的桥梁，其作用是使透明剂置换组织中的脱水剂，透明剂是石蜡的溶媒，为后续浸蜡做准备。本研究分别用70%乙醇和70%卡诺稀释丙酮作为固定剂，乙醇/异丙醇和正丁醇作为2种脱水、透明剂，共4种组合处理（表4）。琼脂糖凝胶电泳图结果见图2。4种组合处理均得到较好质量的RNA。
将4种处理进行后续浸蜡、包埋、切片（14 μm）、漂片、烤片、脱蜡等步骤后，观察其显微结构。结果表明，以乙醇/异丙醇作为脱水、透明剂，细胞皱缩较严重，髓部出现空洞，且不能清晰识别维管束各细胞，严重影响后续激光显微切割目标细胞的识别与获取（图3：A，B）;以正丁醇作为脱水、透明剂，组织细胞相对完整，可清晰识别各细胞类型（图3：C，D）;其中乙醇/丙酮为固定剂时，髓部出现空洞，不能保证形态学完整 （图3：C）。
因此，选择以70%卡诺稀释丙酮作为固定剂，正丁醇作为脱水、透明剂能得到较好的成片效果，且脱水透明后RNA质量较好，达到激光显微切割上机前的要求。
2.3 卡诺/丙酮不同配比处理结果
为进一步确定卡诺稀释丙酮的最适浓度，建立黄梁木幼苗茎段石蜡切片体系，本研究分别用90%、80%、70%、60%、50%、40%的卡诺稀释丙酮，正丁醇脱水、透明后进行RNA提取及凝胶电泳（图4），石蜡包埋切片后进行显微结构观察（图5）。
凝胶电泳结果表明，被稀释后的丙酮（浓度10%～60%）作为固定剂，组织经过脱水、透明后均得到质量较好的RNA（图4）。由图5可知，当丙酮体积占比大于卡诺时，切片不完整，髓部出现空洞，细胞皱缩严重，不能清晰识别维管束各细胞。因此，丙酮浓度为10%～50%时，经正丁醇脱水、透明后提取RNA质量较好，石蜡切片后细胞形态完整，满足激光显微切割上机前的要求。
2.4 激光显微切割参数调试
根据切片厚度和收集的靶细胞不同，对应的激光参数有较大的改变。经过参数调试，摸索出适合黄梁木形成层、韧皮部和木质部的LMD最佳参数，结果见表5。图6展示了形成层、韧皮部和木质部切割前，切割路径和收集管盖中的细胞显微结构图，说明不同类型细胞切割参数不同，其中放大倍数、激光能量和切割孔径影响最大。特别是形成层细胞壁薄，需在更大物镜倍数下且严格控制激光能量完成切割。
用Rneasy Micro kit（Qiagen）提取微量RNA，用Agilent RNA 6000 Pico Kit檢测RNA的完整性（图7）。由图7可知，形成层RIN=5.0，韧皮部RIN=6.6，木质部RIN=7.9。RNA完整性指数 （RNA integrity number）高于5.0的适度降解样品仍能产生与基因表达谱相匹配的RNA（Romero et al.，2014）。因此，所建立的黄梁木幼苗茎段维管组织细胞激光显微切割体系得到的目标产物可用于RNA-seq。
3 讨论与结论
LMD不需要细胞壁的分解，允许从切片异质组织中分离单个细胞类型，因此特别适合植物加工。该方法允许精确分离少量细胞，可用于研究不同组织或细胞中的基因表达谱。该技术不需要通过任何类型的酶消化分离细胞，不需要细胞特异性报告基因，并且允许在切割前数月存储固定和包埋组织（Chavan et al.，2018）。根据感兴趣的植物组织性质，LMD的样品制备程序可能会有很大差异。基于LMD的RNA 分离的成功在很大程度上取决于该方法的上游部分，包括组织固定、脱水、浸蜡等（Gautam & Sarkar，2015）。为了尽量减少RNA的降解，在整个过程中尽可能缩短时间，并尽可能保持较低的温度是至关重要的（Santi，2019）。LMD的整个过程包括3个步骤：（1）样品处理;（2）显微切割程序;（3）DNA，RNA或蛋白质提取，测序后进行后续分析。
在进行LMD之前，样品处理是获得DNA，RNA或蛋白质良好产量和质量的关键步骤。对于样品处理要注意以下几点：（1）进行组织切片时，应使用特定试剂清洁所有表面和器械，以去除DNase和RNases。本实验所用到的特定清洁试剂为RNaseZap，可有效抑制RNases活性。（2）如果使用玻璃容器进行染色或脱蜡，则应在180 ℃下烘烤至少8 h（Santi，2019）。（3）固定是确保高质量RNA产量的最关键步骤。真空是一个必要的步骤，以促进固定剂在组织中的渗透;固定剂的体积应至少为样品体积的五倍（Santi，2019）。（4）完全脱蜡是DNA和RNA提取的必要条件。由于石蜡的去除不充分，可能降低产率。在显微切割程序过程中还应注意以下几点：（1）LMD程序不应超过1.5 h，更长的时间会导致目标分子的产率降低（Aguilar-Bravo & Sancho-Bru，2019）。