论文部分内容阅读
摘 要 采用高速逆流色谱法分离纯化库拉索芦荟中的2’-对香豆酰芦荟宁。以正己烷-乙酸乙酯-丙酮-水（1 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 5，V/V/V/V）为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相，线圈转速为860 r/min，流速为2 mL/min，紫外检测波长为300 nm，一次进样85 min内从487.5 mg库拉索芦荟丙酮提取物中分离得到19.5 mg单体组分，经高效液相色谱分析，测定纯度为95.6%（峰面积百分比），通过质谱、红外、紫外和核磁技术进行结构鉴定，确定组分为2’-对香豆酰芦荟宁。该法具有操作简便、速度快、样品制备量大、节省溶剂及回收率高等优点，可为芦荟宁类化合物的分离提供高效、稳定及可靠的方法。
关键词 高速逆流色谱；库拉索芦荟；2’-对香豆酰芦荟宁；分离纯化
中图分类号 O567；S567.2 文献标识码 A
Isolation and Purification of Aloenin-2’-p-coumaroyl
Ester from Aloe barbadensis Mill by High-speed
Counter-current Chromatography
WU Xiaofang1，2， WAN Jinzhi3 *， ZHONG Jiasheng3， LUO Jinhui1，2， LI Shuhuai1，2， ZHANG Qun1，2
1 Analysis and Testing Center， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China
2 Hainan Provincial Key Laboratory of Quality and Safety for Tropical Fruits and Vegetables， Haikou， Hainan 571101， China
3 School of Pharmaceutical Sciences， Sun Yat-Sen University， Guangzhou， Guangdong 510006， China
Abstract Aloenin-2’-p-coumaroyl ester was separated and purified from Aloe barbadensis Mill by one step of high-speed counter-current chromatography. The separation was performed with an optimized two-phase solvent system composed of hexane-ethyl acetate- acetone-water（1 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 5， V/V/V/V）， using the lower phase as the mobile phase in the head-to-tail elution mode. The revolution speed of the separation column， flow rate of the mobile phase， and UV detection wavelength was 860 rpm， 2.0 mL/min and 300 nm， respectively. In a one-step operation within 85 min， 19.5 mg of aloenin-2’-p-coumaroyl ester could be obtained from 487.5 mg of dried acetone extract at purities of 95.6%， as determined by HPLC using area normalization method. The structure of the compound was identified by high resolution mass spectroscopy（HRMS）， UV， IR and NMR. It is simple， fast and it eliminates the irreversible loss of samples， resulting in a higher recovery and larger scale of products than conventional techniques. This experiment gives an efficient， stable and reliable technique to prepare high pure aloenin nature products.
