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摘要 利用60对分布于玉米10条染色体上的引物，对新科910及其父母本进行SSR分析。从中筛选出15对条带清晰、重复性好的引物，用于构建新科910指纹图谱，并将其数字化，计算出出现相同指纹图谱的概率为4.44×10-16，概率极低，说明以这15对引物构建的新科910指纹图谱鉴定其真实性是可行的。这15对引物分别是phi96100y1、umc2105k3、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg161k8、phi299852y2、umc2160k3、umc1125y3、bnlg240k1、umc2084w2、umc1231k4、phi041y6、umc1432y6、umc2163w3。其中，umc1705w1、bnlg2305k4、umc1432y6、umc2084w2、phi041y6、umc2163w3这6对引物可用来鉴定新科910纯度。任选1对引物umc2084w2用来检测新科910的纯度，结果为97.30%，与预期结果（97%）基本相符。因此，用这6对引物来鉴定新科910纯度是可行的、结果是可信的。
关键词 玉米;新科910;SSR;指纹图谱;纯度
Abstract We used 60 pairs of primers which distribute on the 10 chromosomes of maize for the SSR analysis of the maize hybrid Xinke 910 and its parents.15 pairs of primers were selected which were clear and good repeatability of their electrophoresis strip to construct the fingerprint of Xinke 910. And we digitized the fingerprint of Xinke 910 to calculate the probability of the same fingerprint，which was 4.44×10-16 and this probability was very low.This explains that it is feasible to identify the authenticity of Xinke910 by the fingerprint which is constructed by the 15 pairs of primers.The 15 pairs of primers were phi96100y1，umc2105k3，bnlg2291k4，umc1705w1，bnlg2305k4，bnlg161k8，phi299852y2，umc2160k3，umc1125y3，bnlg240k1，umc2084w2，umc1231k4，phi041y6，umc1432y6，umc2163w3. There were 6 pairs of primers can be used to identify the purity of Xinke 910 which were umc1705w1，bnlg2305k4，umc1432y6，umc2084w2，phi041y6 and umc2163w3.Among them， we selected 1 pair of primer arbitrary， which was umc2084w2 to identify the purity of Xinke 910，the result was 97.30%， which fit the expected results（97%） basically. Therefore， it was feasible and the results were credible to identify the purity of Xinke 910 by the 6 pairs of primers.
Key words Maize;Xinke 910;SSR;Fingerprint;Purity