（2）当显微切割的细胞移出收集平台时，要非常小心地进行，如果收集管帽受到碰撞，样品可能会丢失。（3）样品聚焦不当不仅会干扰靶细胞的准确识别，还会妨碍切割过程中激光束聚焦，使靶细胞不能成功捕获。（4）在低放大率下，激光不够强大，甚至不够精确，而高放大率（例如40×）显著减慢了收集效率。因此，需要对目标组织或细胞进行激光参数调试，不同物种不同组织对应的切割参数不同。（5）可以将含有LMD组织的多个管合并提取RNA，但应在-80 ℃的裂解液中稳定≤1个月（Chavan et al.，2018）。 特别注意的是，固定是确保获得高质量产量的最关键步骤，这取决于固定剂的选择、渗透时间的长短、温度和组织大小。材料的固定一方面是使细胞的新陈代谢瞬时停止，保持组织或细胞形态结构的完整性;另一方面稳定细胞内容物及组织中核酸和蛋白质的稳定性（Chavan et al.，2018）。固定剂还能达到使组织变硬从而便于切片，令细胞易于着色的目的，同时具有防腐作用等。然而，固定这个过程会致命地损害用于分析小分子的LMD样品。因为低分子代谢物可溶于固定的化学试剂中，所以它们可能会在该过程中发生离域并丢失（Schad et al.，2005; Schneider & Hoelscher，2007;Li et al.，2012）。由于普遍存在的RNA酶和蛋白酶，固定剂穿透组织所用的时间越长，RNA或蛋白质降解的可能性就越大。福尔马林（FAA）可以较好地保持细胞形态，已被广泛用于组织固定。然而，分子的完整性可能受核酸和蛋白质交联反应的影响（Aguilar-Bravo & Sancho-Bru，2019）。渗透和固定方法的选择应该是保持组织细节和细胞内容物最大恢复之间的平衡。Kerk et al.（2003）比较了植物组织沉淀和交联固定方法对来自几个物种的不同细胞和组织类型中的RNA回收影响。然而，用沉淀固定剂乙醇-乙酸处理的组织中回收到的RNA比用交联固定剂甲醛-乙酸-乙醇（FAA）处理的细胞中回收到的RNA多2至3倍。这表明大部分细胞RNA通过FAA处理进行交联或以其他方式可阻碍提取。以卡诺为固定剂的组织细胞大多含有中央大液泡，组织含水量高等特点，例如玉米胚乳细胞、拟南芥胚胎表皮细胞、葡萄叶韧皮部细胞等（Sakai et al.，2018;Zhang et al.，2018; Santi，2019）。分生组织细胞排列紧密，细胞体积小，细胞壁薄，细胞质较浓，没有中央大液泡，适用于丙酮急剧脱水和渗透处理。以丙酮作为固定剂的主要是植物分生组织，例如苹果芽分生组织、玉米茎尖分生组织（Verma et al.，2019;Gautam et al.，2019）。本文使用丙酮、卡诺（乙醇∶冰乙酸=3∶1，V/V）、FAA（甲醛∶冰乙酸∶70%乙醇=5∶5∶90，V/V/V） 3种固定剂对材料进行处理，根据RNA提取和琼脂糖凝胶电泳结果，只有丙酮作为固定剂得到了较好质量的RNA。卡诺和FAA均无条带，RNA完全降解或处理后的材料不易提取出RNA。由于丙酮对组织的脱水性和穿透性较强，经过100%丙酮处理后的组织细胞皱缩严重，破坏了组织完整性，影响后续LMD可视化，以及对靶细胞的识别。因此，需要对丙酮加以稀释，经过乙醇和卡诺稀释后的丙酮作为固定剂均得到较好质量的RNA。乙醇也是强力脱水剂，可以快速替换出组织中的水分，直接用100%乙醇处理也会使细胞骤然失水发生皱缩。因此，用100%乙醇稀释丙酮，在相同处理下，卡诺稀释丙酮会得到更好的形态组织。
关于脱水与透明剂的选择，正丁醇能与水、乙醇和二甲苯等溶剂混合，是石蜡的溶媒，兼有脱水和透明的作用。相比乙醇梯度脱水和异丙醇再置换出脱水剂，步骤简单，节约了处理时间。Zhang et al.（2018）研究发现玉米粒可以在100%正丁醇中，4 ℃储存长达9个月而不会损失组织完整性或RNA质量。同时，在65 ℃下进行脱水、透明，高温促进了试剂更快渗入组织，可为下一步浸蜡做好预热处理。
LMD精确分离靶细胞，可用于后续高通量数据采集和生物信息学分析。目前基因表达分析通常通过基于微阵列或下一代测序（NGS）技术的全基因组表达谱（全基因组测序、靶向基因组测序、RNA测序和核糖体图谱分析）进行。LMD与NGS技术的结合是研究细胞和组织特异性过程的有效方法（Abbott et al.，2010;Jyske et al.，2015）。此外，除了转录组学和蛋白质组学研究外，代谢物分析正在成为表征特异组织（主要是在植物中）的重要过程（Yi et al.，2012;Fang & Schneider，2014;李胜男等，2020）。目前，对于木本植物维管形成层发生，维管细胞分裂与分化的调控机制有了一定的研究进展（Elo et al.，2009;Campbell & Turner，2016），而LMD应用于木本植物维管组织细胞的研究，可望进一步揭示植物生长发育的调控机制。