Key words High-speed counter-current chromatography； Aloe barbadensis Mill； Aloenin-2'-p-coumaroyl ester； Isolation and purification
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.031
高速逆流色谱（HSCCC）是由美国伊藤博士（Ito.Y.）[1]研发的一种高效快速的液液分配色谱技术，无固定相支撑，将作为固定相的溶剂输入离心机的螺旋管里，另一相作为流动相恒速泵入，利用螺旋柱在高速行星运动时产生的一种离心力，使螺旋柱中互不相溶的两相不断混合，其中的样品在两相溶剂体系的混合分离之间不断进行分配，依据分配系数的大小次序被依次洗脱，从而实现分离。相对于传统的柱色谱技术，HSCCC具有适用面广、高效、快速、制备量大及费用低等优点，被广泛应用于生物工程、医药、天然产物、合成及环境等领域[2]。现在HSCCC法正在发展成为一种备受关注的分离纯化技术，向着微型化、联用化、工业化等方向迅速发展。 芦荟是百合科（Liliaceae）芦荟属（Aloe）的多年生常绿肉质草本植物。在芦荟500多类品种中，库拉索芦荟为最常用的药用芦荟，其制品也广泛应用于日用化工、保健食品等多个领域[3]。国内外多采用硅胶柱层析等传统柱色谱分离方法对库拉索芦荟的化学成分已经进行了广泛的研究[4-7]，确定其二级代谢产物主要是色酮类、蒽酮类和吡喃酮类等成分，但分析耗时较长且效率低，不利于单体化合物的大量制备。本课题组经前期研究发现，2’-对香豆酰芦荟宁是库拉索芦荟药材中含量最高的吡喃酮类化合物[8]。关于该化合物的药理作用目前尚未见报道，为了给该化合物后期的药效研究提供高纯度的单体化合物，本课题组[9]曾报道过同时制备芦荟苷、异芦荟色苷D和2’-对香豆酰芦荟宁的高速逆流色谱法，但此法制备分离2’-对香豆酰芦荟宁的时间长达250 min。本研究直接针对2’-对香豆酰芦荟宁，采用高速逆流色谱法，通过优化溶剂体系，在短时间内制备出高纯度的单体化合物，为大规模制备2’-对香豆酰芦荟宁提供更为便捷的方法，也为HSCCC分离相似的化合物提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品 库拉索芦荟药材粉由云南元江万绿生物有限公司提供，批号：20120301，并经中山大学药学院徐新军副教授鉴定。
1.1.2 仪器 MK5 QuilkPrep500高速逆流色谱仪（英国AECS公司；配有SSI series II 恒流泵，岛津SPD-10AVP检测器，N2000数据工作站，BS-100A自动馏分收集器，10 mL定量环，四组聚四氟乙烯线圈：管直径2.16 mm，β值为0.5～0.8，总体积为450 mL，使用体积为115 mL），LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司，配有二极管阵列检测器DAD），高效液相色谱/电喷雾-离子阱-飞行时间质谱（日本岛津公司），Tensor 37型傅立叶变换红外光谱仪（德国Bruker公司），Bruker Avance AV 400核磁共振波谱仪（德国Bruker公司），AB135-S型十万分之一天平（瑞士梅特勒公司），RE3000B旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），SB25-12D型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。
1.1.3 试剂 自填充制备色谱柱（日本富士硅化工有限公司；柱填料为Chromatorex SMB ODS，300 mm×20 mm，20～40 μm），氘代甲醇和氘代吡啶（美国Sigma-Aldrich公司），甲醇（色谱纯，美国Honeywell Burdick & Jackson公司），甲醇（分析纯，天津大茂化学试剂厂），乙醇（工业纯，天津大茂化学试剂厂），怡宝纯净水（怡宝食品饮料有限公司），二级蒸馏水。
1.2 方法
1.2.1 样品处理
（1）库拉索芦荟粗提物的制备。称取100.0 g干燥的库拉索芦荟药材粉末，置于1 000 mL 烧杯中，加入500 mL丙酮，搅匀，超声30 min后离心，重复操作5次，收集上层清液，于旋转蒸发仪60 ℃回收溶剂，所得浸膏于真空干燥箱40 ℃减压干燥，得到棕色有光泽的库拉索芦荟丙酮粗提物粉末，密封保存在4 ℃中，备用。
（2）HPLC分析样品的制备。为了减少丙酮等溶剂对色谱峰的影响，将HSCCC收集的馏分蒸干溶剂后，重新加入50%甲醇-水复溶，经0.45 μm的微孔滤膜滤过，滤液用于HPLC纯度分析。
