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[摘 要：凯氏定氮法测定动物性食品蛋白质含量是动物性食品理化检验学实验教学中的一项重要的实验内容。改进和优化凯氏定氮法的操作方法对准确检测动物性食品蛋白质含量具有重要意义。本文针对凯氏定氮法的一些关键操作环节进行了改进和优化，以期为提高动物性食品理化检验学的教学效果奠定基础。
关键词：凯氏定氮法；蛋白质；动物性食品理化检验学]
凯氏定氮法由丹麦化学家凯道尔于1883年创立。该方法是国际上众多检测蛋白质含量，如染料法、双缩脲法、酚试剂法等方法的首选。是动物性食品理化检验学实验教学的一项重要实验内容。凯氏定氮法整个测定步骤包括消化、蒸馏、吸收和滴定等过程。检测过程中可能造成蛋白质测定结果出现偏差的因素有很多。本文对凯氏定氮法能影响蛋白质测定结果的关键步骤进行了优化，以期为动物性食品理化检验学的实验教学奠定基础。
1凯氏定氮法的原理
凯氏定氮法其理论基础是蛋白质的含氮量通常占其总质量的16%，通过测定含氮量从而推算出样品中总蛋白质含量的方法，其整个检测过程可以分为消化、蒸馏和吸收、滴定三个步骤，即在有催化剂的条件下，消化过程中浓硫酸将样品中的有机氮转变成无机铵盐，然后在碱性条件下发生蒸馏反应将铵盐转化为氨气，氨气随水蒸气蒸馏出来并被硼酸溶液吸收，再以标准盐酸滴定，从而计算出样品中含氮量，最后由含氮量计算蛋白质含量。
2凯氏定氮法检测蛋白质操作的优化
2.1消化反应
2.1.1待测样品和浓硫酸的比例优化
消化反应中使用浓硫酸使样品中的有机质氧化成二氧化碳、水和氨气。氨气与硫酸结合生成硫酸铵。如果待测样品和浓硫酸的体积比不恰当，一方面会导致消化时间延长，使蛋白质检测不能在课堂限定的时间内完成，如果浓硫酸过多还会加重环境负担。以牛奶蛋白质检测为例，我们通过开展预实验，以牛奶和浓硫酸体积比分别为0.42∶5、0.5∶5、0.59∶5检测牛奶蛋白质得率，实验结果以0.5∶5的蛋白质得率最佳，而且该条件下消化所需的时间适当。所以，建议教师通过预实验得出不同动物性食品待测样品和浓硫酸的最佳比例，在本科生开始实验时可以有的放矢，以避免待测样品和浓硫酸比例不恰当而造成的不良影响。
2.1.2浓硫酸和催化剂的比例优化
消化过程中需要加入催化剂硫酸钾和硫酸铜。其中硫酸钾能与浓硫酸反应生成硫酸氢钾而提高消化液温度和沸点，从而加快有机物分解；而硫酸铜不但可以加速有机物氧化分解，还可以作为消化反应完全的指示剂。如果浓硫酸与硫酸钾的比例偏小，除了导致消化体系温度升高过高，还能引起已生成的铵盐发生分解而使实验结果出现误差。而如果浓硫酸与硫酸铜的比例偏小则会导致消化时间过长，除了使实验不能在限定时间内完成，还会造成资源浪费及环境污染。因此，在实验课上需要给本科生强调合适的催化剂与浓硫酸比例对检测蛋白质有重要影响。
2.1.3消化溫度优化
消化过程中的温度对蛋白质测定结果的影响容易被实验人员忽略，实验课堂上要重点给本科生强调消化温度调控的重要性。消化要先保持小火加热，使凯氏烧瓶内的消化液体不爆沸，避免消化液喷溅到凯氏烧瓶颈部。待消化液完全均匀沸腾后再加大火力，直至消化液由黑色变为黄绿色进而呈现蓝绿色透明为止。通过对消化温度的控制，能避免消化液中氮的损失。我们在本科生实验课前以牛奶蛋白质检测为例，先小火加热，之后在大火加热阶段将温度分别设定为260℃、280℃和300℃，测定蛋白质得率。检测结果以280℃条件下牛奶蛋白质得率最佳。可见，消化过程中不仅要控制消化温度，还存在针对不同样品的最佳消化温度，应该在实验中对学生进行强调以引起重视。
2.2蒸馏和吸收反应优化