本文通过优化石蜡切片流程，调试LMD参数，建立了黄梁木幼苗莖段维管组织细胞的激光显微切割技术体系，分别获得形成层、韧皮部和木质部细胞并得到高质量RNA，满足后续RNA-seq分析。该技术保留了足够的视觉效果识别感兴趣的特定组织或细胞，同时从获得的靶细胞中最大限度回收到RNA，为LMD结合石蜡切片在其他木本植物上的应用提供了技术参考。
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（責任编辑 何永艳）
关键词：黄梁木，激光显微切割（LMD），石蜡切片，维管组织，RNA完整性
中图分类号：Q944.5
文献标识码：A
文章编号：1000-3142（2021）08-1226-11
Abstract： Neolamarckia cadamba is one of the most important fast-growing trees for wood production in South China， and its secondary growth depends on the development process of vascular tissue cells including formative cells. In order to obtain the vascular tissue accurately and high quality RNA of N. cadamba， we presented an optimal method to provide high-quality paraffin section for vascular tissues， in which carnoy/acetone was used as fixative （acetone concentration was 10%-50%） and 100% n-Butanol was used as the dehydrating and infiltration agent， followed by gradient infiltration paraffin， embedding， sectioning and dewaxing. Meanwhile， LMD parameters were set with magnification between 10× and 20×， power between 42 and 44， aperture between 4 and 13 and speed between 16 and 25 for acquisition of vascular cells in N. cadamba. Utilizing this protocol， high quality of RNAs were extracted， with RIN （RNA integrity number） value of 5.0， 6.6 and 7.9 in cambium cells， phloem cells and xylem cells， respectively. These RNAs can be used for subsequent RNA-seq analysis. Accordingly， the vascular tissue cells capture system by LMD was established in N. cadamba， which would be of value for revealing the regulatory mechanism of vascular tissue division and differentiation in N. cadamba， and provide a reference for capturing vascular cell in other forest tree species.