1.2.2 分离溶剂系统的选择 良好溶剂系统的选择，是实现HSCCC 制备分离的关键因素。两相溶剂系统合适与否是由样品中各组分在其中的分配系数以及固定相的保留率来衡量，一般认为分配系数K在0.5～2.0的范围内是比较合适，并且各组分的分配系数数值要有足够差异，分离因子最好大于或等于1.5，固定相保留率在50%以上[1]。采用 HPLC 测定样品中目标化合物在溶剂体系中的分配系数（K值），测定过程：称取约2 mg库拉索芦荟药材粗提物置于10 mL试管中，加入预先达到分配平衡的两相溶剂系统的上下相溶液各2 mL溶解样品，剧烈振荡，静置，使其充分溶解，待两相达到分配平衡后，分别取等体积的上相、下相溶液（各1 mL），蒸干溶剂后，重新用等体积50%甲醇-水溶解，按2.4项下色谱条件，采用 HPLC 法测定上、下层所含目标成分的浓度，即可求得目标成分在该溶剂系统中的分配系数。结合前期研究成果和实验积累的经验[9]，选择正己烷-乙酸乙酯-丙酮-水（1 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 5，V/V/V/V）溶剂系统，配制一定量的两相溶剂，静置分层。
1.2.3 HSCCC的分离制备 两相溶剂系统采用正己烷-乙酸乙酯-丙酮-水（1 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 5，V/V/V/V），采用单线圈、头接尾的洗脱方式，上相作为固定相，固定相溶液以 8.0 mL/min的流速泵入HSCCC螺旋管中，当螺旋管完全充满后，主机正转，调节线圈转速为860 r/min，下相作为流动相以2 mL/min流速泵入螺旋管中。待流动相流出，两相溶剂在柱中达到分配平衡状态，此时测量被流动相推出的固定相体积V出，按下式计算固定相保留率（固定相保留率ρ必须>40%，否则该溶剂系统不适用）。取487.5 mg库拉索芦荟粗提物样品溶于等体积的上下相中（共8 mL），超声助溶，经0.45 μm微孔滤膜过滤，作为HSCCC进样样品，通过六通阀进样。采用紫外检测器对馏分进行检测，检测波长为300 nm，同时记录色谱图，自动馏分收集器根据色谱图自动收集馏分，每2 min收集一管，采用HPLC峰面积归一化法测定峰纯度，根据HSCCC色谱图和HPLC-DAD纯度分析结果合并相同纯度的同一组分，干燥后保存在4 ℃中，备用。
（2）HSCCC分离峰组分的鉴别。HSCCC分离峰组分通过紫外（UV）、红外（IR）、高分辨率质谱（HRMS）和核磁（NMR）技术进行结构鉴定。干燥的HSCCC峰馏分溶于甲醇后经HPLC-DAD（200～800 nm）扫描化合物的紫外最大吸收波长。取1～2 mg干燥的HSCCC的峰组分与KBr压制成片，经傅里叶红外光谱仪检测化合物的IR光谱。将HSCCC收集的峰馏分蒸干溶剂后，重新加入50%甲醇-水复溶，经0.45 μm的微孔滤膜滤过，滤液用于高HRMS分析，HRMS质谱检测采用电喷雾（ESI源）离子源，采用负离子化模式检测，负离子模式喷雾电压为 -3.5 kV，母离子根据离子强度自动选择，MS的质量范围为m/z 100～1 000，曲形脱溶剂管（CDL）温度为200 ℃，飞行管电压为-7.0 kV，加热模块（BH）温度为200 ℃，检测器电压为1.56 kV。取约20 mg干燥的HSCCC组分溶于0.5 mL的氘代甲醇中，用于化合物的1H和13C核磁分析。 2 结果与分析
2.1 HSCCC分离结果
在本试验所建立的最佳色谱条件下，固定相保留率为73.9%，进样487.5 mg进行分离，分离85 min，HSCCC 图谱见图1。收集峰60～78 min处对应的流出液，减压浓缩，50 ℃减压干燥，得到19.5 mg的化合物。
2.2 结构鉴定与纯度测定
2.2.1 HSCCC分离峰的结构分析 HSCCC分离峰获得的单体化合物为淡黄色无定型粉末，分子式为C28H28O12，HRMS（ESI） m/z：555.153 8[M-H]-（计算值555.150 8），见图2；采用HPLC-DAD联用技术，观察到UV λmax nm：205，225，311，说明化合物有较长的共轭系统，见图7；IR（KBr）νmax cm-1：3 384，1 698，1 690，1 635，1 604，1 559，见图3；NMR数据见表1、图4及图5，1H-NMR显示一套AA′BB′系统的氢信号[δH 7.47（2H，d，J=8.5 Hz， H-5″，H-9″），6.82（2H，d，J=8.5 Hz， H-6″，H-8″）]，以及一对反式双键氢信号[δH 7.56（1H， d， J=16.0 Hz， H-3″），6.24（1H， d， J=16.0 Hz， H-2″）]，结合13C-NMR谱显示的羰基碳信号 δC 168.4（C-1″）推测分子结构中存在1个反式香豆酰基团。同时，NMR还显示1个β-D-葡萄糖信号[1个芳香氢信号δH 5.06（d， J=8.0 Hz， H-1″）；6个次甲基信号δC 100.9，76.2，74.5，
71.5，78.5和62.6]，推测该化合物是1个β-D-葡萄糖苷；另外，NMR还提示该化合物为芦荟宁衍生物[1H-NMR谱中两对间位偶合的氢信号δH 6.62（1H， d， J=2.0 Hz， H-9）， 6.40（1H， d， J=2.0 Hz， H-11），5.98（1H， d， J=2.2 Hz， H-5），5.54（1H，d， J=2.2 Hz， H-3）；13C-NMR谱中1个羰基碳信号（δC 167.9）和10个芳碳信号（δC 89.3， 173.7， 106.7， 158.8， 115.1， 158.1， 101.6， 161.4， 112.4， 141.1）]。此结果与文献报道的基本一致[4]；确定分离峰的目标化合物为2’-对香豆酰芦荟宁（aloenin-2’-p-coumaroyl ester），为芦荟宁类代谢产物。结构式见图6。