蒸馏反应过程中消化液中硫酸铵与氢氧化钠反应生成氨气，如果出现氨气漏气的情况就会导致蛋白质测定结果偏差。实验中要重点对学生强调以下几个操作：①蒸馏装置要严格控制气密性，连接蒸馏装置时一定要将蒸汽发生瓶、蒸馏反应管以及冷凝管之间的橡皮管连接紧密，时刻注意连接处有无松动；②冷凝管的下端是氨气的导出口，要先插入到硼酸吸收液的液面之下，才能通蒸汽；③蒸汽发生瓶内要加几滴硫酸和几滴甲基红指示剂，使指示剂呈现粉色以指示溶液保持酸性；④蒸馏反应管加样入口处要用水封闭，防止氨气泄漏；⑤蒸馏反应结束后要先将冷凝管下端离开硼酸吸收液面，再继续蒸馏1分钟，将附着在冷凝管下端的吸收液也完全洗入硼酸吸收液内，再移走硼酸溶液，最后停止通蒸汽。
2.3滴定反应优化
滴定反应中盐酸标准溶液与硼酸铵反应生成硼酸和硫化铵，通过加入混合指示剂指示酸性的滴定终点。滴定反应中可以使用的混合指示剂有甲基红和溴甲酚绿，还可使用甲基红和亚甲基蓝。使用甲基红和溴甲酚绿时，其颜色变化一般为由绿色变为灰绿直至变成暗红。使用甲基红和亚甲基蓝作为混合指示剂时，其颜色变化一般为由绿色变为灰蓝直至变成紫红。在实验操作中本科生的操作可能会出现指示剂的颜色并没有完全变为暗红或紫红时就停止滴定的情况，或是已经变为暗红或紫红又继续滴加盐酸的情况，这样均会导致蛋白质测定结果的偏差。
参考文献
[1]费丽娜.浅谈凯氏定氮法测定食品中蛋白质的原理及注意事项[J].中国药物经济学，2014（1）：171-172.
[2]熊慧敏，黄培林，马毛弟，等.消化过程中的火力控制对奶粉蛋白质测定的影响[J].医学动物防制，2007（10）：736-737.
[3]张泽泉，罗翠婷，李孔寿，等.凯氏定氮法蛋白质测定的改进探讨[J].海峡预防医学杂志，2017（1）：64-66.
作者简介
韩杰（1978—），女，讲师，博士，主要从事动物性食品理化检验学课程的教学工作。
基金项目：沈阳农业大学教育教学研究项目（2018-12）；辽宁省教育科学“十三五”规划课题（JG17DB440）
关键词：凯氏定氮法；蛋白质；动物性食品理化检验学]
凯氏定氮法由丹麦化学家凯道尔于1883年创立。该方法是国际上众多检测蛋白质含量，如染料法、双缩脲法、酚试剂法等方法的首选。是动物性食品理化检验学实验教学的一项重要实验内容。凯氏定氮法整个测定步骤包括消化、蒸馏、吸收和滴定等过程。检测过程中可能造成蛋白质测定结果出现偏差的因素有很多。本文对凯氏定氮法能影响蛋白质测定结果的关键步骤进行了优化，以期为动物性食品理化检验学的实验教学奠定基础。
1凯氏定氮法的原理
凯氏定氮法其理论基础是蛋白质的含氮量通常占其总质量的16%，通过测定含氮量从而推算出样品中总蛋白质含量的方法，其整个检测过程可以分为消化、蒸馏和吸收、滴定三个步骤，即在有催化剂的条件下，消化过程中浓硫酸将样品中的有机氮转变成无机铵盐，然后在碱性条件下发生蒸馏反应将铵盐转化为氨气，氨气随水蒸气蒸馏出来并被硼酸溶液吸收，再以标准盐酸滴定，从而计算出样品中含氮量，最后由含氮量计算蛋白质含量。
2凯氏定氮法检测蛋白质操作的优化
2.1消化反应
2.1.1待测样品和浓硫酸的比例优化
消化反应中使用浓硫酸使样品中的有机质氧化成二氧化碳、水和氨气。氨气与硫酸结合生成硫酸铵。如果待测样品和浓硫酸的体积比不恰当，一方面会导致消化时间延长，使蛋白质检测不能在课堂限定的时间内完成，如果浓硫酸过多还会加重环境负担。以牛奶蛋白质检测为例，我们通过开展预实验，以牛奶和浓硫酸体积比分别为0.42∶5、0.5∶5、0.59∶5检测牛奶蛋白质得率，实验结果以0.5∶5的蛋白质得率最佳，而且该条件下消化所需的时间适当。所以，建议教师通过预实验得出不同动物性食品待测样品和浓硫酸的最佳比例，在本科生开始实验时可以有的放矢，以避免待测样品和浓硫酸比例不恰当而造成的不良影响。