Key words： Neolamarckia cadamba， laser microdissection （LMD）， paraffin section， vascular tissue， RNA integrity
维管组织由木质部和韧皮部组成，它们在初生生长期间从原形成层产生，在次生生长期间从形成层中不断产生（Campbell & Turner，2016）。维管系统延伸到整个植物体，提供机械支撑和资源运输（Zhu et al.，2019）。增殖的形成层细胞是分化木质部（木材）和韧皮部细胞的来源，形成层活性导致茎的增粗和生物量的增加（Elo et al.，2009）。因为大多数植物生物量由形成层产生，所以对形成层的获得和研究可望进一步了解林木树种的发育机制并进行生物量遗传改良。黄梁木（Neolamarckia cadamba）是一种大型落叶速生热带树种，分布在南亚和东南亚。在9 a内平均高度达到17 m，胸径25 cm（Zayed et al.，2014）。它也是胶合板工业、纸浆和纸张生产的最佳原材料之一。因为黄梁木具有快速增長的特点，所以在1972年的世界林业大会被称为“奇迹之树”（Ouyang et al.，2013）。目前对林木速生性状机理尚不清楚。如何获得高质量的维管组织特异细胞是了解林木发育机制的前提。因为韧皮部、形成层与木质部组织紧密相连，难以用肉眼精细分离这3种组织，所以需要寻找一种能够精确分离组织细胞的方法获得这3种不同类型的维管组织，为林木快速生长机理研究奠定基础。 激光显微切割技术（laser microdissection，LMD）是一种从异质细胞群中分离目标细胞的有效技术。在显微可视化下利用激光直接从组织切片获得感兴趣的细胞，用于随后对其DNA、RNA和蛋白质的研究（Gousset et al.，2019）。LMD技术最初是为动物组织开发的，但目前通过体系优化在植物应用也较多。LMD常与冷冻切片和石蜡切片相结合，收获的细胞可以提取DNA、RNA和蛋白质，用于分析来自各种细胞类型的基因组特征、基因表达和蛋白质谱。冷冻切片由于制片流程简单，可减少RNA损失并提高质量，其与LMD结合已成为一种分离植物细胞并用于RNA-seq分析的常用手段。利用该组合方式已成功分离柑橘表皮组织、挪威云杉韧皮部与木质部不同类型细胞、大麦胚乳细胞等，并获得适合高通量测序分析的高质量RNA（Matas et al.，2010; Blokhina et al.，2017;Brandt et al.，2018）。然而，冷冻切片因为难以稳定植物组织细胞中的液泡，以及冷冻、解冻可引起组织完整性的丧失，所以使得靶细胞的鉴定变得比较困难（Kerk et al.，2003; Nelson et al.，2006）。石蜡切片能更好地保留细胞结构，故与LMD结合被广泛应用于草本植物细胞材料分离，如玉米籽粒早期胚乳细胞、拟南芥胚胎表皮细胞、大麦谷粒胚乳传递细胞和珠心突起、水稻根部不同类型细胞等的分离（Kaspar et al.，2010;Shiono et al.，2014; Sakai et al.，2018; Zhang et al.，2018）。基于LMD植物组织RNA分离过程的困难一般是植物细胞细胞壁的存在，次生细胞壁的木质化，完全分化的细胞存在大的液泡以及大的细胞间隙（Nakazono et al.，2003; Jyske et al.，2015）。因此，需要保持收获的组织及细胞具有结构完整性和稳定的细胞内容物，这使得LMD应用于植物细胞，特别是木本植物成为挑战。目前，LMD结合石蜡切片应用在木本植物的相关报道较少，主要是木本植物的非木质化组织，例如柑橘珠心胚起始细胞、苹果芽分生组织等（贾慧慧，2016;Verma et al.，2019）。不同物种、同一物种不同组织的LMD体系存在一定的差别，主要体现在切片方式（冷冻切片或石蜡切片）及LMD参数上。因此，为了获得黄梁木3种不同类型的维管组织（形成层、韧皮部和木质部）及其高质量RNA供后续分析，需要在前人建立的不同植物LMD体系基础上进一步优化。