2.2.2 HPLC纯度分析结果 采用HPLC-DAD检测分离峰纯度（2’-对香豆酰芦荟宁），经峰面积归一化法[10-12]，计算可知2’-对香豆酰芦荟宁纯度为95.6%，HPLC色谱图（检测波长为300 nm）和HPLC三维光谱图见图7。
3 讨论与结论
应用高速逆流色谱法从库拉索芦荟中分离提纯芦荟宁类代谢产物的文献报道甚少。前期报道文献中芦荟宁类化合物一直是经有机溶剂反复提取和柱层析的梯度洗脱才能得到纯度较高的化合物[4-7]，对于植物中微量有效成分来说，柱层析方法成本较高，步骤繁琐，耗时长。本研究采用HSCCC技术，首次在85 min内快速制备得到纯度为95.6%的单体成分2’-对香豆酰芦荟宁，该法制备量大、分离能力强，且用时短，比本课题组曾报道过分离2’-对香豆酰芦荟宁的HSCCC法时间更短，为大规模制备2’-对香豆酰芦荟宁提供更为便捷的方法，也为HSCCC分离相似的化合物提供实施例和可参考的技术，分离得到的化合物可应用于药理活性等相关研究。
参考文献
[1] Ito Y. Golden Rules and Pitfalls in Selecting Optimum Conditions for High-Speed Counter-Current Chromatography[J]. J Chromatogr A， 2005， 1065（2）： 145-168.
[2] 曹学丽. 高速逆流色谱分离技术及应用[M]. 北京： 化学工业出版社， 2005.
[3] Eshun K， He Q. Aloe vera： a valuable ingredient for the food， pharmaceutical and cosmetic industries-a review[J]. Crit Rev Food Sci Nutr， 2004， 44（2）： 91-96.
[4] Durì L， Morelli C F， Crippa S， et al. 6-Phenylpyrones and 5-methylchromones from Kenya aloe[J]. Fitoterapia， 2004， 75（5）： 520-522.
[5] Speranza G， Dadá G， Lunazzi L， et al. Aloenin B， a new diglucosylated 6-phenyl-2-pyrone from Kenya Aloe[J]. J Nat Prod， 1986， 49（5）： 800-805.
[6] Woo W S， Shin K H， Chung H S， et al. Isolation of an unusual aloenin-acetal from Aloe arborescens[J]. Korean J. Pharmacogn， 1987， 25： 307-309.
[7] Suga T， Hirata T， Odan M. Aloenin， a new bitter glucoside from aloe species[J]. Chem Lett， 1972， 1（7）： 547-550.
[8] Wu X F， Ding W J， Zhong J S， et al. Simultaneous qualitative and quantitative determination of phenolic compounds in Aloe barbadensis Mill by liquid chromatography-mass spectrometry-ion trap-time-of-flight and high performance liquid chromatography-diode array detector[J]. J Pharmaceut Biomed， 2013， 80： 94-106.
[9] Wu X F， Zhong J S， Xie Z Y， et al. Isolation and purification of aloin， isoaloeresin d AND aloenin-2′-p-coumaroyl ester from Aloe barbadensis mill by high-speed counter-current chromatography[J]. J Liq Chromatoag R T， 2013， 36（18）： 2 589-2 600.
[10] 陈月蛾. 高速逆流色谱法分离制备丹参药材中丹参酚酸B成分[J]. 南方医科大学学报， 2007， 27（7）： 1 097-1 099.
