【摘 要】
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目的 以嗜肺军团菌感染HDAC6基因沉默的RAW264.7细胞为研究对象，检测自噬流及自噬相关因子表达水平的变化，探究HDAC6在嗜肺军团菌干扰巨噬细胞自噬中的作用机制。方法 利用RNAi技术介导基因沉默，构建shRNAHDAC6细胞，Western blot验证沉默效果。用嗜肺军团菌活菌和灭活菌[感染复数（MOI）=50]分别感染RAW264.7、sh-NC、shRNA-HDAC6细胞6、12、
【机 构】
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宁夏医科大学基础医学院病原生物学与医学免疫学系
【基金项目】
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国家自然科学基金（82060362）；
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目的 以嗜肺军团菌感染HDAC6基因沉默的RAW264.7细胞为研究对象，检测自噬流及自噬相关因子表达水平的变化，探究HDAC6在嗜肺军团菌干扰巨噬细胞自噬中的作用机制。方法 利用RNAi技术介导基因沉默，构建shRNAHDAC6细胞，Western blot验证沉默效果。用嗜肺军团菌活菌和灭活菌[感染复数（MOI）=50]分别感染RAW264.7、sh-NC、shRNA-HDAC6细胞6、12、24 h。应用自噬双标质粒pmCherry-C1-EGFP-LC3B检测巨噬细胞自噬流的变化；透射电镜观察嗜肺军团菌感染24 h后各组细胞内的自噬小体和自噬溶酶体；实时荧光定量PCR及Western blot法检测AMBRA1、ATG9B、P62、Beclin1、α-tubulin、LC3B的表达水平。结果 与RAW264.7对照组相比，shRNA-HDAC6细胞的HDAC6蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；自噬双标质粒检测自噬流结果显示，嗜肺军团菌活菌及灭活菌感染RAW264.7细胞，自噬流均减弱，沉默HDAC6后嗜肺军团菌感染巨噬细胞自噬流增加。透射电镜可观察到嗜肺军团菌感染巨噬细胞24 h各组的自噬小体及自噬溶酶体。实时荧光定量PCR及Western blot检测结果显示，与RAW264.7对照组相比，嗜肺军团菌感染RAW264.7细胞后，ATG9B、α-tubulin、P62的表达水平均明显增加（P＜0.05）,LC3B、Beclin1和AMBRA1的表达水平均明显下调（P＜0.05）；与shRNA-HDAC6对照组相比，嗜肺军团菌感染shRNA-HDAC6细胞后，α-tubulin的表达水平明显下降（P＜0.05）。结论 嗜肺军团菌可抑制巨噬细胞的自噬，沉默HDAC6后嗜肺军团菌对巨噬细胞自噬的抑制作用减弱，自噬流增加，提示嗜肺军团菌可能通过与HDAC6相互作用而影响微管蛋白乙酰化及细胞应激等，进而干扰巨噬细胞的自噬。
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