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摘要 从贵州威宁等地采集马铃薯病叶样本，采用试管捕捉反转录PCR（tubecaptureRTPCR， TCRTPCR）的方法克隆出714 bp的PVX CP基因，编码237个氨基酸残基。系统进化分析表明，PVX CP基因可分为两大类群，推测分离物属于X3株系，并建议重型花叶也可作为PVX病叶样本。
关键词 马铃薯X病毒；外壳蛋白；基因克隆；进化分析
中图分类号 S188 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）27-09283-03
Cloning and Phylogenetic Analysis of Potato Virus X CP Gene
HUANG Yonghui1，2， ZHU Ying1，2， LIU Yongxiang1，2
（1.Guizhou Institute of Biotechnology， Guiyang， Guizhou 550006； 2.Guizhou Key Lab for Agricultural Biotechnology， Guiyang， Guizhou 550006）
Abstract Potato leaves with PVX infection symptoms were collected from Guizhou Province including Weining County. A PVX CP gene of 714bp encoding 237 amino acid residues was cloned with the tube capture RTPCR （TCRTPCR） method. Phylogenic analysis revealed that PVX CP genes can be divided into two groups， and the isolate was estimated to be X3 strain. Furthermore， We suggested that severe mosaic leaves could also be samples for PVX gene cloning.
Key words Potato virus X （PVX）； Coat protein （CP）； Gene cloning； Phylogenetic analysis
马铃薯X病毒（Potato virus X，PVX）是Potexvirus属病毒，在全世界马铃薯种植区域都有发生，通常造成15%的减产，而与其他病毒复合侵染则会造成致命损害。 根据栽培马铃薯对植物抗病基因Nb、Nx 和 Rx的不同反应，PVX 通常可以划分为X1、X2、X3和X4 4个株系。X1株系在Nb或Nx存在时引起超敏反应， X2株系只在Nb存在时引起超敏反应，X3株系只在Nx存在时引起超敏反应，X4株系在Nb和Nx存在时均无反应，但不能侵染携带Rx基因的植株[1-2]。
PVX基因组有5个开放阅读框，外壳蛋白由ORF5编码，其主要功能定义为在病毒结构中为病毒基因核苷酸提供包被，保护了病毒基因组信息流失。外壳蛋白在病毒感染植株的传播中具有重要作用，包括长距离微管运输和细胞间的移动[3]。而且，外壳蛋白可能参与病毒生活史中其他阶段的活动，如病毒复制、介体传播以及沉默抑制[4-5]。
笔者以克隆并测序的PVX CP基因序列为原始数据，检索GenBank数据库中已知PVX CP基因序列，借助生物信息学软件对这些序列进行同源比对和系统树构建，对PVX CP基因系统进化关系与分组进行探讨，为PVX病毒控制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病毒样本。从贵州省农业科学院试验地、贵州威宁县和瓮安县田间采集花叶症状的马铃薯病叶，保存于-70 ℃冰箱中。阴性对照无毒苗由贵州省马铃薯工程中心提供。
1.1.2 主要试剂与菌株。MMLV反转录酶、RNase抑制剂、Taq酶、T4 DNA连接酶和pMD18T质粒购自大连宝生物公司，DTT 溶液和琼脂糖购自上海生工生物工程有限公司，Xgal 和IPTG 购自MBI 公司，胶回收试剂盒和DNA Marker购自Tiangen 公司，所有化学试剂均为国产分析纯。大肠杆菌DH5a由贵州省农业生物技术重点实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 引物设计。
参照Genbank中已登录的PVX CP基因序列，利用Primer premier 5.0设计合成扩增PVX CP基因的一对引物（PVXf： 5′GAATGTCAGCACCAGCTAGCAC3′和PVXr：5′GCTTATGGTGGTGGGAGAGTGAC3′），由北京三博远志生物有限公司合成。