[11] 牛丹丹， 刘彩霞， 刘绣华， 等. 高速逆流色谱法分离制备花生壳中的黄酮类化合物[J]. 天然产物研究与开发， 2011， 23（1）： 110-113.
[12] 刘 钫， 陈卫平， 李清娟， 等. 高速逆流色谱法从多花蒿中分离制备阿格拉宾[J]. 现代药物与临床， 2012， 27（4）： 363-365.
关键词 高速逆流色谱；库拉索芦荟；2’-对香豆酰芦荟宁；分离纯化
中图分类号 O567；S567.2 文献标识码 A
Isolation and Purification of Aloenin-2’-p-coumaroyl
Ester from Aloe barbadensis Mill by High-speed
Counter-current Chromatography
WU Xiaofang1，2， WAN Jinzhi3 *， ZHONG Jiasheng3， LUO Jinhui1，2， LI Shuhuai1，2， ZHANG Qun1，2
1 Analysis and Testing Center， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China
2 Hainan Provincial Key Laboratory of Quality and Safety for Tropical Fruits and Vegetables， Haikou， Hainan 571101， China
3 School of Pharmaceutical Sciences， Sun Yat-Sen University， Guangzhou， Guangdong 510006， China
Abstract Aloenin-2’-p-coumaroyl ester was separated and purified from Aloe barbadensis Mill by one step of high-speed counter-current chromatography. The separation was performed with an optimized two-phase solvent system composed of hexane-ethyl acetate- acetone-water（1 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 5， V/V/V/V）， using the lower phase as the mobile phase in the head-to-tail elution mode. The revolution speed of the separation column， flow rate of the mobile phase， and UV detection wavelength was 860 rpm， 2.0 mL/min and 300 nm， respectively. In a one-step operation within 85 min， 19.5 mg of aloenin-2’-p-coumaroyl ester could be obtained from 487.5 mg of dried acetone extract at purities of 95.6%， as determined by HPLC using area normalization method. The structure of the compound was identified by high resolution mass spectroscopy（HRMS）， UV， IR and NMR. It is simple， fast and it eliminates the irreversible loss of samples， resulting in a higher recovery and larger scale of products than conventional techniques. This experiment gives an efficient， stable and reliable technique to prepare high pure aloenin nature products.
Key words High-speed counter-current chromatography； Aloe barbadensis Mill； Aloenin-2'-p-coumaroyl ester； Isolation and purification
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.031