玉米是世界三大糧食作物之一，我国是玉米生产大国，2012年我国玉米总产量首次超过水稻，成为第一大粮食作物[1]。杂交玉米种子的纯度严重影响着作物的产量和品质，同时也是种子生产和质量管理中最棘手的问题[2]。因此，快速、准确、有效鉴定玉米杂交种的纯度和真实性是十分必要的。传统的玉米种子纯度检测方法有形态鉴定法、幼苗鉴定法、田间小区种植鉴定法等，但存在周期长，易受环境影响、准确性差等不足之处[3]。此外，我国生产使用的玉米自交系主要是塘四平头、旅大红骨、兰卡斯特和瑞德，遗传基础相对狭窄，因此以传统的形态标记鉴别品种日趋困难。随着分子生物学的发展，RFLP、RAPD、AFLP、SSR等分子水平上的技术日趋成熟。其中，SSR标记被广泛应用于农作物遗传、育种种群鉴定、种子纯度检验等研究中[4]。SSR具有快速、准确、信息含量高、呈共显性分离、易于分析、重复可靠等优点[5-7]，在玉米指纹图谱构建、品种真实性鉴定以及纯度检验方面具有明显优势，并成功商业化[8]。
玉米杂交种新科910由河南省新乡市农业科学院选育，2014年5月通过河北省品种审定委员会审定，审定编号为冀审玉2014011。为快速有效鉴定市场流通的新科910种子的真实性和纯度，笔者利用SSR分子标记技术，用60对引物（包括40对核心引物）对新科910及其亲本进行SSR-DNA指纹图谱分析，并将其数字化，计算出现相同指纹图谱的概率，从而筛选出能有效鉴定新科910纯度的引物，以期更准确鉴定和保护该品种提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料和主要试剂 杂交种新科910及其父本H865和母本K381均由河南省新乡市农业科学院玉米课题提供;试验所用60对SSR引物序列信息来自玉米基因组数据库（http：//www.maizegdb.org/ssr.php），并由上海生物工程股份有限公司合成;试验所用DNA聚合酶、dNTP购买于宝生物生物工程（大连）有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 DNA提取。
1.2.1.1 用于构建指纹图谱DNA提取方法。
将新科910及其亲本的玉米种子沙培，于30 ℃光照培养箱中暗培养，待玉米苗长至3叶1心，取叶片混样，用CTAB方法提取总DNA[9]。紫外分光光度计检测DNA的质量和浓度，加水稀释至25 ng/μL，-20 ℃保存备用。
1.2.1.2 检测纯度用DNA提取。
取新科910種子100粒（其中有3粒是人为加入的母本种子）沙培，于30 ℃光照培养箱中暗培养，待玉米苗长至3叶1心时，用CTAB方法提取单株DNA，-20 ℃保存备用。
1.2.2 扩增体系及电泳分析。PCR扩增体系总体积为15 μL，其中dNTPs 0.2 mmol/L，引物0.25 μmol/L和模板DNA 25 ng，加灭菌纯水补足体积。扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃40 s，60 ℃35 s，72 ℃45 s，35个循环，72 ℃延伸10 min。PCR扩增反应在BIOER TC-96/G/H（b）型PCR仪上进行。
扩增产物加入适量上样缓冲液6×Loading Buffer混匀后，各取3.5 μL在8.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色。然后在胶片观测灯上观察电泳结果，采用凝胶成像系统扫描图片或者用相机拍照保存图片。
1.2.3 指纹图谱构建及数字化。筛选SSR产物带型稳定且清晰的引物，构建新科910的指纹图谱。并以1、0统计建立数据库，将新科910指纹图谱数字化。在相同迁移位置（分子量相同片段）有带记为1，无带记为0。根据公式P=1/2n计算相同指纹图谱有可能出现的概率[10-11]，式中2为相同迁移率位点上等位基因存在的“有”或“无”2种关系;n为等位基因的数目;2n为检测n个等位基因时有可能涉及的所有自交系的个数。
1.2.4 种子纯度鉴定。根据构建新科910的指纹图谱，筛选出可用作纯度鉴定的引物，再从中任选1对，用来验证其鉴定纯度的可行性。
根据公式：种子纯度=[（供检测品种种子样本带型数-杂种种子样本带型数）/供检测品种种子样本带型数]×100%，计算样本种子纯度。
2 结果与分析
2.1 SSR引物筛选
从60对用于扩增新科910及其父母本的引物中，筛选出带型稳定清晰、重复性好的引物15对，用于构建新科910的指纹图谱。这15对引物分布于玉米的9条染色体上，共检测出51个等位基因，每对引物可检测出2～6个等位基因，平均3.4个，片段大小为100～400 bp（表1）。