本研究主要从固定剂、脱水剂和透明剂等方面优化了黄梁木石蜡切片流程，对LMD的放大倍数、激光能量、切割孔径和切割速度等参数进行调试，以期获得黄梁木维管组织3种不同类型的细胞（形成层细胞、韧皮部细胞和木质部细胞）与高质量RNA，建立适合黄梁木维管组织的LMD体系，为后续进行3种不同类型细胞发育的转录组分析提供材料，也为进一步挖掘参与黄梁木维管组织发育的关键基因，探究林木树种速生性状和木材品质遗传改良奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
供试材料黄梁木种子采自华南农业大学校园内10年生黄梁木母树，成熟种子经无菌水浸泡，于120 r·min-1 的恒温摇床上40 ℃温育过夜，之后经75%乙醇中浸泡30 s进行表面灭菌，无菌水冲洗3次后用5%次氯酸钠浸泡15 min，无菌水中冲洗3次。将经过灭菌处理的种子在无菌滤纸上吸干，并植入MS基础培养基（Li et al.，2019）。40 d后可获得第一代小植株，选出其中1棵小植株接种于增殖培养基（MS+0.1 mg·L-1 NAA+1 mg·L-1 6-BA）培养，以获得遗传背景一致的植物作为实验材料。30 d后，切取无性扩繁的幼嫩侧芽（含茎段）接种于生根培养基（MS+0.1 mg·L-1 NAA），诱导生根，从而形成完整植株。经过炼苗处理后的植株移栽到浸润的泥炭土中。待苗高50 cm左右（约4个月），取其第二茎节作为后续实验材料。
1.2 石蜡切片
1.2.1 固定 取生长旺盛的黄梁木第2茎节，剪除叶片，用锋利的单面刀片切成2～3 mm的小茎段，单面刀片提前高压灭菌并用RNaseZap（购自Thermo Fisher Scientific公司）擦拭，去除RNases污染，立即投入含有固定液的15 mL RNA-free 离心管中，固定剂提前预冷备用。固定剂处理见表1。固定后，将每种处理取3个小茎段在通风橱风干10 min，放入1.5 mL RNA-free离心管，液氮速冻，进行磨样和RNA提取，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。
1.2.2 脱水 固定后，进行组织脱水处理。脱水剂选用乙醇和正丁醇。根据脱水剂不同所选择的脱水梯度、脱水温度以及脱水时间也不同（表2）。根据脱水效果来选用最优的脱水剂及脱水步骤。
1.2.3 透明 脱水后，进行组织透明处理。透明剂种类、透明梯度、透明温度以及透明时间如表3所示。透明后，将每种处理取3个小茎段在通风橱风干10 min，放入1.5 mL RNA-free离心管，液氮速冻，进行磨样和RNA提取，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。
1.2.4 渗蜡 渗蜡是石蜡逐步替代透明剂的过程，通过梯度处理和温度及时间控制，最终石蜡渗透整个组织，为石蜡包埋和后续切片奠定基础。渗蜡步骤如下：（1）透明剂与石蜡按照1∶1的比例（50%正丁醇/50%石蜡或50%异丙醇/50%石蜡）65 ℃处理1 h;（2）100%的纯蜡65 ℃处理1～1.5 h;（3）100%的纯蜡65 ℃处理2～2.5 h，2次。
1.2.5 包埋、切片与脱蜡 将含有样品的石蜡迅速倒入用牛皮纸折叠好的包埋盒内，牛皮纸提前高压灭菌且用RNaseZap擦拭，去除RNases污染;用干净且高温的镊子将样品在包埋盒里定位，待石蜡冷却凝固后，放入4 ℃冰箱保存。用单面刀片将包埋好的蜡块修成规整的矩形，粘在小木块上，上机切片，切片厚度14 μm。切片使用到的毛刷、镊子、刀片等均经过高压灭菌和RNaseZap擦拭，去除RNases污染;石蠟切片机，烤片机等先用70%乙醇灭菌，再用RNaseZap擦拭。切好的蜡带放在42 ℃ DEPC水（1%焦炭酸二乙酯）上伸展，用载玻片将蜡带从DEPC水中取出，平展在玻片上，并放在烤片机42 ℃烘烤，直到水分蒸发完全。将烘干后的组织玻片经过2次二甲苯脱蜡，每次10 min;脱蜡完成后，将组织玻片于通风橱中至二甲苯完全挥发，并进行形态学观察。 1.3 激光显微切割