1.2.2 TCRTPCR方法扩增PVX CP基因。参照邱又彬等[6]的方法。
1.2.3 克隆连接与测序。
采用Tiangen胶回收试剂盒纯化700 bp左右的PCR产物，将其与pMD18T连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂布在含有氨苄青霉素 （50 mg/ml） 抗性的LB固体培养基平板上培养后挑取阳性克隆，将阳性克隆菌液送北京诺塞基因有限公司测序。 1.2.4 序列分析。
从Genbank下载的PVX CP基因与该研究测序获得的序列用DNAMAN软件分析并保存，然后用Clustal X 比对并用Mega 4.0 软件[7]建树，步差值为1 000，用Kimura两参数法估计遗传距离。
2 结果与分析
2.1 鉴定结果 共采集到63份病叶样本，18份来自贵州省农业科学院试验大棚与试验田中，28份来自于威宁县，17份来自瓮安县。以设计合成的特异性引物PVXf 和 PVXr进行TCRTPCR扩增PVX CP全序列， 结果表明，来自威宁县小山乡的一份样本中克隆得到1个目的片段。PCR产物约700 bp，通过胶回收纯化后连接pMD18T 载体并测序，得到此产物为714 bp，编码237个氨基酸残基。核苷酸序列和由此推导的氨基酸序列见图1。根据来源与编号将克隆出PVX CP的样本分离物命名为XSH2。
除来自英国的X88781、 X88782与X88785 有744个碱基对，AF 172559、M31541和其他几个分离物只有711个碱基对外，其他所有PVX CP 基因都含有714个碱基对，编码237个氨基酸残基。 XSH2与GenBank中其他PVX分离物的CP核苷酸序列同源性在78.6% ～ 98.8% ，氨基酸序列同源性在86.9% ～100%。 由图2可知，PVX CP 基因划分为一大一小2个群组。 群组I聚集了45个来自世界不同地域的分离物，群组II聚集了来自南美的8个分离物和来自英国的4个分离物。包括XSH2 在内的来自我国的分离物分散到群组I中的各个亚组中，但相互之间进化距离都很近。据世界粮农组织的数据显示，马铃薯起源于南美，然后被引入欧洲、北美和前苏联的一些国家种植，但其在亚洲、非洲和拉丁美洲的生产和需求自1990年以来迅速增长。PVX CP基因的系统进化树揭示出由于马铃薯在全世界的传播种植，在马铃薯传播的同时，以块茎进行无性繁殖的特性也导致了病毒病在全球范围内的广泛传播。
从表1与图2可以看出，XSH2 CP与X3株系的来自荷兰的D00344具有100%的氨基酸同源性，在系统进化上距离也很近，因此可以推测分离物XSH2属于X3株系[8]。 姚东校等[9]研究表明在贵州威宁分离得到的另一个PVX分离物属于X3株系，说明同一地域的马铃薯具有共同的引种来源， 因此其携带的病毒同源性很高，变异度很小。
3 结论与讨论
PVX感染所引起的症状取决于PVX株系和马铃薯品种， 一般情况下是肉眼观察不到的，所以也被称为潜隐病毒。幼嫩植株感染初期可见的症状主要是轻微的花叶症状，但此症状会随着温度的上升而变得不明显， 16～20 ℃的多云天气有利于症状的形成。 目前关于PVX病叶样品采集尚无统一标准，一般以轻型花叶为主。PVX感染症状的多变性使得病叶样本的采集实施较困难。该研究共采集了63份病叶样本，主要症状依据是轻型花叶，但只有一个样本成功检测和克隆得到了PVX CP，意外的是这个样本恰好表现严重花叶症状。 据现有报道，运用血清学方法检测贵州马铃薯发现PVX发生率较低，不到10%[9-10]，因此如果想得到PVX分离物，选择适合的病叶样本很重要。该研究发现重型花叶症状的病叶也可用于PVX的分离与基因克隆，杜志游等[11]研究表明，在湖南零星种植的地区一株表现重型花叶的马铃薯上获得PVX分离物， 推测可能是因为PVX与马铃薯Y病毒 （Potato virus Y， PVY） 等经常共同侵染从而表现严重症状。
病毒株系的鉴定是控制病毒的基础工作。PVX的分类依赖于病毒对于抗性基因Nb、Nx 和 Rx的反应。研究表明PVX CP基因对于病毒-寄主互作非常重要，CP基因中的第121和127个密码子揭示了马铃薯抗性突破 （resistancebreaking） 的主要决定因子[12]，即PVX CP基因在PVX株系分类中发挥重要作用，因此通过获得CP基因序列进行病毒鉴定，是一种常见的手段。该研究对分离自贵州的PVX CP进行了序列测定与进化分析，推测其属于X3株系，有助于生产实践中对PVX开展针对性防控，对PVX病叶样本采集也提出了建议，认为重型花叶也可以考虑作为PVX分离物的样本。
参考文献
[1]
COCKERHAM G.Strains of potato virus X[C]//Proceedings of the Second Conference of Potato Virus Disease.LisseWageningen，1954：89-92.