2.2 指纹图谱构建 筛选出的可用于构建新科910指纹图谱的15对引物分别是phi96100y1、umc2105k3、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg161k8、phi299852y2、umc2160k3、umc1125y3、bnlg240k1、umc2084w2、umc1231k4、phi041y6、umc1432y6、umc2163w3，其扩增的主条带为100～400 bp。这15对引物扩出的新科910的主条带均是父本和母本主条带的叠加，这很好地印证了SSR分子标记共显性的遗传特点[12]。部分引物扩增结果如图1。
可用作纯度检测引物有6对，分别是umc1705w1、bnlg2305k4、umc1432y6、umc2084w2、phi041y6、umc2163w3。其中，引物umc1705w1、bnlg2305k4、umc1432y6扩增条带为200～300 bp，条带清晰，片段大小差距较大，可用作新科910纯度鉴定;引物umc2084w2扩增条带为100～200 bp，条带清晰，片段大小差距较大，且父母本均只有1条条带，可用作新科910 bp纯度鉴定;phi041y6和umc2163w3扩出的条带为200～400 bp，条带清晰稳定，片段大小差距较大，且父母本均只有1条主条带，可用作新科910纯度鉴定。
2.3 指纹图谱数字化
将15对引物扩出的片段数字化，分别用1和0表示，由表2可知，新科910及其父母本均由顺序不同的51位数字组成。以父本H865为例，出现与其完全相同数字顺序的概率大约为4.44×10-16（P=1/251），即在大约2.252×1015份材料中只有1份材料与其指纹号码相同，概率极低。所以可以推断这个数字指纹图谱是其特有的。同理，新科910及其母本的数字指纹也是特有的，再一次证明了这15对引物可用于新科910及其父母本真实性鉴定。
2.4 种子纯度鉴定
从6对可用于纯度鉴定的引物中任选1对（umc2084w2）鉴定新科910的纯度，结果见图2。
引物umc2084w2检测新科910的纯度为97.30%。由图2可知，第26泳道条带与母本一致，应该是人为加入的母本种子，这与100粒新科910种子中有3粒人为混入的母本种子的结果（97%）基本相符，说明这些引物对新科910纯度鉴定结果较可信。
3 结语
（1）该研究用分布于玉米10条染色体上的60对引物（包括40对核心引物）对玉米杂交种新科910及其父母本进行SSR分析，筛选出15对引物可用来构建新科910及其父母本的指纹图谱，并将指纹图谱数字化，计算出出现相同指纹图谱的概率为4.44×10-16，概率极低，可以说这15对引物所构建的新科910及其父母本的指纹图谱是特有的，这为杂交种新科910的真实性鉴定提供了参考。 （2）该研究从15对用于构建新科910指纹图谱的引物中，选出6对用于新科910的纯度鉴定。这6对引物所扩出的条带在100～400 bp，在农业部提供的参考标准之内;且条带清晰稳定，片段大小差异较大，适合用作新科910种子纯度鉴定。从这6对引物中随机挑选1对，用来验证其可行性，结果与预期结果相符，证明其可用来鉴定新科910纯度。
（3）SSR标记操作相对简单，可重复性强，可供選择的标记较多，且该技术已相当成熟，被广泛应用在遗传多型性分析、遗传图谱构建、自交系系谱研究、杂交优势群和DNA指纹图谱建立上[10]。该研究利用SSR标记所构建的新科910指纹图谱及纯度鉴定，可操作性强，可适当应用到生产上。
参考文献
[1] 曲志伟.DNA分子标记技术在玉米纯度检测中的应用研究[J].吉林农业，2017（12）：63-64.
[2] 杨俊品.杂交玉米种子DNA指纹图谱鉴定技术[C]//全国农业技术推广服务中心.中国玉米品种科技论坛.北京：中国农业科学技术出版社，2007：300-306.
[3] 孔菲.SSR分子标记在玉米种子纯度鉴定中的应用[J].种子世界，2011（2）：33-34.
[4] PERRY D J.Identification of Canadian durum wheat varieties using a single PCR[J].Theor Appl Genet，2004，109（1）：55-61.
[5] 高文伟，李晓辉，李新海.玉米单粒和单叶片DNA快速提取及SSR标记分析[J].玉米科学，2004，12（2）：111-113.
[6] 李新海，傅骏骅，张世煌，等.利用SSR标记研究玉米自交系的遗传变异[J].中国农业科学，2000，33（2）：1-9.
[7] 王凤格，赵久然，戴景瑞，等.玉米通用SSR核心引物筛选及高通量多重PCR复合扩增体系建立[J].科学通报，2006，51（23）：2738-2746.
[8] 黄进勇，盖树鹏，张恩盈，等.SRAP构建玉米杂交种指纹图谱的研究[J].中国农学通报，2009，25（18）：47-51.
[9] 王关林，方宏筠.植物基因工程[M].2版.北京：科学出版社，2002：744.