使用Leica AS LMD 7000对靶细胞进行切割收集，在激光显微切割前用RNaseZap对承载玻片和收集管的载物台进行擦拭。对放大倍数（magnification）、激光能量（power）、切割速度（speed）、激光切割孔径（aperture）、脉冲频率（pulse frequency）和发射强度（head current）等参数进行调试，建立黄梁木幼苗茎段维管组织细胞最佳切割参数。
2 结果与分析
2.1 不同固定剂处理结果
固定剂的选择是目标产物获得的关键。本研究选择3种固定剂对材料进行固定处理，丙酮固定剂处理后的RNA凝胶电泳图见图1。由图1：A可知，RNA有28S、18S两条带且无杂带;而卡诺和FAA处理，RNA无带，RNA可能完全降解或该处理不能提取出RNA。由图1：B可知，丙酮固定剂处理后茎段组织形态，组织细胞皱缩严重，中间髓部向内凹陷;卡诺处理后边缘细胞稍微向内皱缩，细胞整体形态较好;FAA处理后，细胞形态与对照组相似。保证固定后组织细胞形态和RNA完整性，是石蜡切片最关键的步骤。因此，选择丙酮为固定剂，分别用70%乙醇和70%卡诺稀释丙酮，进行后续脱水和透明。
2.2 不同脱水、透明剂组合处理结果
脱水剂是与水能在任何比例下均匀混合的有机溶剂。由于有机溶剂用于交换植物组织中的水，化学脱水也可能损害LMD样品（Polster et al.，2006）。透明是脱水和浸蜡的桥梁，其作用是使透明剂置换组织中的脱水剂，透明剂是石蜡的溶媒，为后续浸蜡做准备。本研究分别用70%乙醇和70%卡诺稀释丙酮作为固定剂，乙醇/异丙醇和正丁醇作为2种脱水、透明剂，共4种组合处理（表4）。琼脂糖凝胶电泳图结果见图2。4种组合处理均得到较好质量的RNA。
将4种处理进行后续浸蜡、包埋、切片（14 μm）、漂片、烤片、脱蜡等步骤后，观察其显微结构。结果表明，以乙醇/异丙醇作为脱水、透明剂，细胞皱缩较严重，髓部出现空洞，且不能清晰识别维管束各细胞，严重影响后续激光显微切割目标细胞的识别与获取（图3：A，B）;以正丁醇作为脱水、透明剂，组织细胞相对完整，可清晰识别各细胞类型（图3：C，D）;其中乙醇/丙酮为固定剂时，髓部出现空洞，不能保证形态学完整 （图3：C）。
因此，选择以70%卡诺稀释丙酮作为固定剂，正丁醇作为脱水、透明剂能得到较好的成片效果，且脱水透明后RNA质量较好，达到激光显微切割上机前的要求。
2.3 卡诺/丙酮不同配比处理结果
为进一步确定卡诺稀释丙酮的最适浓度，建立黄梁木幼苗茎段石蜡切片体系，本研究分别用90%、80%、70%、60%、50%、40%的卡诺稀释丙酮，正丁醇脱水、透明后进行RNA提取及凝胶电泳（图4），石蜡包埋切片后进行显微结构观察（图5）。
凝胶电泳结果表明，被稀释后的丙酮（浓度10%～60%）作为固定剂，组织经过脱水、透明后均得到质量较好的RNA（图4）。由图5可知，当丙酮体积占比大于卡诺时，切片不完整，髓部出现空洞，细胞皱缩严重，不能清晰识别维管束各细胞。因此，丙酮浓度为10%～50%时，经正丁醇脱水、透明后提取RNA质量较好，石蜡切片后细胞形态完整，满足激光显微切割上机前的要求。
2.4 激光显微切割参数调试
根据切片厚度和收集的靶细胞不同，对应的激光参数有较大的改变。经过参数调试，摸索出适合黄梁木形成层、韧皮部和木质部的LMD最佳参数，结果见表5。图6展示了形成层、韧皮部和木质部切割前，切割路径和收集管盖中的细胞显微结构图，说明不同类型细胞切割参数不同，其中放大倍数、激光能量和切割孔径影响最大。特别是形成层细胞壁薄，需在更大物镜倍数下且严格控制激光能量完成切割。
