【摘 要】
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目的 构建靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (glypican-3,GPC3)的慢病毒载体,并进行慢病毒载体的鉴定、包装及病毒滴度测定.方法 设计靶向GPC3抗原的嵌合性抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)分子重组基因及特异性引物,用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)对CAR分子重组基因进行体外扩增及PCR反应片段搭桥,双酶切后定向插入到pCDH质粒,构建pCDH-anti-GPC3-CAR慢病毒表达载体,经菌落PCR、DNA凝胶电泳及测序
【机 构】
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100069 首都医科大学附属北京佑安医院肿瘤科
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目的 构建靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (glypican-3,GPC3)的慢病毒载体,并进行慢病毒载体的鉴定、包装及病毒滴度测定.方法 设计靶向GPC3抗原的嵌合性抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)分子重组基因及特异性引物,用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)对CAR分子重组基因进行体外扩增及PCR反应片段搭桥,双酶切后定向插入到pCDH质粒,构建pCDH-anti-GPC3-CAR慢病毒表达载体,经菌落PCR、DNA凝胶电泳及测序鉴定.将目的 质粒与包装质粒共转染293T细胞,收集上清液按不同比例稀释后感染293T细胞,流式细胞术检测anti-GPC3-CAR表达并计算病毒滴度.结果 经菌落PCR及测序证实,正确构建重组慢病毒载体pCDH-anti-GPC3-CAR,包装后的病毒滴度为(1.50～3.24)×106 TU/ml.结论 本研究成功构建携带不同共刺激分子的pCDH-anti-GPC3-CAR慢病毒表达载体,可在293T细胞中表达并产毒,为后续构建CAR免疫细胞提供技术储备.
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