[10] 吴渝生，杨文鹏，郑用琏.3个玉米杂交种和亲本SSR指纹图谱的构建[J].作物学报，2003，29（4）：496-500.
[11] Nanjing Agricultural University.Field experiment and statistics[M].2nd ed.Beijing：China Agriculture Press，1998：51-54.
[12] 滕海涛.利用SSR共显性判定玉米杂交组合父本效率分析[J].玉米科学，2009，17（5）：53-54，64.
关键词 玉米;新科910;SSR;指纹图谱;纯度
Abstract We used 60 pairs of primers which distribute on the 10 chromosomes of maize for the SSR analysis of the maize hybrid Xinke 910 and its parents.15 pairs of primers were selected which were clear and good repeatability of their electrophoresis strip to construct the fingerprint of Xinke 910. And we digitized the fingerprint of Xinke 910 to calculate the probability of the same fingerprint，which was 4.44×10-16 and this probability was very low.This explains that it is feasible to identify the authenticity of Xinke910 by the fingerprint which is constructed by the 15 pairs of primers.The 15 pairs of primers were phi96100y1，umc2105k3，bnlg2291k4，umc1705w1，bnlg2305k4，bnlg161k8，phi299852y2，umc2160k3，umc1125y3，bnlg240k1，umc2084w2，umc1231k4，phi041y6，umc1432y6，umc2163w3. There were 6 pairs of primers can be used to identify the purity of Xinke 910 which were umc1705w1，bnlg2305k4，umc1432y6，umc2084w2，phi041y6 and umc2163w3.Among them， we selected 1 pair of primer arbitrary， which was umc2084w2 to identify the purity of Xinke 910，the result was 97.30%， which fit the expected results（97%） basically. Therefore， it was feasible and the results were credible to identify the purity of Xinke 910 by the 6 pairs of primers.
Key words Maize;Xinke 910;SSR;Fingerprint;Purity
玉米是世界三大糧食作物之一，我国是玉米生产大国，2012年我国玉米总产量首次超过水稻，成为第一大粮食作物[1]。杂交玉米种子的纯度严重影响着作物的产量和品质，同时也是种子生产和质量管理中最棘手的问题[2]。因此，快速、准确、有效鉴定玉米杂交种的纯度和真实性是十分必要的。传统的玉米种子纯度检测方法有形态鉴定法、幼苗鉴定法、田间小区种植鉴定法等，但存在周期长，易受环境影响、准确性差等不足之处[3]。此外，我国生产使用的玉米自交系主要是塘四平头、旅大红骨、兰卡斯特和瑞德，遗传基础相对狭窄，因此以传统的形态标记鉴别品种日趋困难。随着分子生物学的发展，RFLP、RAPD、AFLP、SSR等分子水平上的技术日趋成熟。其中，SSR标记被广泛应用于农作物遗传、育种种群鉴定、种子纯度检验等研究中[4]。SSR具有快速、准确、信息含量高、呈共显性分离、易于分析、重复可靠等优点[5-7]，在玉米指纹图谱构建、品种真实性鉴定以及纯度检验方面具有明显优势，并成功商业化[8]。