高速逆流色谱（HSCCC）是由美国伊藤博士（Ito.Y.）[1]研发的一种高效快速的液液分配色谱技术，无固定相支撑，将作为固定相的溶剂输入离心机的螺旋管里，另一相作为流动相恒速泵入，利用螺旋柱在高速行星运动时产生的一种离心力，使螺旋柱中互不相溶的两相不断混合，其中的样品在两相溶剂体系的混合分离之间不断进行分配，依据分配系数的大小次序被依次洗脱，从而实现分离。相对于传统的柱色谱技术，HSCCC具有适用面广、高效、快速、制备量大及费用低等优点，被广泛应用于生物工程、医药、天然产物、合成及环境等领域[2]。现在HSCCC法正在发展成为一种备受关注的分离纯化技术，向着微型化、联用化、工业化等方向迅速发展。 芦荟是百合科（Liliaceae）芦荟属（Aloe）的多年生常绿肉质草本植物。在芦荟500多类品种中，库拉索芦荟为最常用的药用芦荟，其制品也广泛应用于日用化工、保健食品等多个领域[3]。国内外多采用硅胶柱层析等传统柱色谱分离方法对库拉索芦荟的化学成分已经进行了广泛的研究[4-7]，确定其二级代谢产物主要是色酮类、蒽酮类和吡喃酮类等成分，但分析耗时较长且效率低，不利于单体化合物的大量制备。本课题组经前期研究发现，2’-对香豆酰芦荟宁是库拉索芦荟药材中含量最高的吡喃酮类化合物[8]。关于该化合物的药理作用目前尚未见报道，为了给该化合物后期的药效研究提供高纯度的单体化合物，本课题组[9]曾报道过同时制备芦荟苷、异芦荟色苷D和2’-对香豆酰芦荟宁的高速逆流色谱法，但此法制备分离2’-对香豆酰芦荟宁的时间长达250 min。本研究直接针对2’-对香豆酰芦荟宁，采用高速逆流色谱法，通过优化溶剂体系，在短时间内制备出高纯度的单体化合物，为大规模制备2’-对香豆酰芦荟宁提供更为便捷的方法，也为HSCCC分离相似的化合物提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品 库拉索芦荟药材粉由云南元江万绿生物有限公司提供，批号：20120301，并经中山大学药学院徐新军副教授鉴定。
1.1.2 仪器 MK5 QuilkPrep500高速逆流色谱仪（英国AECS公司；配有SSI series II 恒流泵，岛津SPD-10AVP检测器，N2000数据工作站，BS-100A自动馏分收集器，10 mL定量环，四组聚四氟乙烯线圈：管直径2.16 mm，β值为0.5～0.8，总体积为450 mL，使用体积为115 mL），LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司，配有二极管阵列检测器DAD），高效液相色谱/电喷雾-离子阱-飞行时间质谱（日本岛津公司），Tensor 37型傅立叶变换红外光谱仪（德国Bruker公司），Bruker Avance AV 400核磁共振波谱仪（德国Bruker公司），AB135-S型十万分之一天平（瑞士梅特勒公司），RE3000B旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），SB25-12D型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。
1.1.3 试剂 自填充制备色谱柱（日本富士硅化工有限公司；柱填料为Chromatorex SMB ODS，300 mm×20 mm，20～40 μm），氘代甲醇和氘代吡啶（美国Sigma-Aldrich公司），甲醇（色谱纯，美国Honeywell Burdick & Jackson公司），甲醇（分析纯，天津大茂化学试剂厂），乙醇（工业纯，天津大茂化学试剂厂），怡宝纯净水（怡宝食品饮料有限公司），二级蒸馏水。
1.2 方法
1.2.1 样品处理
（1）库拉索芦荟粗提物的制备。称取100.0 g干燥的库拉索芦荟药材粉末，置于1 000 mL 烧杯中，加入500 mL丙酮，搅匀，超声30 min后离心，重复操作5次，收集上层清液，于旋转蒸发仪60 ℃回收溶剂，所得浸膏于真空干燥箱40 ℃减压干燥，得到棕色有光泽的库拉索芦荟丙酮粗提物粉末，密封保存在4 ℃中，备用。
（2）HPLC分析样品的制备。为了减少丙酮等溶剂对色谱峰的影响，将HSCCC收集的馏分蒸干溶剂后，重新加入50%甲醇-水复溶，经0.45 μm的微孔滤膜滤过，滤液用于HPLC纯度分析。
1.2.2 分离溶剂系统的选择 良好溶剂系统的选择，是实现HSCCC 制备分离的关键因素。两相溶剂系统合适与否是由样品中各组分在其中的分配系数以及固定相的保留率来衡量，一般认为分配系数K在0.5～2.0的范围内是比较合适，并且各组分的分配系数数值要有足够差异，分离因子最好大于或等于1.5，固定相保留率在50%以上[1]。采用 HPLC 测定样品中目标化合物在溶剂体系中的分配系数（K值），测定过程：称取约2 mg库拉索芦荟药材粗提物置于10 mL试管中，加入预先达到分配平衡的两相溶剂系统的上下相溶液各2 mL溶解样品，剧烈振荡，静置，使其充分溶解，待两相达到分配平衡后，分别取等体积的上相、下相溶液（各1 mL），蒸干溶剂后，重新用等体积50%甲醇-水溶解，按2.4项下色谱条件，采用 HPLC 法测定上、下层所含目标成分的浓度，即可求得目标成分在该溶剂系统中的分配系数。结合前期研究成果和实验积累的经验[9]，选择正己烷-乙酸乙酯-丙酮-水（1 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 5，V/V/V/V）溶剂系统，配制一定量的两相溶剂，静置分层。