用Rneasy Micro kit（Qiagen）提取微量RNA，用Agilent RNA 6000 Pico Kit檢测RNA的完整性（图7）。由图7可知，形成层RIN=5.0，韧皮部RIN=6.6，木质部RIN=7.9。RNA完整性指数 （RNA integrity number）高于5.0的适度降解样品仍能产生与基因表达谱相匹配的RNA（Romero et al.，2014）。因此，所建立的黄梁木幼苗茎段维管组织细胞激光显微切割体系得到的目标产物可用于RNA-seq。
3 讨论与结论
LMD不需要细胞壁的分解，允许从切片异质组织中分离单个细胞类型，因此特别适合植物加工。该方法允许精确分离少量细胞，可用于研究不同组织或细胞中的基因表达谱。该技术不需要通过任何类型的酶消化分离细胞，不需要细胞特异性报告基因，并且允许在切割前数月存储固定和包埋组织（Chavan et al.，2018）。根据感兴趣的植物组织性质，LMD的样品制备程序可能会有很大差异。基于LMD的RNA 分离的成功在很大程度上取决于该方法的上游部分，包括组织固定、脱水、浸蜡等（Gautam & Sarkar，2015）。为了尽量减少RNA的降解，在整个过程中尽可能缩短时间，并尽可能保持较低的温度是至关重要的（Santi，2019）。LMD的整个过程包括3个步骤：（1）样品处理;（2）显微切割程序;（3）DNA，RNA或蛋白质提取，测序后进行后续分析。
在进行LMD之前，样品处理是获得DNA，RNA或蛋白质良好产量和质量的关键步骤。对于样品处理要注意以下几点：（1）进行组织切片时，应使用特定试剂清洁所有表面和器械，以去除DNase和RNases。本实验所用到的特定清洁试剂为RNaseZap，可有效抑制RNases活性。（2）如果使用玻璃容器进行染色或脱蜡，则应在180 ℃下烘烤至少8 h（Santi，2019）。（3）固定是确保高质量RNA产量的最关键步骤。真空是一个必要的步骤，以促进固定剂在组织中的渗透;固定剂的体积应至少为样品体积的五倍（Santi，2019）。（4）完全脱蜡是DNA和RNA提取的必要条件。由于石蜡的去除不充分，可能降低产率。在显微切割程序过程中还应注意以下几点：（1）LMD程序不应超过1.5 h，更长的时间会导致目标分子的产率降低（Aguilar-Bravo & Sancho-Bru，2019）。（2）当显微切割的细胞移出收集平台时，要非常小心地进行，如果收集管帽受到碰撞，样品可能会丢失。（3）样品聚焦不当不仅会干扰靶细胞的准确识别，还会妨碍切割过程中激光束聚焦，使靶细胞不能成功捕获。（4）在低放大率下，激光不够强大，甚至不够精确，而高放大率（例如40×）显著减慢了收集效率。因此，需要对目标组织或细胞进行激光参数调试，不同物种不同组织对应的切割参数不同。（5）可以将含有LMD组织的多个管合并提取RNA，但应在-80 ℃的裂解液中稳定≤1个月（Chavan et al.，2018）。 特别注意的是，固定是确保获得高质量产量的最关键步骤，这取决于固定剂的选择、渗透时间的长短、温度和组织大小。材料的固定一方面是使细胞的新陈代谢瞬时停止，保持组织或细胞形态结构的完整性;另一方面稳定细胞内容物及组织中核酸和蛋白质的稳定性（Chavan et al.，2018）。固定剂还能达到使组织变硬从而便于切片，令细胞易于着色的目的，同时具有防腐作用等。然而，固定这个过程会致命地损害用于分析小分子的LMD样品。因为低分子代谢物可溶于固定的化学试剂中，所以它们可能会在该过程中发生离域并丢失（Schad et al.，2005; Schneider & Hoelscher，2007;Li et al.，2012）。由于普遍存在的RNA酶和蛋白酶，固定剂穿透组织所用的时间越长，RNA或蛋白质降解的可能性就越大。福尔马林（FAA）可以较好地保持细胞形态，已被广泛用于组织固定。