[2] COCKERHAM G.Genetical studies on resistance to potato virus X and Y[J].Heredity，1970，25：309-348.
[3] FEDORKIN O N， SOLOVYEV A G， YELINA N E，et al.Cell-to-cell movement of potato virus X involves distinct functions of the coat protein[J].J Gen Virol，2001，82：449-458.
[4] THOMAS C L， LEH V， LEDERER C，et al.Turnip crinkle virus coat protein mediates suppression of RNA silencing in Nicotiana benthamiana[J].Virology，2003，306：33-41. [5] QU F， REN T，MORRIS T J.The coat protein of turnip crinkle virus suppresses posttranscriptional gene silencing at an early initiation step[J].J Virol， 2003， 77（1）：511-522.
[6] 邱又彬，陶刚，黄永会，等.TCRT—PCR技术在马铃薯病毒检测及其基因克隆上的应用[J].西南农业学报，2009， 22（2）：329-331.
[7] TAMURA K， DUDLEY J， NEI M，et al.MEGA4：Molecular Evolutionary Genetics Analysis （MEGA） software version 4.0[J].Mol Biol Evol， 2007， 24：1596-1599.
[8] HUISMAN M J， LINTHORST H J M， BOL J F，et al.The complete nucleotide sequence of Potato virus X and its homologies at the amino acid level with various plusstranded RNA viruses[J].J Gen Virol，1988， 69：1789-1798.
[9] 姚东校，洪鲲 杨立昌，等.马铃薯X病毒贵州分离物的分子鉴定[J].广东农业科学，2013（13）：139-141.
[10] 颜谦，黄萍，宋吉轩，等.贵州不同海拔地区马铃薯病毒病初步调查及检测鉴定[J].安徽农业科学，2009，37（29）：14262-14263.
[11] 杜志游，陈集双.马铃薯x病毒湖南分离物的鉴定与分组研究[J].中国病毒学，2003，18（2）：119-123.
[12] GOULDEN M， KOHM B， CRUZ S S，et al.A feature of the coat protein of potato virus X affects both induced virus resistance in potato and viral fitness[J].Virology， 1993， 197：293-302.
关键词 马铃薯X病毒；外壳蛋白；基因克隆；进化分析
中图分类号 S188 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）27-09283-03
Cloning and Phylogenetic Analysis of Potato Virus X CP Gene
HUANG Yonghui1，2， ZHU Ying1，2， LIU Yongxiang1，2
（1.Guizhou Institute of Biotechnology， Guiyang， Guizhou 550006； 2.Guizhou Key Lab for Agricultural Biotechnology， Guiyang， Guizhou 550006）
Abstract Potato leaves with PVX infection symptoms were collected from Guizhou Province including Weining County. A PVX CP gene of 714bp encoding 237 amino acid residues was cloned with the tube capture RTPCR （TCRTPCR） method. Phylogenic analysis revealed that PVX CP genes can be divided into two groups， and the isolate was estimated to be X3 strain. Furthermore， We suggested that severe mosaic leaves could also be samples for PVX gene cloning.