1.2.3 HSCCC的分离制备 两相溶剂系统采用正己烷-乙酸乙酯-丙酮-水（1 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 5，V/V/V/V），采用单线圈、头接尾的洗脱方式，上相作为固定相，固定相溶液以 8.0 mL/min的流速泵入HSCCC螺旋管中，当螺旋管完全充满后，主机正转，调节线圈转速为860 r/min，下相作为流动相以2 mL/min流速泵入螺旋管中。待流动相流出，两相溶剂在柱中达到分配平衡状态，此时测量被流动相推出的固定相体积V出，按下式计算固定相保留率（固定相保留率ρ必须>40%，否则该溶剂系统不适用）。取487.5 mg库拉索芦荟粗提物样品溶于等体积的上下相中（共8 mL），超声助溶，经0.45 μm微孔滤膜过滤，作为HSCCC进样样品，通过六通阀进样。采用紫外检测器对馏分进行检测，检测波长为300 nm，同时记录色谱图，自动馏分收集器根据色谱图自动收集馏分，每2 min收集一管，采用HPLC峰面积归一化法测定峰纯度，根据HSCCC色谱图和HPLC-DAD纯度分析结果合并相同纯度的同一组分，干燥后保存在4 ℃中，备用。
（2）HSCCC分离峰组分的鉴别。HSCCC分离峰组分通过紫外（UV）、红外（IR）、高分辨率质谱（HRMS）和核磁（NMR）技术进行结构鉴定。干燥的HSCCC峰馏分溶于甲醇后经HPLC-DAD（200～800 nm）扫描化合物的紫外最大吸收波长。取1～2 mg干燥的HSCCC的峰组分与KBr压制成片，经傅里叶红外光谱仪检测化合物的IR光谱。将HSCCC收集的峰馏分蒸干溶剂后，重新加入50%甲醇-水复溶，经0.45 μm的微孔滤膜滤过，滤液用于高HRMS分析，HRMS质谱检测采用电喷雾（ESI源）离子源，采用负离子化模式检测，负离子模式喷雾电压为 -3.5 kV，母离子根据离子强度自动选择，MS的质量范围为m/z 100～1 000，曲形脱溶剂管（CDL）温度为200 ℃，飞行管电压为-7.0 kV，加热模块（BH）温度为200 ℃，检测器电压为1.56 kV。取约20 mg干燥的HSCCC组分溶于0.5 mL的氘代甲醇中，用于化合物的1H和13C核磁分析。 2 结果与分析
2.1 HSCCC分离结果
在本试验所建立的最佳色谱条件下，固定相保留率为73.9%，进样487.5 mg进行分离，分离85 min，HSCCC 图谱见图1。收集峰60～78 min处对应的流出液，减压浓缩，50 ℃减压干燥，得到19.5 mg的化合物。
2.2 结构鉴定与纯度测定
2.2.1 HSCCC分离峰的结构分析 HSCCC分离峰获得的单体化合物为淡黄色无定型粉末，分子式为C28H28O12，HRMS（ESI） m/z：555.153 8[M-H]-（计算值555.150 8），见图2；采用HPLC-DAD联用技术，观察到UV λmax nm：205，225，311，说明化合物有较长的共轭系统，见图7；IR（KBr）νmax cm-1：3 384，1 698，1 690，1 635，1 604，1 559，见图3；NMR数据见表1、图4及图5，1H-NMR显示一套AA′BB′系统的氢信号[δH 7.47（2H，d，J=8.5 Hz， H-5″，H-9″），6.82（2H，d，J=8.5 Hz， H-6″，H-8″）]，以及一对反式双键氢信号[δH 7.56（1H， d， J=16.0 Hz， H-3″），6.24（1H， d， J=16.0 Hz， H-2″）]，结合13C-NMR谱显示的羰基碳信号 δC 168.4（C-1″）推测分子结构中存在1个反式香豆酰基团。同时，NMR还显示1个β-D-葡萄糖信号[1个芳香氢信号δH 5.06（d， J=8.0 Hz， H-1″）；6个次甲基信号δC 100.9，76.2，74.5，
71.5，78.5和62.6]，推测该化合物是1个β-D-葡萄糖苷；另外，NMR还提示该化合物为芦荟宁衍生物[1H-NMR谱中两对间位偶合的氢信号δH 6.62（1H， d， J=2.0 Hz， H-9）， 6.40（1H， d， J=2.0 Hz， H-11），5.98（1H， d， J=2.2 Hz， H-5），5.54（1H，d， J=2.2 Hz， H-3）；13C-NMR谱中1个羰基碳信号（δC 167.9）和10个芳碳信号（δC 89.3， 173.7， 106.7， 158.8， 115.1， 158.1， 101.6， 161.4， 112.4， 141.1）]。此结果与文献报道的基本一致[4]；确定分离峰的目标化合物为2’-对香豆酰芦荟宁（aloenin-2’-p-coumaroyl ester），为芦荟宁类代谢产物。结构式见图6。