玉米杂交种新科910由河南省新乡市农业科学院选育，2014年5月通过河北省品种审定委员会审定，审定编号为冀审玉2014011。为快速有效鉴定市场流通的新科910种子的真实性和纯度，笔者利用SSR分子标记技术，用60对引物（包括40对核心引物）对新科910及其亲本进行SSR-DNA指纹图谱分析，并将其数字化，计算出现相同指纹图谱的概率，从而筛选出能有效鉴定新科910纯度的引物，以期更准确鉴定和保护该品种提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料和主要试剂 杂交种新科910及其父本H865和母本K381均由河南省新乡市农业科学院玉米课题提供;试验所用60对SSR引物序列信息来自玉米基因组数据库（http：//www.maizegdb.org/ssr.php），并由上海生物工程股份有限公司合成;试验所用DNA聚合酶、dNTP购买于宝生物生物工程（大连）有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 DNA提取。
1.2.1.1 用于构建指纹图谱DNA提取方法。
将新科910及其亲本的玉米种子沙培，于30 ℃光照培养箱中暗培养，待玉米苗长至3叶1心，取叶片混样，用CTAB方法提取总DNA[9]。紫外分光光度计检测DNA的质量和浓度，加水稀释至25 ng/μL，-20 ℃保存备用。
1.2.1.2 检测纯度用DNA提取。
取新科910種子100粒（其中有3粒是人为加入的母本种子）沙培，于30 ℃光照培养箱中暗培养，待玉米苗长至3叶1心时，用CTAB方法提取单株DNA，-20 ℃保存备用。
1.2.2 扩增体系及电泳分析。PCR扩增体系总体积为15 μL，其中dNTPs 0.2 mmol/L，引物0.25 μmol/L和模板DNA 25 ng，加灭菌纯水补足体积。扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃40 s，60 ℃35 s，72 ℃45 s，35个循环，72 ℃延伸10 min。PCR扩增反应在BIOER TC-96/G/H（b）型PCR仪上进行。
扩增产物加入适量上样缓冲液6×Loading Buffer混匀后，各取3.5 μL在8.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色。然后在胶片观测灯上观察电泳结果，采用凝胶成像系统扫描图片或者用相机拍照保存图片。
1.2.3 指纹图谱构建及数字化。筛选SSR产物带型稳定且清晰的引物，构建新科910的指纹图谱。并以1、0统计建立数据库，将新科910指纹图谱数字化。在相同迁移位置（分子量相同片段）有带记为1，无带记为0。根据公式P=1/2n计算相同指纹图谱有可能出现的概率[10-11]，式中2为相同迁移率位点上等位基因存在的“有”或“无”2种关系;n为等位基因的数目;2n为检测n个等位基因时有可能涉及的所有自交系的个数。
1.2.4 种子纯度鉴定。根据构建新科910的指纹图谱，筛选出可用作纯度鉴定的引物，再从中任选1对，用来验证其鉴定纯度的可行性。
根据公式：种子纯度=[（供检测品种种子样本带型数-杂种种子样本带型数）/供检测品种种子样本带型数]×100%，计算样本种子纯度。
2 结果与分析
2.1 SSR引物筛选
从60对用于扩增新科910及其父母本的引物中，筛选出带型稳定清晰、重复性好的引物15对，用于构建新科910的指纹图谱。这15对引物分布于玉米的9条染色体上，共检测出51个等位基因，每对引物可检测出2～6个等位基因，平均3.4个，片段大小为100～400 bp（表1）。
2.2 指纹图谱构建 筛选出的可用于构建新科910指纹图谱的15对引物分别是phi96100y1、umc2105k3、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg161k8、phi299852y2、umc2160k3、umc1125y3、bnlg240k1、umc2084w2、umc1231k4、phi041y6、umc1432y6、umc2163w3，其扩增的主条带为100～400 bp。这15对引物扩出的新科910的主条带均是父本和母本主条带的叠加，这很好地印证了SSR分子标记共显性的遗传特点[12]。部分引物扩增结果如图1。