2.1.2浓硫酸和催化剂的比例优化
消化过程中需要加入催化剂硫酸钾和硫酸铜。其中硫酸钾能与浓硫酸反应生成硫酸氢钾而提高消化液温度和沸点，从而加快有机物分解；而硫酸铜不但可以加速有机物氧化分解，还可以作为消化反应完全的指示剂。如果浓硫酸与硫酸钾的比例偏小，除了导致消化体系温度升高过高，还能引起已生成的铵盐发生分解而使实验结果出现误差。而如果浓硫酸与硫酸铜的比例偏小则会导致消化时间过长，除了使实验不能在限定时间内完成，还会造成资源浪费及环境污染。因此，在实验课上需要给本科生强调合适的催化剂与浓硫酸比例对检测蛋白质有重要影响。
2.1.3消化溫度优化
消化过程中的温度对蛋白质测定结果的影响容易被实验人员忽略，实验课堂上要重点给本科生强调消化温度调控的重要性。消化要先保持小火加热，使凯氏烧瓶内的消化液体不爆沸，避免消化液喷溅到凯氏烧瓶颈部。待消化液完全均匀沸腾后再加大火力，直至消化液由黑色变为黄绿色进而呈现蓝绿色透明为止。通过对消化温度的控制，能避免消化液中氮的损失。我们在本科生实验课前以牛奶蛋白质检测为例，先小火加热，之后在大火加热阶段将温度分别设定为260℃、280℃和300℃，测定蛋白质得率。检测结果以280℃条件下牛奶蛋白质得率最佳。可见，消化过程中不仅要控制消化温度，还存在针对不同样品的最佳消化温度，应该在实验中对学生进行强调以引起重视。
2.2蒸馏和吸收反应优化
蒸馏反应过程中消化液中硫酸铵与氢氧化钠反应生成氨气，如果出现氨气漏气的情况就会导致蛋白质测定结果偏差。实验中要重点对学生强调以下几个操作：①蒸馏装置要严格控制气密性，连接蒸馏装置时一定要将蒸汽发生瓶、蒸馏反应管以及冷凝管之间的橡皮管连接紧密，时刻注意连接处有无松动；②冷凝管的下端是氨气的导出口，要先插入到硼酸吸收液的液面之下，才能通蒸汽；③蒸汽发生瓶内要加几滴硫酸和几滴甲基红指示剂，使指示剂呈现粉色以指示溶液保持酸性；④蒸馏反应管加样入口处要用水封闭，防止氨气泄漏；⑤蒸馏反应结束后要先将冷凝管下端离开硼酸吸收液面，再继续蒸馏1分钟，将附着在冷凝管下端的吸收液也完全洗入硼酸吸收液内，再移走硼酸溶液，最后停止通蒸汽。
2.3滴定反应优化
滴定反应中盐酸标准溶液与硼酸铵反应生成硼酸和硫化铵，通过加入混合指示剂指示酸性的滴定终点。滴定反应中可以使用的混合指示剂有甲基红和溴甲酚绿，还可使用甲基红和亚甲基蓝。使用甲基红和溴甲酚绿时，其颜色变化一般为由绿色变为灰绿直至变成暗红。使用甲基红和亚甲基蓝作为混合指示剂时，其颜色变化一般为由绿色变为灰蓝直至变成紫红。在实验操作中本科生的操作可能会出现指示剂的颜色并没有完全变为暗红或紫红时就停止滴定的情况，或是已经变为暗红或紫红又继续滴加盐酸的情况，这样均会导致蛋白质测定结果的偏差。
参考文献
[1]费丽娜.浅谈凯氏定氮法测定食品中蛋白质的原理及注意事项[J].中国药物经济学，2014（1）：171-172.
[2]熊慧敏，黄培林，马毛弟，等.消化过程中的火力控制对奶粉蛋白质测定的影响[J].医学动物防制，2007（10）：736-737.
[3]张泽泉，罗翠婷，李孔寿，等.凯氏定氮法蛋白质测定的改进探讨[J].海峡预防医学杂志，2017（1）：64-66.
作者简介
韩杰（1978—），女，讲师，博士，主要从事动物性食品理化检验学课程的教学工作。
基金项目：沈阳农业大学教育教学研究项目（2018-12）；辽宁省教育科学“十三五”规划课题（JG17DB440）