然而，分子的完整性可能受核酸和蛋白质交联反应的影响（Aguilar-Bravo & Sancho-Bru，2019）。渗透和固定方法的选择应该是保持组织细节和细胞内容物最大恢复之间的平衡。Kerk et al.（2003）比较了植物组织沉淀和交联固定方法对来自几个物种的不同细胞和组织类型中的RNA回收影响。然而，用沉淀固定剂乙醇-乙酸处理的组织中回收到的RNA比用交联固定剂甲醛-乙酸-乙醇（FAA）处理的细胞中回收到的RNA多2至3倍。这表明大部分细胞RNA通过FAA处理进行交联或以其他方式可阻碍提取。以卡诺为固定剂的组织细胞大多含有中央大液泡，组织含水量高等特点，例如玉米胚乳细胞、拟南芥胚胎表皮细胞、葡萄叶韧皮部细胞等（Sakai et al.，2018;Zhang et al.，2018; Santi，2019）。分生组织细胞排列紧密，细胞体积小，细胞壁薄，细胞质较浓，没有中央大液泡，适用于丙酮急剧脱水和渗透处理。以丙酮作为固定剂的主要是植物分生组织，例如苹果芽分生组织、玉米茎尖分生组织（Verma et al.，2019;Gautam et al.，2019）。本文使用丙酮、卡诺（乙醇∶冰乙酸=3∶1，V/V）、FAA（甲醛∶冰乙酸∶70%乙醇=5∶5∶90，V/V/V） 3种固定剂对材料进行处理，根据RNA提取和琼脂糖凝胶电泳结果，只有丙酮作为固定剂得到了较好质量的RNA。卡诺和FAA均无条带，RNA完全降解或处理后的材料不易提取出RNA。由于丙酮对组织的脱水性和穿透性较强，经过100%丙酮处理后的组织细胞皱缩严重，破坏了组织完整性，影响后续LMD可视化，以及对靶细胞的识别。因此，需要对丙酮加以稀释，经过乙醇和卡诺稀释后的丙酮作为固定剂均得到较好质量的RNA。乙醇也是强力脱水剂，可以快速替换出组织中的水分，直接用100%乙醇处理也会使细胞骤然失水发生皱缩。因此，用100%乙醇稀释丙酮，在相同处理下，卡诺稀释丙酮会得到更好的形态组织。
关于脱水与透明剂的选择，正丁醇能与水、乙醇和二甲苯等溶剂混合，是石蜡的溶媒，兼有脱水和透明的作用。相比乙醇梯度脱水和异丙醇再置换出脱水剂，步骤简单，节约了处理时间。Zhang et al.（2018）研究发现玉米粒可以在100%正丁醇中，4 ℃储存长达9个月而不会损失组织完整性或RNA质量。同时，在65 ℃下进行脱水、透明，高温促进了试剂更快渗入组织，可为下一步浸蜡做好预热处理。
LMD精确分离靶细胞，可用于后续高通量数据采集和生物信息学分析。目前基因表达分析通常通过基于微阵列或下一代测序（NGS）技术的全基因组表达谱（全基因组测序、靶向基因组测序、RNA测序和核糖体图谱分析）进行。LMD与NGS技术的结合是研究细胞和组织特异性过程的有效方法（Abbott et al.，2010;Jyske et al.，2015）。此外，除了转录组学和蛋白质组学研究外，代谢物分析正在成为表征特异组织（主要是在植物中）的重要过程（Yi et al.，2012;Fang & Schneider，2014;李胜男等，2020）。目前，对于木本植物维管形成层发生，维管细胞分裂与分化的调控机制有了一定的研究进展（Elo et al.，2009;Campbell & Turner，2016），而LMD应用于木本植物维管组织细胞的研究，可望进一步揭示植物生长发育的调控机制。
本文通过优化石蜡切片流程，调试LMD参数，建立了黄梁木幼苗莖段维管组织细胞的激光显微切割技术体系，分别获得形成层、韧皮部和木质部细胞并得到高质量RNA，满足后续RNA-seq分析。该技术保留了足够的视觉效果识别感兴趣的特定组织或细胞，同时从获得的靶细胞中最大限度回收到RNA，为LMD结合石蜡切片在其他木本植物上的应用提供了技术参考。
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（責任编辑 何永艳）