【摘 要】
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目的 构建E6AP蛋白结构域突变真核表达载体,并瞬时转染肿瘤细胞,对其生物学功能进行初步检测.方法 以本实验室保存带有myc标签的E6AP质粒为模板,采用PCR技术扩增出E6AP(1~494
【机 构】
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内蒙古医科大学基础医学院,军事医学科学院生物工程研究所,解放军总医院普通外科,神华神东总医院
【基金项目】
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北京市科技新星计划资助项目;国家自然科学基金资助项目
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目的 构建E6AP蛋白结构域突变真核表达载体,并瞬时转染肿瘤细胞,对其生物学功能进行初步检测.方法 以本实验室保存带有myc标签的E6AP质粒为模板,采用PCR技术扩增出E6AP(1~494)结构域和E6AP (495~852)结构域(即E6AP的HECT结构域)编码区(CDS)序列,将其插入到pXJ-40-myc载体中,双酶切和测序验证后瞬时转染人胚肾293 T细胞,通过Western印迹鉴定其表达及功能;转染人乳腺癌细胞ZR75-1和人胃癌细胞BGC-823,通过CCK-8法测定细胞生长曲线. 结果 从E6AP蛋白全长CDS中扩增得到约1479、1071 bp的DNA结构域片段,并成功克隆至pXJ-40-myc载体上,且测序与目的序列完全一致;转染人胚肾293 T细胞后,目的蛋白在细胞内成功表达,并且E6AP(495~852)结构域可明显抑制P53蛋白水平,而E6AP(1~494)结构域无抑制作用;细胞生长曲线结果显示,转染E6AP(495~852)结构域突变质粒的乳腺癌、胃癌细胞较空载体细胞生长差异具有统计学意义,而E6AP(1~494)对细胞生长无明显变化. 结论 成功构建了myc-E6AP(1~494)、(495~852)结构域突变真核表达载体,为进一步研究E6AP蛋白在相关肿瘤发生、发展中的作用奠定一定的基础.
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