2.2.2 HPLC纯度分析结果 采用HPLC-DAD检测分离峰纯度（2’-对香豆酰芦荟宁），经峰面积归一化法[10-12]，计算可知2’-对香豆酰芦荟宁纯度为95.6%，HPLC色谱图（检测波长为300 nm）和HPLC三维光谱图见图7。
3 讨论与结论
应用高速逆流色谱法从库拉索芦荟中分离提纯芦荟宁类代谢产物的文献报道甚少。前期报道文献中芦荟宁类化合物一直是经有机溶剂反复提取和柱层析的梯度洗脱才能得到纯度较高的化合物[4-7]，对于植物中微量有效成分来说，柱层析方法成本较高，步骤繁琐，耗时长。本研究采用HSCCC技术，首次在85 min内快速制备得到纯度为95.6%的单体成分2’-对香豆酰芦荟宁，该法制备量大、分离能力强，且用时短，比本课题组曾报道过分离2’-对香豆酰芦荟宁的HSCCC法时间更短，为大规模制备2’-对香豆酰芦荟宁提供更为便捷的方法，也为HSCCC分离相似的化合物提供实施例和可参考的技术，分离得到的化合物可应用于药理活性等相关研究。
参考文献
[1] Ito Y. Golden Rules and Pitfalls in Selecting Optimum Conditions for High-Speed Counter-Current Chromatography[J]. J Chromatogr A， 2005， 1065（2）： 145-168.
[2] 曹学丽. 高速逆流色谱分离技术及应用[M]. 北京： 化学工业出版社， 2005.
[3] Eshun K， He Q. Aloe vera： a valuable ingredient for the food， pharmaceutical and cosmetic industries-a review[J]. Crit Rev Food Sci Nutr， 2004， 44（2）： 91-96.
[4] Durì L， Morelli C F， Crippa S， et al. 6-Phenylpyrones and 5-methylchromones from Kenya aloe[J]. Fitoterapia， 2004， 75（5）： 520-522.
[5] Speranza G， Dadá G， Lunazzi L， et al. Aloenin B， a new diglucosylated 6-phenyl-2-pyrone from Kenya Aloe[J]. J Nat Prod， 1986， 49（5）： 800-805.
[6] Woo W S， Shin K H， Chung H S， et al. Isolation of an unusual aloenin-acetal from Aloe arborescens[J]. Korean J. Pharmacogn， 1987， 25： 307-309.
[7] Suga T， Hirata T， Odan M. Aloenin， a new bitter glucoside from aloe species[J]. Chem Lett， 1972， 1（7）： 547-550.
[8] Wu X F， Ding W J， Zhong J S， et al. Simultaneous qualitative and quantitative determination of phenolic compounds in Aloe barbadensis Mill by liquid chromatography-mass spectrometry-ion trap-time-of-flight and high performance liquid chromatography-diode array detector[J]. J Pharmaceut Biomed， 2013， 80： 94-106.
[9] Wu X F， Zhong J S， Xie Z Y， et al. Isolation and purification of aloin， isoaloeresin d AND aloenin-2′-p-coumaroyl ester from Aloe barbadensis mill by high-speed counter-current chromatography[J]. J Liq Chromatoag R T， 2013， 36（18）： 2 589-2 600.
[10] 陈月蛾. 高速逆流色谱法分离制备丹参药材中丹参酚酸B成分[J]. 南方医科大学学报， 2007， 27（7）： 1 097-1 099.
[11] 牛丹丹， 刘彩霞， 刘绣华， 等. 高速逆流色谱法分离制备花生壳中的黄酮类化合物[J]. 天然产物研究与开发， 2011， 23（1）： 110-113.
[12] 刘 钫， 陈卫平， 李清娟， 等. 高速逆流色谱法从多花蒿中分离制备阿格拉宾[J]. 现代药物与临床， 2012， 27（4）： 363-365.