Key words Potato virus X （PVX）； Coat protein （CP）； Gene cloning； Phylogenetic analysis
马铃薯X病毒（Potato virus X，PVX）是Potexvirus属病毒，在全世界马铃薯种植区域都有发生，通常造成15%的减产，而与其他病毒复合侵染则会造成致命损害。 根据栽培马铃薯对植物抗病基因Nb、Nx 和 Rx的不同反应，PVX 通常可以划分为X1、X2、X3和X4 4个株系。X1株系在Nb或Nx存在时引起超敏反应， X2株系只在Nb存在时引起超敏反应，X3株系只在Nx存在时引起超敏反应，X4株系在Nb和Nx存在时均无反应，但不能侵染携带Rx基因的植株[1-2]。
PVX基因组有5个开放阅读框，外壳蛋白由ORF5编码，其主要功能定义为在病毒结构中为病毒基因核苷酸提供包被，保护了病毒基因组信息流失。外壳蛋白在病毒感染植株的传播中具有重要作用，包括长距离微管运输和细胞间的移动[3]。而且，外壳蛋白可能参与病毒生活史中其他阶段的活动，如病毒复制、介体传播以及沉默抑制[4-5]。
笔者以克隆并测序的PVX CP基因序列为原始数据，检索GenBank数据库中已知PVX CP基因序列，借助生物信息学软件对这些序列进行同源比对和系统树构建，对PVX CP基因系统进化关系与分组进行探讨，为PVX病毒控制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病毒样本。从贵州省农业科学院试验地、贵州威宁县和瓮安县田间采集花叶症状的马铃薯病叶，保存于-70 ℃冰箱中。阴性对照无毒苗由贵州省马铃薯工程中心提供。
1.1.2 主要试剂与菌株。MMLV反转录酶、RNase抑制剂、Taq酶、T4 DNA连接酶和pMD18T质粒购自大连宝生物公司，DTT 溶液和琼脂糖购自上海生工生物工程有限公司，Xgal 和IPTG 购自MBI 公司，胶回收试剂盒和DNA Marker购自Tiangen 公司，所有化学试剂均为国产分析纯。大肠杆菌DH5a由贵州省农业生物技术重点实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 引物设计。
参照Genbank中已登录的PVX CP基因序列，利用Primer premier 5.0设计合成扩增PVX CP基因的一对引物（PVXf： 5′GAATGTCAGCACCAGCTAGCAC3′和PVXr：5′GCTTATGGTGGTGGGAGAGTGAC3′），由北京三博远志生物有限公司合成。
1.2.2 TCRTPCR方法扩增PVX CP基因。参照邱又彬等[6]的方法。
1.2.3 克隆连接与测序。
采用Tiangen胶回收试剂盒纯化700 bp左右的PCR产物，将其与pMD18T连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂布在含有氨苄青霉素 （50 mg/ml） 抗性的LB固体培养基平板上培养后挑取阳性克隆，将阳性克隆菌液送北京诺塞基因有限公司测序。 1.2.4 序列分析。
从Genbank下载的PVX CP基因与该研究测序获得的序列用DNAMAN软件分析并保存，然后用Clustal X 比对并用Mega 4.0 软件[7]建树，步差值为1 000，用Kimura两参数法估计遗传距离。
2 结果与分析
2.1 鉴定结果 共采集到63份病叶样本，18份来自贵州省农业科学院试验大棚与试验田中，28份来自于威宁县，17份来自瓮安县。以设计合成的特异性引物PVXf 和 PVXr进行TCRTPCR扩增PVX CP全序列， 结果表明，来自威宁县小山乡的一份样本中克隆得到1个目的片段。PCR产物约700 bp，通过胶回收纯化后连接pMD18T 载体并测序，得到此产物为714 bp，编码237个氨基酸残基。核苷酸序列和由此推导的氨基酸序列见图1。根据来源与编号将克隆出PVX CP的样本分离物命名为XSH2。
除来自英国的X88781、 X88782与X88785 有744个碱基对，AF 172559、M31541和其他几个分离物只有711个碱基对外，其他所有PVX CP 基因都含有714个碱基对，编码237个氨基酸残基。 XSH2与GenBank中其他PVX分离物的CP核苷酸序列同源性在78.6% ～ 98.8% ，氨基酸序列同源性在86.9% ～100%。 由图2可知，PVX CP 基因划分为一大一小2个群组。 群组I聚集了45个来自世界不同地域的分离物，群组II聚集了来自南美的8个分离物和来自英国的4个分离物。包括XSH2 在内的来自我国的分离物分散到群组I中的各个亚组中，但相互之间进化距离都很近。据世界粮农组织的数据显示，马铃薯起源于南美，然后被引入欧洲、北美和前苏联的一些国家种植，但其在亚洲、非洲和拉丁美洲的生产和需求自1990年以来迅速增长。PVX CP基因的系统进化树揭示出由于马铃薯在全世界的传播种植，在马铃薯传播的同时，以块茎进行无性繁殖的特性也导致了病毒病在全球范围内的广泛传播。
从表1与图2可以看出，XSH2 CP与X3株系的来自荷兰的D00344具有100%的氨基酸同源性，在系统进化上距离也很近，因此可以推测分离物XSH2属于X3株系[8]。 姚东校等[9]研究表明在贵州威宁分离得到的另一个PVX分离物属于X3株系，说明同一地域的马铃薯具有共同的引种来源， 因此其携带的病毒同源性很高，变异度很小。