可用作纯度检测引物有6对，分别是umc1705w1、bnlg2305k4、umc1432y6、umc2084w2、phi041y6、umc2163w3。其中，引物umc1705w1、bnlg2305k4、umc1432y6扩增条带为200～300 bp，条带清晰，片段大小差距较大，可用作新科910纯度鉴定;引物umc2084w2扩增条带为100～200 bp，条带清晰，片段大小差距较大，且父母本均只有1条条带，可用作新科910 bp纯度鉴定;phi041y6和umc2163w3扩出的条带为200～400 bp，条带清晰稳定，片段大小差距较大，且父母本均只有1条主条带，可用作新科910纯度鉴定。
2.3 指纹图谱数字化
将15对引物扩出的片段数字化，分别用1和0表示，由表2可知，新科910及其父母本均由顺序不同的51位数字组成。以父本H865为例，出现与其完全相同数字顺序的概率大约为4.44×10-16（P=1/251），即在大约2.252×1015份材料中只有1份材料与其指纹号码相同，概率极低。所以可以推断这个数字指纹图谱是其特有的。同理，新科910及其母本的数字指纹也是特有的，再一次证明了这15对引物可用于新科910及其父母本真实性鉴定。
2.4 种子纯度鉴定
从6对可用于纯度鉴定的引物中任选1对（umc2084w2）鉴定新科910的纯度，结果见图2。
引物umc2084w2检测新科910的纯度为97.30%。由图2可知，第26泳道条带与母本一致，应该是人为加入的母本种子，这与100粒新科910种子中有3粒人为混入的母本种子的结果（97%）基本相符，说明这些引物对新科910纯度鉴定结果较可信。
3 结语
（1）该研究用分布于玉米10条染色体上的60对引物（包括40对核心引物）对玉米杂交种新科910及其父母本进行SSR分析，筛选出15对引物可用来构建新科910及其父母本的指纹图谱，并将指纹图谱数字化，计算出出现相同指纹图谱的概率为4.44×10-16，概率极低，可以说这15对引物所构建的新科910及其父母本的指纹图谱是特有的，这为杂交种新科910的真实性鉴定提供了参考。 （2）该研究从15对用于构建新科910指纹图谱的引物中，选出6对用于新科910的纯度鉴定。这6对引物所扩出的条带在100～400 bp，在农业部提供的参考标准之内;且条带清晰稳定，片段大小差异较大，适合用作新科910种子纯度鉴定。从这6对引物中随机挑选1对，用来验证其可行性，结果与预期结果相符，证明其可用来鉴定新科910纯度。
（3）SSR标记操作相对简单，可重复性强，可供選择的标记较多，且该技术已相当成熟，被广泛应用在遗传多型性分析、遗传图谱构建、自交系系谱研究、杂交优势群和DNA指纹图谱建立上[10]。该研究利用SSR标记所构建的新科910指纹图谱及纯度鉴定，可操作性强，可适当应用到生产上。
参考文献
[1] 曲志伟.DNA分子标记技术在玉米纯度检测中的应用研究[J].吉林农业，2017（12）：63-64.
[2] 杨俊品.杂交玉米种子DNA指纹图谱鉴定技术[C]//全国农业技术推广服务中心.中国玉米品种科技论坛.北京：中国农业科学技术出版社，2007：300-306.
[3] 孔菲.SSR分子标记在玉米种子纯度鉴定中的应用[J].种子世界，2011（2）：33-34.
[4] PERRY D J.Identification of Canadian durum wheat varieties using a single PCR[J].Theor Appl Genet，2004，109（1）：55-61.
[5] 高文伟，李晓辉，李新海.玉米单粒和单叶片DNA快速提取及SSR标记分析[J].玉米科学，2004，12（2）：111-113.
[6] 李新海，傅骏骅，张世煌，等.利用SSR标记研究玉米自交系的遗传变异[J].中国农业科学，2000，33（2）：1-9.
[7] 王凤格，赵久然，戴景瑞，等.玉米通用SSR核心引物筛选及高通量多重PCR复合扩增体系建立[J].科学通报，2006，51（23）：2738-2746.
[8] 黄进勇，盖树鹏，张恩盈，等.SRAP构建玉米杂交种指纹图谱的研究[J].中国农学通报，2009，25（18）：47-51.
[9] 王关林，方宏筠.植物基因工程[M].2版.北京：科学出版社，2002：744.
[10] 吴渝生，杨文鹏，郑用琏.3个玉米杂交种和亲本SSR指纹图谱的构建[J].作物学报，2003，29（4）：496-500.
[11] Nanjing Agricultural University.Field experiment and statistics[M].2nd ed.Beijing：China Agriculture Press，1998：51-54.
[12] 滕海涛.利用SSR共显性判定玉米杂交组合父本效率分析[J].玉米科学，2009，17（5）：53-54，64.