3 结论与讨论
PVX感染所引起的症状取决于PVX株系和马铃薯品种， 一般情况下是肉眼观察不到的，所以也被称为潜隐病毒。幼嫩植株感染初期可见的症状主要是轻微的花叶症状，但此症状会随着温度的上升而变得不明显， 16～20 ℃的多云天气有利于症状的形成。 目前关于PVX病叶样品采集尚无统一标准，一般以轻型花叶为主。PVX感染症状的多变性使得病叶样本的采集实施较困难。该研究共采集了63份病叶样本，主要症状依据是轻型花叶，但只有一个样本成功检测和克隆得到了PVX CP，意外的是这个样本恰好表现严重花叶症状。 据现有报道，运用血清学方法检测贵州马铃薯发现PVX发生率较低，不到10%[9-10]，因此如果想得到PVX分离物，选择适合的病叶样本很重要。该研究发现重型花叶症状的病叶也可用于PVX的分离与基因克隆，杜志游等[11]研究表明，在湖南零星种植的地区一株表现重型花叶的马铃薯上获得PVX分离物， 推测可能是因为PVX与马铃薯Y病毒 （Potato virus Y， PVY） 等经常共同侵染从而表现严重症状。
病毒株系的鉴定是控制病毒的基础工作。PVX的分类依赖于病毒对于抗性基因Nb、Nx 和 Rx的反应。研究表明PVX CP基因对于病毒-寄主互作非常重要，CP基因中的第121和127个密码子揭示了马铃薯抗性突破 （resistancebreaking） 的主要决定因子[12]，即PVX CP基因在PVX株系分类中发挥重要作用，因此通过获得CP基因序列进行病毒鉴定，是一种常见的手段。该研究对分离自贵州的PVX CP进行了序列测定与进化分析，推测其属于X3株系，有助于生产实践中对PVX开展针对性防控，对PVX病叶样本采集也提出了建议，认为重型花叶也可以考虑作为PVX分离物的样本。
参考文献
[1]
COCKERHAM G.Strains of potato virus X[C]//Proceedings of the Second Conference of Potato Virus Disease.LisseWageningen，1954：89-92.
[2] COCKERHAM G.Genetical studies on resistance to potato virus X and Y[J].Heredity，1970，25：309-348.
[3] FEDORKIN O N， SOLOVYEV A G， YELINA N E，et al.Cell-to-cell movement of potato virus X involves distinct functions of the coat protein[J].J Gen Virol，2001，82：449-458.
[4] THOMAS C L， LEH V， LEDERER C，et al.Turnip crinkle virus coat protein mediates suppression of RNA silencing in Nicotiana benthamiana[J].Virology，2003，306：33-41. [5] QU F， REN T，MORRIS T J.The coat protein of turnip crinkle virus suppresses posttranscriptional gene silencing at an early initiation step[J].J Virol， 2003， 77（1）：511-522.
[6] 邱又彬，陶刚，黄永会，等.TCRT—PCR技术在马铃薯病毒检测及其基因克隆上的应用[J].西南农业学报，2009， 22（2）：329-331.
[7] TAMURA K， DUDLEY J， NEI M，et al.MEGA4：Molecular Evolutionary Genetics Analysis （MEGA） software version 4.0[J].Mol Biol Evol， 2007， 24：1596-1599.
[8] HUISMAN M J， LINTHORST H J M， BOL J F，et al.The complete nucleotide sequence of Potato virus X and its homologies at the amino acid level with various plusstranded RNA viruses[J].J Gen Virol，1988， 69：1789-1798.
[9] 姚东校，洪鲲 杨立昌，等.马铃薯X病毒贵州分离物的分子鉴定[J].广东农业科学，2013（13）：139-141.
[10] 颜谦，黄萍，宋吉轩，等.贵州不同海拔地区马铃薯病毒病初步调查及检测鉴定[J].安徽农业科学，2009，37（29）：14262-14263.
[11] 杜志游，陈集双.马铃薯x病毒湖南分离物的鉴定与分组研究[J].中国病毒学，2003，18（2）：119-123.
[12] GOULDEN M， KOHM B， CRUZ S S，et al.A feature of the coat protein of potato virus X affects both induced virus resistance in potato and viral fitness[J].Virology， 1993， 197：293-302.